彭彤，馬少蘭，馬彩霞，宋燕芳，高娜，李凱樂(lè)，張傳繼，李靜雯，納小凡，王立光*

（1.蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.細(xì)胞活動(dòng)與逆境適應(yīng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；3.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；4.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，甘肅 蘭州 730070）

寧夏枸杞（Lycium barbarum）為茄科、枸杞屬多年生多分枝灌木，其果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，具抗腫瘤、抗炎等多種生物學(xué)活性［1-2］，極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值。加之枸杞具有極強(qiáng)的耐鹽、耐旱和耐貧瘠等特征［3］，非常適合在我國(guó)西北干旱、半干旱生態(tài)脆弱區(qū)栽培［4］。枸杞種植業(yè)已成為區(qū)域經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)和農(nóng)民經(jīng)濟(jì)增收的特色農(nóng)產(chǎn)業(yè)之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年我國(guó)枸杞干果產(chǎn)量達(dá)44.1萬(wàn)t，其中出口12766.7 t、出口金額達(dá)10882.1萬(wàn)美元［5］。然而，在連年單作的情況下，枸杞出現(xiàn)產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降及土傳病害增加等連作障礙現(xiàn)象［6-8］，嚴(yán)重阻礙了枸杞種植業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，對(duì)我國(guó)西北欠發(fā)達(dá)地區(qū)“鄉(xiāng)村振興”計(jì)劃的實(shí)施和推動(dòng)造成了負(fù)面影響。

研究表明，連續(xù)單作18年的枸杞園表層土壤全氮和有效磷含量分別增加至1.7 g?kg-1和114.2 mg?kg-1［6］，但這些元素的積累并不能維持枸杞的產(chǎn)量和品質(zhì)［7-8］。長(zhǎng)期單作導(dǎo)致的次生鹽堿化通過(guò)抑制枸杞根系活性、誘導(dǎo)根細(xì)胞氧化損傷等來(lái)影響枸杞生長(zhǎng)［9］。對(duì)單作條件下土壤微生物群落的研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期單作降低了枸杞地土壤真菌群落多樣性、誘導(dǎo)枸杞根際和非根際土壤細(xì)菌與真菌比值分別降至對(duì)照樣地的67%和37%，導(dǎo)致再植枸杞根際土壤微生物環(huán)境偏向于真菌型［10］。其中，土壤理化性質(zhì)改變是單作下枸杞園土壤微生物群落變異和多樣性損失的主要因子［7，11-12］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期單作誘導(dǎo)了鐮刀菌屬等植物病原真菌在枸杞根際大量富集［7，11］，這一現(xiàn)象與枸杞根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變異和枸杞-根際細(xì)菌群落解偶聯(lián)有關(guān)［11，13］。

作為分解者，土壤微生物群落的代謝活性和生理特征對(duì)其生態(tài)功能的實(shí)現(xiàn)具有重要作用［14］。雖然前期對(duì)枸杞園土壤微生物響應(yīng)長(zhǎng)期單作的微生物生態(tài)學(xué)機(jī)制進(jìn)行了詳盡研究，但就長(zhǎng)期單作如何影響土壤微生物的代謝活性仍不明確，這一研究空缺阻礙了對(duì)枸杞連作障礙形成機(jī)制的認(rèn)知。為研究長(zhǎng)期單作對(duì)枸杞園土壤微生物代謝活性和底物利用譜的影響，本研究利用Biolog Eco平板分析了枸杞園表層和亞表層土壤微生物代謝活性的年代變化規(guī)律，探究了土壤理化性質(zhì)、酶活性和微生物代謝活性間的關(guān)系，為深入理解枸杞連作障礙形成機(jī)制提供了參考。

1 材料與方法

1.1 土壤樣本采集

本研究分別在寧夏銀川市南梁農(nóng)場(chǎng)（種植1、9、17和20年，N1、N9、N17和N20）和石嘴山市惠農(nóng)區(qū)（種植5、15和20年，H5、H15和H20）選取了7個(gè)不同種植年限的枸杞地。兩個(gè)采樣區(qū)域均屬于溫帶大陸性半干旱季風(fēng)氣候，年平均降水量分別為153.1和143.0 mm，年平均溫度分別為9.1和9.0℃。區(qū)域內(nèi)選擇種植密度（每hm24200～4400株枸杞）和管理措施（即灌溉和耕作方法、施肥量和頻率）相同的枸杞地為樣地［12］。其中，所選樣地施肥量為每年每hm2施加900 kg N、600 kg P2O5和400 kg K2O。每個(gè)樣地中隨機(jī)設(shè)置3個(gè)10 m×10 m的樣方，樣方間距50 m。利用土鉆在距離枸杞莖15 cm處采集表層（0～20 cm）和亞表層（20～40 cm）土壤，每個(gè)樣方內(nèi)隨機(jī)采集10點(diǎn)，后分別合并成表層和亞表層土壤樣本。試驗(yàn)共采集表層和亞表層土壤各21個(gè)樣本。

1.2 土壤理化性質(zhì)分析

本研究所有土壤樣本采集于2017年4月完成。新鮮土壤帶回實(shí)驗(yàn)室過(guò)2 mm篩，去除植物碎片并充分混勻。一半樣品陰干，用于理化性質(zhì)分析；另一半立即用于Biolog Eco平板、酶活性和含水量測(cè)定。采用烘干法測(cè)定土壤含水量［15］。分別使用pH計(jì)（sartorius PB-10，德國(guó)）和電導(dǎo)率儀（mettler toledo FE38，上海）測(cè)定土壤pH和電導(dǎo)率，土（干重）水比為1∶5（w/v）［16］。采用重鉻酸鉀法測(cè)定土壤總有機(jī)碳含量，采用Kjeldahl法測(cè)定總氮含量，用HF-HClO4消化后采用鉬藍(lán)比色法測(cè)定土壤總磷含量，利用堿解擴(kuò)散法測(cè)定堿解氮含量，采用鉬銻抗比色法測(cè)定速效磷含量，利用乙酸浸提法測(cè)定速效鉀含量［17-19］。參照張甘霖等［20］和姜慶利等［21］的方法測(cè)定土壤黏粒含量。

1.3 土壤主要酶活性測(cè)定

參照Na等［12］的方法測(cè)定土壤脫氫酶活性。脲酶以尿素為底物，以尿素降解速率表示酶活性［22］。蔗糖酶活性利用單位時(shí)間內(nèi)葡萄糖生成量表示［23］。土壤酸性磷酸酶以對(duì)硝基磷酸苯二鈉為底物，以單位時(shí)間內(nèi)對(duì)硝基苯酚的生成量計(jì)算酶活性［12］。參照Kandeler等［24］的方法測(cè)定土壤蛋白酶活性，以酪蛋白為底物，利用分光光度法測(cè)定。

1.4 土壤微生物群落碳源利用多樣性分析

稱(chēng)取相當(dāng)于5 g干重的新鮮土壤至100 mL三角瓶中，加入45 mL無(wú)菌磷酸緩沖液（pH=7.4），置于28℃搖床180 r?min-1振蕩10 min。靜置3 min，吸取3 mL上清液至含27 mL無(wú)菌磷酸緩沖液的50 mL離心管中，充分振蕩。重復(fù)此步驟2次，獲得稀釋1000倍土壤懸液。懸液搖勻后，每孔125 μL依次加至Biolog Eco平板（每個(gè)土壤樣本設(shè)置3次重復(fù)），后于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每24 h于酶標(biāo)儀（Varioskan Flash，芬蘭）測(cè)定OD595和OD750，連續(xù)測(cè)定8 d。

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

使用Shannon-Wiener指數(shù)（H′）表示底物利用多樣性，利用平均每孔吸光度（average well color development，AWCD）反映土壤微生物的總體代謝活性。計(jì)算公式分別為：

式中：C為每個(gè)底物的OD595值，R為板內(nèi)控制孔的OD595值。Pi為平板中每個(gè)底物去除背景后（C-R）的校正OD595除以所有底物校正OD595值的總和。Pearson相關(guān)性分析及回歸分析均在SPSS中完成；變差分解分析（variance partitioning analysis）和Mantel test在R中完成［12-13］。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)期單作對(duì)枸杞園表層和亞表層土壤微生物底物利用的影響

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明，隨種植年限增加，枸杞園表層土壤微生物對(duì)吐溫80（r=0.462，P=0.035）和衣康酸（r=0.434，P=0.050）的利用率顯著增加；而亞表層土壤對(duì)D-葡萄氨酸（r=-0.560，P=0.008）和苯乙基胺（r=-0.510，P=0.019）的利用率顯著降低（表1）。

表1 枸杞園土壤微生物不同碳源利用率與種植年限的相關(guān)性Table 1 Pearson’s correlation between stand age and the utilization rates of different carbon sources of soil microorganisms in L.barbarum fields

將31種碳源按照氨基化合物、氨基酸、糖類(lèi)、羧酸、雙親化合物和聚合物6類(lèi)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)枸杞園2個(gè)土層土壤微生物對(duì)聚合物的利用率均隨種植年限增加顯著降低（P＜0.05），其他5類(lèi)底物的代謝活性無(wú)明顯變化（圖1）。對(duì)比不同深度土壤發(fā)現(xiàn)，亞表層土壤對(duì)聚合物的利用能力較表層土壤下降更加明顯（圖1F）。這些結(jié)果說(shuō)明長(zhǎng)期單作會(huì)導(dǎo)致枸杞園土壤微生物對(duì)聚合物的利用能力下降，且對(duì)亞表層土壤的影響較表層更加明顯。

圖1 長(zhǎng)期單作對(duì)枸杞園土壤微生物6類(lèi)碳源利用活性的影響Fig.1 Effects of long-term monocropping on utilization rate of different carbon groups of the soil microorganisms in L.barbarum fields

2.2 長(zhǎng)期單作對(duì)枸杞園表層和亞表層土壤微生物底物利用多樣性的影響

Biolog Eco平板分析表明，表層土壤微生物AWCD值隨種植年限增長(zhǎng)（R2=0.359，P=0.002），而亞表層AWCD值則與種植年限無(wú)明顯關(guān)系（圖2A）。此外，表層和亞表層土壤微生物底物利用譜的多樣性指數(shù)均不受種植年限影響（圖2B）。主坐標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)，枸杞園表層土壤微生物底物利用譜隨種植年限增加無(wú)明顯模式（圖2C），但亞表層微生物底物利用譜隨樹(shù)齡增加逐漸趨同，且不同采樣地點(diǎn)的變化趨勢(shì)不同（圖2D）。

圖2 枸杞園土壤微生物底物利用多樣性分析Fig.2 Analysis of metabolic activity and diversity of soil microbes in distinct soil depths of L.barbarum fields

2.3 長(zhǎng)期單作下枸杞園土壤理化因子與微生物底物利用活性的關(guān)系

相關(guān)分析顯示，長(zhǎng)期單作條件下枸杞園土壤微生物底物利用香農(nóng)指數(shù)和AWCD與土壤深度呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），而與全磷、沙粒含量、土壤脫氫酶及蛋白酶活性呈顯著正相關(guān)（P＜0.05，圖3）。此外，多數(shù)土壤酶活性，如蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶和脫氫酶活性與土壤總有機(jī)碳、全氮、速效鉀及電導(dǎo)率等呈負(fù)相關(guān)，表明長(zhǎng)期單作可能影響枸杞園土壤微生物的代謝活性和物質(zhì)循環(huán)功能。

圖3 枸杞園土壤微生物特征、理化性質(zhì)及土壤酶活性的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis among soil microbial characters，abiotic properties，and soil enzyme activities

變差分解分析（variance partitioning analysis）顯示，土壤理化性質(zhì)和微生物特征分別解釋了枸杞園土壤微生物底物利用譜變化的6.7%和3.5%（P＜0.05，n=42，圖4A），但這些因子不能解釋表層土壤微生物底物利用譜的變化（P＞0.05，n=21，圖4B）。對(duì)亞表層土壤的分析發(fā)現(xiàn)，土壤微生物特征是解釋代謝譜變化的主要因子（R2=0.10，P＜0.05，n=21），而土壤理化性質(zhì)和酶活性均對(duì)其無(wú)明顯影響（P＞0.05，圖4C）。

圖4 變差分解分析枸杞園土壤微生物底物利用譜變化的主要解釋因子Fig.4 Analysis of the explanatory factors for the shift in soil microbial substrate utilization profile of L.barbarum fields using variance partitioning analysis

Mantel test結(jié)果進(jìn)一步顯示，所有樣本中，土壤微生物底物利用譜與土壤理化性質(zhì)（r=0.265，P=0.001）、微生物特征（r=0.214，P=0.013）和真菌群落結(jié)構(gòu)（r=0.140，P=0.038）呈顯著相關(guān)關(guān)系（表2）。表層土壤底物利用譜僅與土壤理化性質(zhì)呈弱相關(guān)關(guān)系（r=0.181，P=0.081），而亞表層土壤微生物底物利用譜與土壤理化性質(zhì)（r=0.287，P=0.001）顯著相關(guān)、與土壤真菌群落組成弱相關(guān)（r=0.125，P=0.114）。

表2 Mantel test分析土壤微生物底物利用譜與土壤理化性質(zhì)、酶活性及微生物群落組成間的關(guān)系Table 2 Mantel test detects the relationships between soil microbial community-level physiological profiles and soil abiotic property，enzyme activity，and soil microbial community composition in L.barbarum fields

3 討論

3.1 長(zhǎng)期單作干擾枸杞園土壤微生物群落對(duì)復(fù)雜有機(jī)物的降解

前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期單作能夠顯著促進(jìn)枸杞園表層和亞表層土壤有機(jī)碳、氮、磷及可利用磷含量積累［6，12］。這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累激活了表層土壤中蛋白酶、磷酸酶和脫氫酶等酶的活性［12］，同時(shí)促進(jìn)了表層土壤微生物對(duì)碳源的利用活性，說(shuō)明長(zhǎng)期單作能夠提高枸杞地表層土壤微生物的代謝活性。然而，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期單作抑制了枸杞園土壤微生物對(duì)聚合物的利用率（圖1F）。雖然表層土壤AWCD值隨種植年限增加逐漸升高，但這種激發(fā)效應(yīng)主要是通過(guò)刺激土壤微生物群落對(duì)簡(jiǎn)單有機(jī)物的代謝活性而實(shí)現(xiàn)（圖1）。這些結(jié)果暗示，長(zhǎng)期單作可能導(dǎo)致枸杞園土壤微生物的代謝功能出現(xiàn)缺陷，誘使土壤微生物傾向于利用易分解有機(jī)物，進(jìn)而影響土壤微生物對(duì)復(fù)雜有機(jī)物的分解和利用，最終誘發(fā)自毒作用。此外，這種作用可能與單作驅(qū)動(dòng)的土壤生物群落變異和多樣性減低［12］，尤其是真菌群落結(jié)構(gòu)組成的變化有關(guān)（表2），但這一假設(shè)仍需進(jìn)一步研究。

3.2 土壤理化性質(zhì)和微生物群落部分驅(qū)動(dòng)土壤微生物代謝活性

由于表層土壤經(jīng)常受到旋耕、除草等機(jī)械干擾，且外界環(huán)境溫度、蒸騰速率變化較大，從而導(dǎo)致影響表層土壤微生物代謝和多樣性的因素較多（圖2C）。與此同時(shí)，由于土壤微生物活性更容易受到采樣時(shí)土壤微環(huán)境的瞬時(shí)效應(yīng)影響，因此導(dǎo)致本研究所測(cè)定的數(shù)據(jù)無(wú)法有效解釋表層土壤微生物代謝多樣性。然而，亞表層土壤由于不受旋耕影響，且土壤溫度和含水量等相對(duì)穩(wěn)定［25］，因此長(zhǎng)期單作下不斷輸入的化肥和植物殘?bào)w會(huì)對(duì)土壤微生物群落組成［12］和微生物底物利用譜產(chǎn)生一定的積累效應(yīng)（圖4）。這種效應(yīng)不僅反映了長(zhǎng)期單作驅(qū)動(dòng)枸杞園亞表層土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能演替的規(guī)律，而且排除了部分非單作因素的干擾。由此推測(cè)，亞表層土壤微生物的變化規(guī)律可能更準(zhǔn)確地反映了長(zhǎng)期單作對(duì)枸杞園土壤微生物區(qū)系和功能的累積效應(yīng)，表明研究亞表層土壤質(zhì)量和健康狀況變化對(duì)于揭示多年生植物連作障礙機(jī)制可能更加重要。

與表層土壤不同，亞表層土壤微生物底物利用譜部分受土壤微生物特征和土壤理化因子影響（表2），說(shuō)明長(zhǎng)期單作導(dǎo)致的土壤理化性質(zhì)改變影響了微生物組成［12］和代謝多樣性（圖4）。然而，本研究所測(cè)定的土壤理化因子和酶活性對(duì)枸杞園土壤微生物代謝活性的解釋率較低，推測(cè)土壤微生物底物代謝譜可能與土壤活菌組成和多樣性以及長(zhǎng)期輸入碳源的質(zhì)和量有關(guān)。這一假設(shè)由亞表層土壤真菌絕對(duì)豐度和豐富度指數(shù)對(duì)枸杞園土壤微生物底物利用譜的影響間接證實(shí)（圖4），但同樣需要深入研究。結(jié)合前期研究揭示的長(zhǎng)期單作抑制亞表層土壤真菌豐度和細(xì)菌多樣性的試驗(yàn)結(jié)果［12］，本研究結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明長(zhǎng)期單作對(duì)枸杞園亞表層土壤真菌豐度和多樣性的負(fù)面效應(yīng)，可能間接影響了土壤微生物的代謝活性，尤其是對(duì)聚合物的利用能力。

3.3 長(zhǎng)期單作誘導(dǎo)的枸杞-土壤負(fù)反饋?zhàn)饔每赡茉趤啽韺油寥栏鼮閲?yán)重

與前期對(duì)土壤酶活性的研究結(jié)果一致［12］，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)枸杞園亞表層土壤微生物的代謝活性不受種植年限影響（圖2A）。在長(zhǎng)期單作條件下，亞表層土壤碳、氮和磷等營(yíng)養(yǎng)元素均隨種植年限增加而大量積累［12］，然而這種積累并沒(méi)有激活亞表層土壤微生物的總體代謝活性（圖2A），暗示該層土壤微生物的代謝功能可能受到長(zhǎng)期單作影響。這一假設(shè)也間接由相關(guān)性分析結(jié)果印證，即主要土壤酶活性與土壤碳、氮、鉀含量以及電導(dǎo)率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（圖3）。長(zhǎng)期單作條件下，當(dāng)施入的化學(xué)肥料無(wú)法被植物利用時(shí)，無(wú)機(jī)離子的大量積累會(huì)增加土壤滲透勢(shì)和離子濃度［26］。由于亞表層土壤無(wú)機(jī)鹽的積累明顯高于表層土壤［12］，鹽分的積累對(duì)土壤微生物造成滲透和離子脅迫，從而影響深層土壤微生物的代謝活性和功能［27-29］。此外，由于負(fù)責(zé)吸收功能的細(xì)根（直徑＜2 mm）主要分布在亞表層土壤［30-31］，因此該層土壤的次生鹽堿化能夠同時(shí)影響枸杞生長(zhǎng)和土壤微生物功能，造成更嚴(yán)重的枸杞-土壤負(fù)反饋?zhàn)饔谩Ｔ谖磥?lái)，需通過(guò)詳細(xì)的田間和室內(nèi)盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證這一假設(shè)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，長(zhǎng)期單作可促進(jìn)枸杞園表層土壤微生物的代謝活性，但也抑制其對(duì)聚合物的降解，推測(cè)長(zhǎng)期單作可能誘導(dǎo)土壤微生物更傾向于利用簡(jiǎn)單有機(jī)物。隨種植年限增加，亞表層土壤微生物底物利用譜逐漸趨同，這種變化部分受枸杞園土壤理化因子和真菌豐度影響。長(zhǎng)期單作下，枸杞凋落物的輸入和化肥的使用能夠影響土壤微生物群落的代謝活性和特征。這種影響在亞表層土壤可能主要以負(fù)面效應(yīng)為主，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了亞表層土壤質(zhì)量對(duì)枸杞種植業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要性。