田彬 劉長松 程為

骨質(zhì)疏松癥是以骨組織微結(jié)構(gòu)破壞和骨量減少為主要病理特征的一種全身性骨骼疾?。?］。骨質(zhì)疏松癥患者的牙槽骨局部表現(xiàn)為骨密度減低、骨愈合減緩和骨吸收增加，因此易于發(fā)生骨組織缺損。我國正在逐步步入老齡化社會(huì)，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率逐年提高［2，3］。大量的口腔種植相對(duì)禁忌的骨質(zhì)疏松癥患者在缺牙局部同時(shí)存在骨組織的缺損，因此給口腔種植帶來極大的挑戰(zhàn)，很多學(xué)者已經(jīng)開始著手這方面的研究。因此，建立一個(gè)可靠、可行且相對(duì)簡(jiǎn)單的骨質(zhì)疏松癥的骨缺損動(dòng)物模型來進(jìn)行相關(guān)的前期實(shí)驗(yàn)研究具有至關(guān)重要的意義［4］。我們的研究建立了骨質(zhì)疏松兔的顱骨缺損動(dòng)物模型，從而為深入研究骨質(zhì)疏松癥患者的骨增量的研究奠定基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 48 只雌性5月齡，體重（2.5±0.25）kg 的普通級(jí)新西蘭大白兔，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用（倫理號(hào)：KQYY-201803-002）。

1.2 骨質(zhì)疏松造模實(shí)驗(yàn) 將所有動(dòng)物隨機(jī)分為2組（A 組，B 組），每組24只動(dòng)物。再將每組隨機(jī)分成4 組，每組6 只動(dòng)物。其中A 組為：A1、A2、A3、A4，B 組為：B1、B2、B3、B4。速新眠II 0.2 ml/kg和舒泰10 mg/kg 混合后肌肉注射，全身麻醉實(shí)驗(yàn)兔。沿腹中線做5 cm 縱行切口切開腹腔。（1）A 組（造模組）：結(jié)扎雙側(cè)卵巢及附件后摘除，關(guān)閉創(chuàng)口。（圖1）（2）B 組（對(duì)照組）：找到卵巢后切取鄰近的等量脂肪組織即縫合創(chuàng)口。

圖1 卵巢切除手術(shù)圖

1.3 驗(yàn)證骨質(zhì)疏松造模實(shí)驗(yàn) 卵巢切除手術(shù)后3個(gè)月將A1及B1組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部處死，取股骨頭。股骨頭通過微型計(jì)算機(jī)斷層掃描系統(tǒng)（microCT：Siemens Inveon Micro，德國）進(jìn)行360°旋轉(zhuǎn)掃描，數(shù)據(jù)三維重建進(jìn)行分析。標(biāo)本掃描后，脫鈣處理，切片行HE染色。

1.4 顱骨缺損造模實(shí)驗(yàn) 剩余6組動(dòng)物（均為進(jìn)行完上述手術(shù)的實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M），進(jìn)行顱骨缺損造模。

實(shí)驗(yàn)兔全身麻醉，于顱頂區(qū)制備圓形直徑5 mm 的全層骨缺損（諾瓦格MD20種植機(jī)）。骨缺損在顱骨的一側(cè)距離骨縫2 mm 的位置，硬腦膜完整（圖2）。骨缺損僅以新鮮出血形成的血凝塊充盈，縫合骨膜、皮下組織、皮膚。

圖2 顱骨缺損造模手術(shù)圖

分別在顱骨手術(shù)后4 周處死A2、B2 組，術(shù)后8周處死A3、B3組，術(shù)后12周處死A4、B4組。

動(dòng)物處死前2周耳緣靜脈注射10 mg/ml鈣黃綠素注射液，動(dòng)物處死前3、4 天注射10 mg/ml 茜素紅注射液。實(shí)驗(yàn)兔處死后取顱骨標(biāo)本，脫水，缺損區(qū)制備硬組織磨片。共聚焦顯微鏡（Olympus，日本）激發(fā)標(biāo)本的鈣黃綠素的綠色熒光和茜素紅的紅色熒光，采集圖像。然后，甲苯胺藍(lán)染色標(biāo)本。對(duì)標(biāo)本進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)分析：新骨面積比（%)=(新形成骨面積，mm2)/(總面積，mm2)×100(%)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，統(tǒng)計(jì)方法采用ANOVA 單因素方差分析比較各組間及組內(nèi)差異，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 大體觀察 實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后傷口無紅腫、開裂及腹腔積膿感染等，愈合良好。A 組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物卵巢摘除術(shù)后三個(gè)月時(shí)，毛色灰暗，體重增加明顯，與B組有顯著性差異（圖3）。

圖3 實(shí)驗(yàn)兔體重統(tǒng)計(jì)圖（n=24，A：實(shí)驗(yàn)組；B：對(duì)照組。NS：無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；*：P<0.05）

2.2 股骨頭MicroCT 圖重建 股骨Micro CT三維重建圖可見：A1 組股骨頭骨密度低于B1 組，皮質(zhì)骨厚度變薄，骨髓腔增大；松質(zhì)骨骨小梁稀疏、連接率降低、孔隙率增加。A1 組股骨頸骨皮質(zhì)厚度變薄，明顯薄于B1組。（圖4）

圖4 實(shí)驗(yàn)兔卵巢切除3個(gè)月前、后股骨頭MicroCT重建圖

2.3 股骨頭HE 染色圖（圖5）B1 組（未切除卵巢組）骨皮質(zhì)較厚，厚度均勻、完整；松質(zhì)骨骨小梁豐富，粗大，排列密集，骨量豐富。

圖5 實(shí)驗(yàn)兔股骨頭脫鈣切片HE染色圖

A1 組相比B1 組：骨皮質(zhì)明顯變薄，厚度不均勻；松質(zhì)骨骨小梁變細(xì)，稀疏，數(shù)目變少，部分?jǐn)嗔严?；骨量明顯減少，髓腔擴(kuò)大。

2.4 兔顱骨磨片的熒光檢測(cè)（圖6）激光共聚焦顯微鏡下，螯合鈣黃綠素的新生骨組織在特定波長激發(fā)光下呈現(xiàn)亮綠色，螯合茜素紅的新生骨組織呈現(xiàn)紅色。分別拍攝的兩種熒光條帶，合成圖像，讀取灰度值，通過Image J 圖像分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

?Jane Yakowitz Bambauer，“The New Intrusion”，Notre Dame Law Review，88(1)，2012，pp．205 ～277．

圖6 顱骨骨組織缺損區(qū)域不脫鈣磨片熒光融合圖片及統(tǒng)計(jì)圖

顱骨術(shù)后4 周，骨缺損邊緣只有很少量的不規(guī)則新骨形成，骨缺損的中心區(qū)新生骨組織極少觀察到。兩組間沒有顯著性差異，均形成約5%的新生骨組織。

顱骨術(shù)后8 周，新骨形成量略有增加，骨質(zhì)疏松組A3組僅比4周時(shí)A2組新骨略多，對(duì)照組B3組缺損區(qū)邊緣向中心區(qū)不規(guī)則生長新生骨組織，A3組明顯少于B3組。

顱骨術(shù)后12 周，B4 組可觀察到島狀的新生骨組織位于骨缺損中心區(qū)，B4 新生骨幾乎達(dá)到10%，而A4 組僅向缺損中心區(qū)略有增多（新骨形成量約7%），兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)（甲苯胺藍(lán)染色）（圖7）甲苯胺藍(lán)染色的組織學(xué)切片與熒光標(biāo)記圖片一致（圖7）。新生骨組織被染成藍(lán)色，主要位于骨缺損邊緣和骨組織表面，骨缺損的中心區(qū)也少量存在。

圖7 甲苯胺藍(lán)染色的骨組織缺損區(qū)域組織形態(tài)學(xué)圖片及統(tǒng)計(jì)圖

結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)顱骨缺損手術(shù)后4 周A2組與B2組無顯著性差異，術(shù)后8周、12周A3、A4組新骨形成量均顯著低于B3、B4 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.討論

隨著我國老齡人口逐年增多，骨質(zhì)疏松作為一個(gè)社會(huì)性的健康問題，越來越受到醫(yī)學(xué)各專業(yè)的關(guān)注。缺牙同時(shí)伴隨牙槽骨骨缺損而需要種植牙的骨質(zhì)疏松癥患者日益增多，因此首先需要進(jìn)行動(dòng)物模型的相關(guān)研究。

3.1 骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的建立 目前，小鼠、大鼠、兔、犬、羊、豬等均可用于建立骨質(zhì)疏松的動(dòng)物模型，這些動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)研究中各有優(yōu)缺點(diǎn)。大鼠［2，5］、小鼠體型較小，難以提供足夠的骨量進(jìn)行骨重建方面的研究。犬雌激素分泌明顯低于人類，不適合做骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型。羊［6、7］為食草反芻動(dòng)物，鈣、磷及維生素代謝與人相差較大。豬及靈長類動(dòng)物生長周期長，實(shí)驗(yàn)周期長，因此成本較高。兔飼養(yǎng)周期短，成熟快，骨骼改建短期內(nèi)就可觀察到骨組織改變，從而縮短實(shí)驗(yàn)周期。兔體型中等；出生5-8個(gè)月性成熟后，骺板閉合，與人類相似［8］；兔的頜骨體積較小、骨量較少，骨缺損造模及骨重建手術(shù)不易觀察效果；頜骨骨重建手術(shù)后動(dòng)物的活動(dòng)及進(jìn)食均影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；胚胎學(xué)上兔顱骨與頜骨均通過膜內(nèi)成骨方式成骨，具有同源性，因此兔顱骨是研究頜骨重建與改建的首選材料［9］。基于以上原因，我們選擇兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

3.2 骨質(zhì)疏松顱骨缺損模型的建立 伴隨著老齡化社會(huì)的到來，老齡人口越來越多，其中60歲以上人群骨質(zhì)疏松的發(fā)病率約為59.89%。這部分龐大數(shù)量的骨質(zhì)疏松老齡患者的牙齒缺失常常伴隨牙槽骨的缺損，成為目前臨床中的一大難題。因此急需建立骨缺損的骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型進(jìn)行前期的研究。骨缺損的動(dòng)物模型已經(jīng)相對(duì)成熟，但能否將其應(yīng)用于骨質(zhì)疏松的動(dòng)物模型上，文獻(xiàn)中鮮有報(bào)道。

在胚胎學(xué)上，顱骨與頜骨具有同源性，均通過膜內(nèi)成骨方式成骨；解剖學(xué)上，二者形態(tài)、結(jié)構(gòu)相似，均由內(nèi)、外的皮質(zhì)骨夾中間的松質(zhì)骨構(gòu)成。因此將頜面部骨替代材料在兔顱骨缺損模型中檢測(cè)具有明顯的優(yōu)勢(shì)。當(dāng)骨缺損的范圍超出了機(jī)體骨組織的再生極限——臨界骨缺損（critical size defects，CSD)，必須借助骨替代材料才能使骨缺損達(dá)到愈合［15］。對(duì)于兔顱骨的臨界骨缺損有多種理論［16］，不同的研究選用不同的形狀以及不同的尺寸作為臨界骨缺損進(jìn)行骨組織工程學(xué)的研究,以往文獻(xiàn)中鮮有關(guān)于骨質(zhì)疏松兔的顱骨缺損的研究，我們經(jīng)過文獻(xiàn)考證及前期實(shí)驗(yàn)，選擇了在兔顱骨制備直徑5 mm 圓形全層骨缺損進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)的第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果（熒光照片及不脫鈣磨片甲苯胺藍(lán)組織學(xué)結(jié)果）可見，兔顱骨制作直徑5 mm的圓形骨缺損，骨質(zhì)疏松組術(shù)后骨缺損區(qū)域新骨形成率在4 周、8 周、12 周均低于對(duì)照組，尤其是8 周和12 周時(shí)明顯低于對(duì)照組；且所有骨質(zhì)疏松組骨缺損區(qū)域新骨形成均低于10%。由此可以得出，我們建立了骨質(zhì)疏松兔顱骨骨缺損模型，為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。