宋雨萌，劉文杰，戶喜朝，袁忠林，羅 蘭

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院·山東省植物病蟲害綠色防控工程研究中心 山東青島 266109）

大白菜（Brassica rapavar.pekinensis）是我國重要的大眾蔬菜，味道鮮美、營養(yǎng)豐富，在我國廣泛種植，其栽培面積和產(chǎn)量居世界首位[1-2]。大白菜因其含有各種維生素、礦物質(zhì)和纖維素，而具有保健作用[3]。然而，大白菜在生產(chǎn)過程中易受植物病原菌的侵染造成嚴(yán)重的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)損失[4-5]，其中，大白菜枯萎病是由鐮刀菌侵染引起的維管束病害，因其病原菌種類多且寄主廣泛而危害嚴(yán)重，全國各地均有發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)發(fā)病率在80%以上，造成植株大量死亡[6-8]，因此對(duì)大白菜枯萎病防治技術(shù)的研究尤為重要。

目前大白菜枯萎病的防治，以化學(xué)殺菌劑防治為主，采用抗耐病品種和田間輪作的農(nóng)業(yè)措施為輔?；瘜W(xué)殺菌劑雖然可以有效控制枯萎病的發(fā)生，但長期大量應(yīng)用易造成農(nóng)藥殘留、食品安全以及環(huán)境安全等問題[9-10]。開發(fā)對(duì)環(huán)境友好和誘導(dǎo)植株產(chǎn)生抗病性的生物防治方法具有廣闊的應(yīng)用前景。其中木霉菌（Trichoderma）廣泛分布于土壤和根際生態(tài)系統(tǒng)，對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)[11]。前人研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲[12]、水稻紋枯病[13]、苦瓜枯萎病[14]、番茄枯萎病[15]和草莓灰霉病[16]具有良好的防治效果，同時(shí)還具有促進(jìn)番茄和黃瓜生長的作用[17-19]。然而未見木霉菌對(duì)大白菜枯萎病的防效報(bào)道。筆者從山東省青島市膠州市大白菜田中分離獲得木霉菌株，采用離體和盆栽方法測定木霉菌對(duì)大白菜枯萎病的拮抗作用與防治效果，以期為該病害的生物防治提供更多優(yōu)質(zhì)的菌種資源，為開展綠色防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：大白菜枯萎病菌（Fusarium oxysporum），編號(hào)分別為BCFG1 和BCFG2。木霉菌株的編號(hào)分別為2019-1、2020-2、2020-5、2020-6、2020-7、2021-1、2021-2、2021-3 和2021-4，共9 株，分離于大白菜根際。以上菌株由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院農(nóng)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆?。供試藥劑?×108CFU·g-1哈茨木霉可濕性粉劑，為美國拜沃股份有限公司產(chǎn)品。

供試大白菜品種：精品膠白一號(hào)，由青島市膠州市大白菜研究所育成，為中晚熟一代雜種，抗病、豐產(chǎn)、整齊、球形好，風(fēng)味品質(zhì)優(yōu)、口感好、可密植、耐貯運(yùn)。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15～20 g、蒸餾水1000 mL，用于拮抗木霉菌的篩選。麥粒培養(yǎng)基：麥粒50 g、蒸餾水100 mL 浸泡24 h 后滅菌，用于枯萎病菌和木霉菌孢子的培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 木霉菌對(duì)大白菜枯萎病的離體抑菌活性測定 試驗(yàn)于2021 年5-9 月在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院農(nóng)藥毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。采用平板對(duì)峙法測定木霉菌對(duì)大白菜枯萎病菌的拮抗作用[20]。將直徑5 mm 的木霉菌菌餅放置于PDA 平板中距離中心點(diǎn)2.5 cm 的一端，在另一側(cè)距離中心點(diǎn)2.5 cm處放置相同大小的大白菜枯萎病菌菌餅，以無菌空白PDA 菌餅作為對(duì)照，3 次重復(fù)，放于28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d 后，采用十字交叉法測量對(duì)照組和處理組大白菜枯萎病菌菌落半徑并計(jì)算抑菌率。

采用平板倒扣法測定木霉菌對(duì)大白菜枯萎病菌的熏蒸作用[21]。將直徑5 mm 木霉菌菌餅接于PDA 平板中央，另一平板中央接相同大小的大白菜枯萎病菌菌餅，將兩平板對(duì)扣，木霉平板在下方，封口膜密封。以接種大白菜枯萎菌而不接木霉菌的平板倒扣作空白對(duì)照。3 次重復(fù)，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d 后，采用十字交叉測量各處理的大白菜枯萎病菌菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

1.2.2 拮抗木霉菌株的鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：將拮抗作用較好的菌株分別接種到PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察各菌株菌落形態(tài)特征。待產(chǎn)生孢子后，在顯微鏡下觀察其形態(tài)特征，參照相關(guān)文獻(xiàn)資料[22]進(jìn)行分類學(xué)鑒定，初步明確病原菌的分類地位。

分子生物學(xué)鑒定：分別提取木霉菌株的DNA，采用真菌的通用引物（ITS1 和ITS4）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[23]。采用25 μL PCR 反應(yīng)體系：ddH2O 17.25 μL、10×EasyTaqBuffer 2.5 μL、dNTPs（2.5 mmol·L-1）2 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、DNA 1 μL、EasyTaqDNA Polymerase 0.25 μL。反 應(yīng) 程 序：94 ℃3 min；94 ℃45 s，58 ℃45 s，72 ℃40 s，34 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由上海生工生物工程有限公司測序，以測得序列為索引，在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast 比對(duì)分析。選擇同源性較高的序列用MEGA 軟件的UPGMA 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的分類地位。

1.2.3 拮抗木霉菌對(duì)大白菜枯萎病的盆栽防效

采用灌根的盆栽法測定木霉菌發(fā)酵液對(duì)大白菜枯萎病的防治效果[24]。試驗(yàn)于2021 年8—11 月在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，溫度（25±1）℃，相對(duì)濕度60%～70%，光照周期為16 h 光照/8 h 黑暗。用250 mL錐形瓶麥粒培養(yǎng)基分別培養(yǎng)病原菌BCGF1、BCGF2 和木霉菌株2019-1 和2021-2。待其產(chǎn)孢后，用滅菌水配成孢子懸浮液。采用灌根法按每杯接入10 mL 濃度105CFU·g-1土孢子液（BCGF1 和BCGF2 各5 mL）培育1 d 后，選取大小一致，健康正常的具有2 片真葉的白菜幼苗按1 株/杯移栽至接種致病菌的直徑7.0 cm 高度7.5 cm 太空杯中，用孢子濃度為108CFU·mL-1的菌株2019-1 和2021-2 發(fā)酵液按每杯10 mL 灌根，以微生物殺菌劑哈茨木霉WP200 倍液為藥劑對(duì)照，同時(shí)設(shè)不接枯萎病菌和只接枯萎病菌為陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。太空杯均放入長45 cm、寬30 cm 的塑料托盤中，每處理10 株，3 次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。常規(guī)管理，20 d 后調(diào)查各處理白菜幼苗的株高、根長和鮮質(zhì)量及發(fā)病情況并計(jì)算病情指數(shù)和防治效果[25-26]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

抑菌率/%=（對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對(duì)照組菌落直徑-菌餅直徑）×100。

病情指數(shù)=Σ（各級(jí)病株數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高病級(jí)）×100。

防治效果/%=[（空白對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/空白對(duì)照病情指數(shù)]×100。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan’s 新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉菌對(duì)大白菜枯萎病的離體抑菌活性

供試的9 株木霉菌對(duì)2 株大白菜枯萎病菌均有一定抑制作用（表1）。9 株木霉菌對(duì)大白菜枯萎病菌BCGF1 和BCGF2 的抑制率分別在51.49%～81.42%和41.54%～87.18%，其中以菌株2021-2 和2019-1 的拮抗作用較強(qiáng)（圖1）。9 株木霉菌對(duì)大白菜枯萎病菌BCGF1 和BCGF2 的熏蒸抑制率分別在5.98%～22.97%和9.16%～21.91%，以菌株2020-6和2021-1 的熏蒸作用最強(qiáng)（圖2）。

圖1 木霉菌對(duì)大白菜枯萎病菌的抑制效果（7 d）

圖2 木霉菌對(duì)大白菜枯萎病菌的熏蒸效果（5 d）

表1 木霉菌對(duì)大白菜枯萎病菌的離體抑菌活性 %

2.2 拮抗木霉菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 由圖3 可以看出，菌株2019-1菌落由白色至淺黃色至綠色，平鋪在培養(yǎng)基上，呈同心輪紋狀排列，具有清新的芳香氣味。分生孢子梗垂直對(duì)生或互生，分生孢子綠色、近球形、大小3.2～4.5 μm（n=20）；菌株2021-2 菌落黃綠色，菌絲不太豐富，平鋪在培養(yǎng)基上，孢子粉很多呈球狀。分生孢子梗分支不規(guī)則，單生或?qū)ι?，較少單生，呈帚狀瓶頸形，淺綠色至綠色，分生孢子橢圓形，大小

圖3 菌株2019-1 和2021-2 的菌落形態(tài)、分生孢子梗和分生孢子特征

2.5～4.0 μm（n=20）。

2.2.2 分子鑒定 以ITS1、ITS4 為引物對(duì)菌株2019-1 和2021-2 的基因組ITS 區(qū)段序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序結(jié)果顯示其擴(kuò)增片段分別為610 bp 和646 bp。經(jīng)Blast 比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)屬于木霉屬（Trichoderma）。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示（圖4），菌株2019-1 與深綠木霉（Trichoderma atroviride）位于同一進(jìn)化分支；菌株2021-2 與哈茨木霉（T. harzianum）位于同一進(jìn)化分支。

圖4 木霉菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 拮抗木霉菌對(duì)大白菜枯萎病的盆栽防效

盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明（表2），木霉菌發(fā)酵液采用灌根處理20 d 后，菌株2019-1、2021-2 和對(duì)照藥劑哈茨木霉處理的白菜苗明顯比枯萎病菌對(duì)照處理的白菜幼苗發(fā)病輕，其病情指數(shù)分別為31.67%、33.96%和32.56%，均顯著低于只接種病原菌的對(duì)照處理，防治效果分別為67.24%、64.87%和66.32%，菌株2019-1 和菌株2021-2 的病情指數(shù)差異不顯著，且與對(duì)照藥劑哈茨木霉的病情指數(shù)差異不顯著，三者均與接菌對(duì)照差異顯著。由此表明，上述2株木霉菌對(duì)大白菜枯萎病具有較好的防治效果。另外，經(jīng)木霉發(fā)酵液處理的白菜幼苗的鮮質(zhì)量、株高和根長顯著大于接種枯萎病菌的白菜幼苗，菌株2019-1、2021-2 和哈茨木霉處理的白菜幼苗的鮮質(zhì)量、株高和根長差異不顯著，但均與接菌對(duì)照和空白清水對(duì)照差異顯著，以空白清水處理的幼苗生長最好，其次為菌株2019-1、2021-2 和哈茨木霉，接菌對(duì)照幼苗生長最差，表明菌株2019 和2021-2 及哈茨木霉對(duì)白菜生長有一定的促生作用。

表2 木霉菌對(duì)大白菜枯萎病的盆栽防治效果

3 討論與結(jié)論

木霉菌是一種重要的生防菌，大量的研究結(jié)果表明，其對(duì)多種植物病害具有良好的防治效果和促生作用[12-19]。魯海菊等[28]試驗(yàn)表明，內(nèi)生木霉菌對(duì)枇杷根腐病的防效在80%以上；趙玳琳等[29]發(fā)現(xiàn)微生物菌劑與木霉菌混合使用對(duì)甘藍(lán)黑腐病的防效可達(dá)79.16%，且具有促生作用。Cong 等[30]發(fā)現(xiàn)擬康氏木霉（T.pseudokoningii）與黑根霉（Rhizopus nigricans)混合發(fā)酵液對(duì)黃瓜枯萎病的田間防效達(dá)76.5%。盧德鵬等[31]試驗(yàn)表明，木霉菌可濕性粉劑對(duì)番茄枯萎病防效在70%以上，與對(duì)照藥劑防效相當(dāng)，且具有促生作用。陳凱等[32]篩選到2 株木霉菌對(duì)黃瓜枯萎病田間防效為64.19%～66.89%，而混合使用防治效果可提高到73.65%。雖然木霉菌對(duì)其他植物病害防治效果的研究較多，但目前未見其防控大白菜枯萎病的相關(guān)報(bào)道。

近年來，由于栽培方式的改變，大白菜枯萎病發(fā)生嚴(yán)重，對(duì)其產(chǎn)量造成巨大的威脅[8]。化學(xué)防治是大白菜枯萎病的主要防治手段，但已出現(xiàn)污染環(huán)境等問題，綠色防控在未來顯得尤為重要[8，27]。筆者的研究從大白菜根際分離木霉菌株，以枯萎病菌為靶標(biāo)菌，篩選到對(duì)大白菜枯萎病菌具有良好拮抗作用的深綠木霉2019-1 和哈茨木霉2021-2，其抑菌率均為70%以上，熏蒸抑制率10%左右，盆栽防效為64.87%～67.24%。因此，開發(fā)深綠木霉2019-1 和哈茨木霉2021-2 生防制劑防治大白菜枯萎病具有廣闊的應(yīng)用前景。

綜上所述，深綠木霉2019-1 和哈茨木霉2021-2對(duì)大白菜枯萎病菌的抑菌活性較高，可有效防治大白菜枯萎病，促進(jìn)植物生長，有較好的應(yīng)用潛力。木霉菌的防病促生機(jī)制是多方面的，是生防菌推廣應(yīng)用的基礎(chǔ)。下一步需要深入研究2019-1 和2021-2 菌株的抑菌物質(zhì)、作用機(jī)制和加工工藝，并進(jìn)一步探究其高效利用技術(shù)，為大白菜枯萎病的綠色防控提供重要的理論和技術(shù)支撐。