朱正錦，陳 敏，田永賢，向貴生，張 顥，邱顯欽

(1.云南大學 資源植物研究院，云南 昆明 650091；2.云南省農(nóng)業(yè)科學院 花卉研究所，云南 昆明 650205；3.國家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650205)

白粉病是切花月季種植中最嚴重的病害[1-3]，白粉菌的掌狀吸器吸取植株細胞中的營養(yǎng)物質(zhì)維持自身的生長發(fā)育[4].大量研究發(fā)現(xiàn)MLO基因在植物抗白粉病中發(fā)揮重要作用，當MLO基因的堿基序列發(fā)生改變時會形成mlo等位基因，導(dǎo)致其蛋白功能喪失從而降低了MLO基因?qū)Π追劬秩镜恼{(diào)控作用[4-6].將不同物種的MLO基因敲除后，發(fā)現(xiàn)大麥葉片出現(xiàn)斑點以及大麥谷粒產(chǎn)量下降[7-8]；擬南芥則表現(xiàn)出生長發(fā)育遲緩、衰敗較早且未感染葉片有胼胝質(zhì)沉積的現(xiàn)象[9]；辣椒表現(xiàn)為植株變小[10].本實驗室基于大花香水月季與長尖葉薔薇轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分別獲得11和12個MLO基因，與其他物種比對，得到與響應(yīng)白粉菌侵染相關(guān)的6個候選基因，其中符合抗白粉病MLO基因典型結(jié)構(gòu)特征的有RgMLO6和RlMLO7基因[11].對6個候選基因進行qRT-PCR分析，結(jié)果顯示RgMLO6和RlMLO7基因在受到白粉菌脅迫后相對表達量顯著上調(diào).

病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)（VIGS）是一種能夠快速簡便對植物基因功能進行鑒定的遺傳學方法.將目的基因片段導(dǎo)入病毒載體，然后侵染植物使該植物體內(nèi)的基因被沉默，從而引起植株表型及生理指標發(fā)生改變，以此對目的基因的功能進行鑒定[12].目前，VIGS 技術(shù)已經(jīng)被成功地應(yīng)用于煙草（Nicotiana tabacumL.）[13-14]、擬南芥（Arabidopsis thaliana）[14]、棉 花（Gossypium spp）[15-16]、番 茄（Lycopersicon esculentumMill.）[17]、馬鈴薯（Solanum tuberosum）[18]等植物中.考慮到月季遺傳轉(zhuǎn)化的困難性，我們選擇使用VIGS技術(shù)對RgMLO6和RlMLO7基因的功能進行初步鑒定.

本研究分析了大花香水月季的RgMLO6 基因和長尖葉薔薇的RlMLO7基因在白粉菌侵染時的表達模式，進一步構(gòu)建了該基因的VIGS沉默載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染獲得沉默植株并進行抗性鑒定.本研究為初步鑒定RgMLO6和RlMLO7基因?qū)Π追鄄〉恼{(diào)控功能，也為今后更好地分析MLO基因，培育薔薇科植物抗白粉病新品種提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料參照張顥等[19-20]的方法對來自大花香水月季與長尖葉薔薇的幼葉進行白粉菌侵染，分別采摘未侵染（0 h）與侵染6、12、24 h的幼葉作為供試植物材料.接穗為云南省農(nóng)業(yè)科學院花卉所科研成果示范基地的大花香水月季和長尖葉薔薇萌發(fā)的腋芽，砧木為基地‘月月粉’（R.chinensis‘Pallida’）的枝條.大腸桿菌感受態(tài)細胞 DH5α 及根癌農(nóng)桿菌熱激感受態(tài)GV3101作為試驗菌株，pTRV1和pTRV2兩個供試載體.

1.2 試驗方法

1.2.1RgMLO6和RlMLO7基 因 實 時 熒 光 定 量PCR 分別采摘白粉菌侵染0、6、12、24 h的大花香水月季與長尖葉薔薇的幼葉，總RNA的提取與基因組DNA的去除使用植物總RNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）.使用PrimeScriptTMRT reagent試劑盒（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA.以在月季中穩(wěn)定表達的UBC作為內(nèi)參基因（表1）[2]，采用qRT-PCR技術(shù)測定RgMLO6和RlMLO7基因的表達量，每個樣品設(shè)置3個生物學重復(fù)[21].反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照向貴生[11]方法，采用2-ΔΔCt法[22]分析數(shù)據(jù)并用Origin 2021作圖.

1.2.2RgMLO6和RlMLO7基因片段的克隆及表達載體的構(gòu)建 總RNA提取和cDNA的合成同1.2.1節(jié).分別選取RgMLO6基因CDS序列的3′端224 bp序列和RlMLO7基因CDS序列的3′端的259 bp序列，在設(shè)計引物（表1）時加上BamH Ⅰ和SmaⅠ酶切位點.PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測并回收目的條帶，經(jīng)測序驗證后用于下一步試驗.參照 TaKaRa公司試劑盒的操作步驟進行 PCR產(chǎn)物的切膠回收，將目的基因片段和病毒空載體pTRV2 同時用BamH Ⅰ和SmaⅠ進行雙酶切[23].分別將酶切后的RgMLO6和RlMLO7片段與線性化載體pTRV2切膠回收.參照T4 DNA Ligase酶（TaKaRa公司）說明書得到連接產(chǎn)物，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)中，在含有50 μg/mL卡那霉素平板上挑取陽性單克隆，經(jīng)菌液PCR檢測后，進行測序鑒定.對測序鑒定正確的重組轉(zhuǎn)化子菌液，按照 TIANprep Mini Plasmid Kit 說明書進行質(zhì)粒提取[23]，雙酶切鑒定質(zhì)粒是否攜帶目的基因.

1.2.3 農(nóng)桿菌侵染及沉默效率檢測 參照穆春等[24]的方法，通過電擊轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒 pTRV2、重組質(zhì)粒pTRV2-RgMLO6和pTRV2-RlMLO7轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌感態(tài)GV3101中，進行轉(zhuǎn)化前的活化及重懸.分別取大花香水月季和長尖葉薔薇長度在5 cm左右的腋芽置于清水中帶回，參照晏慧君等[25]的方法進行抽真空侵染.將抽吸后的腋芽取出，放入清水中，通過劈接法進行嫁接，用封口膜將接口封住并套上袋子，每隔4 d觀察接穗的情況.使用qRT-PCR分析接種20 d后的大花香水月季與長尖葉薔薇的RgMLO6和RlMLO7基因的表達量，在RgMLO6和RlMLO7基因沉默片段外設(shè)計引物（表1），以UBS為內(nèi)參基因（表1），擴增片段大小為109 bp.反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照Cao等[26]的方法進行，然后利用Origin 2021軟件作圖.

表1 本研究所用引物及其序列Tab.1 Primers used and their sequences used in the study

1.2.4 VIGS沉默RgMLO6和RlMLO7基因薔薇科植株白粉病抗性鑒定 以VIGS沉默RgMLO6和RlMLO7基因的大花香水月季和長尖葉薔薇作為處理組的實驗材料，與對照組相比較進行白粉病的抗性鑒定.分別取白粉菌孢子懸浮液20 μL侵染處理組和對照組的6個嫩葉正面放入培養(yǎng)皿中密封，并置于20 ℃、光強3 000 lx、16 h/d的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，然后統(tǒng)計嫩葉的白粉菌侵染情況，3次重復(fù).基因沉默植株的抗病性依照張顥的方法進行判定[18]，將相對抗病指數(shù)為1.00的判定為免疫（I）、在0.80～0.99之間的為高抗（HR）、在0.40～0.79之間的為中抗（MR）、在0.20～0.39之間的為中感（MS）、0.20以下的為高感（HS）.

選用VIGS沉默RgMLO6和RlMLO7基因且生長狀態(tài)相同的大花香水月季和長尖葉薔薇（處理組）和未沉默的（對照組）的植株幼葉作為實驗對象.分別取白粉菌孢子懸浮液20 μL侵染處理組和對照組的幼葉正面，并置于20 ℃、光強3 000 lx、16 h/d的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24 h和48 h，應(yīng)用考馬斯亮藍染色法染色后在顯微鏡下觀察白粉菌的生長狀態(tài).

2 結(jié)果分析

2.1 RgMLO6和RlMLO7基因熒光定量qPCR以UBC為內(nèi)參基因，對RgMLO6與RlMLO7基因在0、6、12 h和24 h時的相對表達量進行了分析.結(jié)果如圖1所示，RgMLO6在6、24 h的表達水平分是未處理的24、11倍，差異明顯，12 h的表達水平與未處理差異不明顯；RlMLO7基因在6、12 h的表達水平較是未處理的5、7倍，差異明顯，24 h的表達水平與未處理差異不明顯.這些結(jié)果表明大花香水月季的RgMLO6基因與長尖葉薔薇的RlMLO7基因在白粉菌侵染中發(fā)揮重要作用.

圖1 月季白粉菌誘導(dǎo)不同時期RgMLO6與RlMLO7基因的相對表達量Fig.1 The relative expression levels of RgMLO6 and RlMLO7 genes induced by powdery mildew rose at different stages

2.2 單克隆雙酶切檢測將RgMLO6和RlMLO7基因的CDS片段與線性pTRV2連接得到pTRV2-RgMLO6和pTRV2-RlMLO7重組表達載體，將重組表達載體利用BamH Ⅰ和SmaⅠ進行雙酶切，最后菌液PCR驗證正確性.結(jié)果如圖2所示，PCR電泳得到2個272 bp和255 bp長度的小片段和一個長度接近線性載體pTRV2大小的片段，表明表達載體構(gòu)建成功.

2.3 VIGS處理植株的熒光定量qPCR為了驗證大花香水月季的RgMLO6與長尖葉薔薇的RlMLO7 基因是否有效沉默，在VIGS載體轉(zhuǎn)入20 d后進行熒光定量qPCR.如圖3所示，結(jié)果表明沉默RgMLO6基因的大花香水月季中的RgMLO6基因表達量較對照組降低了87.5%；沉默RlMLO7基因的長尖葉薔薇中RlMLO7基因的表達量較對照組降低了88.9%.沉默植株中RgMLO6和RlMLO7基因的相對表達量顯著下降了80%～90%，說明pTRV2-RgMLO6和 pTRV2-RlMLO7 的導(dǎo)入可顯著地降低處理組植株內(nèi)源目標基因的相對表達量，有效沉默目標基因.

2.4 VIGS技術(shù)處理后的2種植株的白粉病抗性鑒定為了進一步探究大花香水月季的RgMLO6與長尖葉薔薇的RlMLO7 基因在抗白粉病中的作用，接種白粉菌至RgMLO6和RlMLO7基因沉默植株嫩葉7 d后對處理植株的白粉病抗性鑒定.如表2所示，經(jīng)VIGS處理后大花香水月季的抗性水平由高感上升為中抗，長尖葉薔薇的抗性水平由中抗上升為高抗，2種基因型植株的抗性水平均得到提高.

圖2 雙酶切檢測載體重組表達載體Fig.2 Recombinant expression vector was detected by double enzyme digestion

圖3 RgMLO6和RlMLO7基因在對照組和處理組植株中的相對表達量Fig.3 Relative expression of RgMLO6 and RlMLO7 gene in control and experimental plants

表2 對照組和基因沉默處理組植株白粉病抗性鑒定Tab.2 Identification of powdery mildew resistance in control group and gene silencing treatment group

經(jīng)考馬斯亮藍染色后，顯微鏡觀察對照組和RgMLO6和RlMLO7基因沉默處理組植株受白粉菌侵染后葉片中菌絲體的生長情況，結(jié)果如圖4、5所示.大花香水月季和長尖葉薔薇的葉表皮細胞在接種12 h后，對照組中均出現(xiàn)分生孢子和初級菌絲，而基因沉默處理組中僅觀察到分生孢子.在接種24 h后大花香水月季對照組開始出現(xiàn)二級菌絲，長尖葉薔薇在對照組中發(fā)現(xiàn)了分生孢子和較長的初級菌絲，RlMLO7基因沉默處理組中發(fā)現(xiàn)分生孢子和初級菌絲.在接種48 h后對照組發(fā)現(xiàn)了串生分生孢子，而在基因沉默處理組中僅發(fā)現(xiàn)了分生孢子和初級菌絲.

3 討論

MLO基因具有負向調(diào)控植物抗病性和葉肉細胞死亡雙重功能[27-29].邱顯欽等[2,6]從野薔薇中克隆得到4個mlo基因并進行結(jié)構(gòu)、亞細胞定位及時空表達模式分析，克隆1個MLO基因RmMLO并鑒別出該基因在月季相應(yīng)白粉菌侵染中有一定作用.Kaufmann等[30]將月季中MLO家族成員進行分析，篩選出4個與月季白粉病互作的MLO候選基因（RhMLO1～RhMLO4）.隨后Qiu等[31]對RhMLO1-RhMLO4基因進行qPCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在受到白粉病菌侵染不同階段表達量均明顯上調(diào)的有RhMLO1和RhMLO2基因.Qiu等[32]通過PCR和Southern blot檢測轉(zhuǎn)基因株系的整合和拷貝數(shù)，使用實時熒光定量PCR和抗性分析發(fā)現(xiàn)野薔薇的抗性與沉默RhMLO1的積累有明顯的相關(guān)性.本研究通過qRT-PCR分析RgMLO6 和RlMLO7基因在受到白粉菌侵染0、6、12、24 h的表達量，結(jié)果表明與對照相比不同時期的表達量顯著上調(diào)，這與在葡萄、西瓜中的研究結(jié)果相一致[33-34].

圖4 白粉菌在大花香水月季幼葉上菌絲體生長情況Fig.4 Mycelial growth of powdery mildew fungi on young leaves of Rosa odorata var.gigantea

圖5 白粉菌在長尖葉薔薇幼葉上菌絲體生長情況Fig.5 Mycelial growth of powdery mildew fungi on young leaves of Rose.longicuspis var.longicuspis

應(yīng)用VIGS技術(shù)沉默大花香水月季和長尖葉薔薇RgMLO6和RlMLO7基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默表達載體導(dǎo)入后有效抑制了RgMLO6和RlMLO基因的表達，表明VIGS技術(shù)沉默效果明顯.對RgMLO6和RlMLO7基因沉默植株（處理組）和對照組植株進行白粉病抗性水平鑒定，結(jié)果表明較對照組處理組植株的抗性水平都得到提高.顯微鏡觀察對照組和RgMLO6和RlMLO7基因沉默（處理組）植株葉片在受到白粉菌侵染后菌絲體的生長情況，整體表現(xiàn)出當植株受到白粉菌侵染后基因沉默植株中菌絲體的生長較對照組更慢.這些結(jié)果均表明當植株內(nèi)源MLO基因的表達下調(diào)時，可以有效提高薔薇科植物對白粉病的抗性.

4 結(jié)論

RgMLO6和RlMLO7基因參與了寄主與白粉菌的互作過程，對薔薇科植物白粉病起負調(diào)控作用.