周燕 周萌 彭軍 段瓊紅 陳軍 周美蘭 張云俠 梁軍

2021年我國肺結核發(fā)病率位居全球第三，為耐多藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)患者數(shù)最多的7個國家之一，這7個國家的耐多藥/耐藥結核病患者數(shù)占全球的2/3[1]。MDR-TB治療需藥物種類多、周期長、費用昂貴，已成為我國持續(xù)危害人群健康的重大公共衛(wèi)生問題，闡明其人群傳播機制對于MDR-TB的防治至關重要。接觸者調查是結核病防控的一項重要措施，家庭接觸是密切接觸中很重要的一種接觸方式。國外文獻報道，MDR-TB患者的家庭密切接觸者傳播MDR-TB的風險較高[2]，但國內關于MDR-TB患者家庭密切接觸者傳播的相關報道較少，武漢市也缺乏MDR-TB在家庭內傳播特征的研究，故筆者對武漢市肺結核定點醫(yī)院登記的耐多藥肺結核(multidrug-resistant pulmonary tuberculosis， MDR-PTB)患者的家庭密切接觸者進行感染、發(fā)病和菌株同源性的檢測，分析MDR-PTB家庭傳播模式，為武漢MDR-PTB精準防控提供依據(jù)。

對象和方法

一、研究對象

選取2018年7月至2020年6月武漢市肺科醫(yī)院(武漢市肺結核定點醫(yī)院)登記的全部166例MDR-PTB患者的282名家庭密切接觸者作為研究對象。其中，166例MDR-PTB患者作為本研究中一代病例，282名家庭密切接觸者中發(fā)現(xiàn)的MDR-PTB患者作為二代病例。

二、研究方法

1.密切接觸者：指在一代病例確診前3個月內與其居住在同一住宅累計至少7 d的人員，既包括共同使用同一臥室者，也包括僅使用共同的起居室而未使用同一臥室者[3]。

2.二代病例發(fā)現(xiàn)方式：MDR-PTB患者診療信息由專人錄入到中國疾病預防控制中心“結核病管理信息系統(tǒng)”。武漢市肺科醫(yī)院專門設置耐多藥結核病門診，一醫(yī)一護專職負責建立MDR-PTB患者病案信息。一代病例確診后的1周內對家庭密切接觸者進行1次面對面的癥狀問診(即在MDR-PTB患者治療隨訪的2年中，家庭密切接觸者有無咳嗽、咳痰及發(fā)熱、盜汗等癥狀)、結核菌素皮膚試驗(tuberculin skin test，TST)、胸部X線攝片(簡稱“胸片”)檢查，對有咳嗽咳痰癥狀或TST強陽性或胸片異常者收集痰標本，行痰結核分枝桿菌細菌學檢測(包含抗酸桿菌痰涂片、分枝桿菌培養(yǎng)+菌種鑒定+表型藥物敏感性試驗)，以發(fā)現(xiàn)家庭二代MDR-PTB 病例。其中，TST試驗硬結平均直徑<5 mm或無反應者為陰性，≥5 mm為陽性，≥10 mm即可確定為結核感染；陽性又分為一般陽性(5 mm≤硬結平均直徑<10 mm)、中度陽性(10 mm≤硬結平均直徑<15 mm)和強陽性(硬結平均直徑≥15 mm或<15 mm但局部出現(xiàn)遷延癥狀)[4-5]。

3.基因分型方法：為了解菌株間同源性，按照達安基因生物有限公司提供的細菌基因組DNA提取試劑盒的步驟，提取結核分枝桿菌DNA。采用Khosravi等[6]描述的DTM-PCR分型法進行菌株分型；采用MIRU分型方法選取國際標準24位點(MIRU02、Mtub04、ETRC等)，經(jīng)PCR及凝膠電泳[7]后計算基因各位點重復序列的拷貝數(shù)，獲得一、二代病例所有分離菌株基因分型。

4.其他指標：計算家庭密切接觸者結核分枝桿菌感染率、MDR-PTB發(fā)病例數(shù)和一、二代病例的耐藥表型。

三、統(tǒng)計學處理

采用Excel 2013和SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理和分析。計數(shù)資料以“例(構成比/百分率，%)”描述，組間差異的比較采用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。將MIRU分型結果的各位點重復序列拷貝數(shù)導入MIRU-VNTR在線分析平臺(https://www.miru-vntrplus.org/MIRU/index.faces)，采用非加權配對算術平均法(UPMGA)構建分離菌株MIRU最小生成樹。

結 果

一、家庭密切接觸者人口學特征與結核感染情況

166例MDR-PTB患者共有282名家庭密切接觸者，平均每例患者家庭密接者1.7名，其中女性居多，占56.74%。年齡分布在3～71歲，平均年齡為(39.3±18.4)歲。282名家庭密接者的TST檢測陰性率、一般陽性率、中度陽性率和強陽性率分別為53.90%、8.51%、10.64%和26.95%；結核感染率為37.59%(106/282)。家庭密切接觸者人口學特征及TST檢查結果見表1。

表1 家庭密切接觸者人口學特征及結核菌素皮膚試驗結果

二、不同性別、年齡家庭密切接觸者感染情況

不同性別、年齡家庭密切接觸者感染率的差異均無統(tǒng)計學意義，具體見表2。

表2 不同特征家庭密切接觸者結核菌素皮膚試驗情況

三、家庭密切接觸者肺結核診斷情況

282名家庭密切接觸者中有疑似癥狀者9例(3.19%)；行胸片檢查者274名，胸片異常者8例(2.92%)；對有咳嗽咳痰癥狀或TST強陽性或胸片異常的106例行痰結核分枝桿菌細菌學檢查，其中病原學陽性者4例(3.77%)，均為MDR-PTB患者，發(fā)病率為1.42%。

四、家庭密切接觸者感染結核分枝桿菌表型耐藥譜分析

4例二代MDR-PTB患者分布于3個家庭(共計8名密切接觸者)，其中，可能的傳播鏈為父母→子女2對、夫→妻1對、姐→妹1對。比較家庭二代病例與一代病例表型耐藥譜發(fā)現(xiàn)，3例表型耐藥譜相同，1例不同。具體見表3。

表3 家庭一代病例與二代病例基本情況及表型耐藥譜比較

五、家庭二代病例與一代病例基因分型

3個家庭共有3例一代病例和4例二代病例，對收集到的6株結核分枝桿菌(1株二代病例菌株丟失)進行24位點MIRU-VNTR基因分型，結果顯示，2個家庭4例病例的基因分型結果完全一致，1個家庭2例病例僅1個位點有差異(圖1)。同時，對3個家庭的6株結核分枝桿菌進行DTM-PCR分型，結果均為北京株。

圖1 3個家庭的6株結核分枝桿菌MIRU基因分型結果

討 論

結核病的傳播方式主要是近距離飛沫傳播，家庭密切接觸者發(fā)生結核病的風險較大。國內關于涂陽肺結核患者家庭密切接觸者傳播模式報道較多[8-9]，但關于MDR-TB家庭密切接觸者傳播機制的相關報道較少。本研究對武漢市MDR-PTB患者的家庭密切接觸者進行感染、發(fā)病和菌株同源性的觀察，探討MDR-PTB家庭傳播機制。

本研究中282名家庭密切接觸者的結核感染率為37.59%，高于Lu等[4]對中國東南部6個城市的研究(28.0%)和韓志英等[10]采用結核感染T細胞斑點試驗檢測的21.95%，也高于2000年全國第四次結核病流行病學抽樣調查人群28.3%的TST陽性率(硬結平均直徑≥10 mm)[11]。由此可見，本研究MDR-PTB患者家庭密切接觸者的結核感染率高于普通人群，呈現(xiàn)高感染狀況。國外文獻大多是MDR-TB接觸者結核病發(fā)病的橫斷面調查，隨訪的報道比較少[2,12]。MDR-TB患者的家庭密切接觸者中MDR-TB的發(fā)病率較高，Javaid等[2]在對610名家庭密切接觸者的研究中發(fā)現(xiàn)了41例(17.4%)MDR-TB患者，遠高于本研究中家庭密切接觸者MDR-PTB發(fā)病率(1.42%)，這可能與該人群國家為HIV高發(fā)國有關，而Vella等[12]在對793名密切接觸者的研究中發(fā)現(xiàn)了14例(1.8%)MDR-TB患者，這一結果與本研究相似，但均遠高于一般人群的MDR-TB發(fā)病率。

MDR-TB可導致家庭災難性支出患者的比例達到80%，當一個家庭出現(xiàn)2例及以上二代MDR-TB病例時會給患者心理及家庭經(jīng)濟造成巨大傷害[13-14]。本研究中282名家庭密切接觸者發(fā)生MDR-PTB患者4例，分布于3個家庭，其中1個家庭出現(xiàn)3例MDR-PTB患者，且以父母子女間傳播比例最高，其次為夫妻間和兄弟姐妹間傳播，提示家庭接觸是MDR-PTB傳播的高危因素，與姚芳等[8]報道的初治涂陽肺結核患者家庭接觸者中父母肺結核檢出率最高一致，但與杜雨華等[9]報道的夫妻間傳播率較高有所差異，但由于樣本量太少，這一傳播機制還有待大樣本進一步證實。對于家庭密切接觸者的發(fā)病風險時間，有文獻報道，MDR-TB感染2年內發(fā)病的風險最高[15]，這與本研究發(fā)現(xiàn)的二代病例與一代病例發(fā)病時間間隔為15 d至12個月，全部二代病例在1年內發(fā)病有所不同。故筆者認為，對MDR-PTB患者的家庭密切接觸者應至少追蹤隨訪1年，以早期發(fā)現(xiàn)家庭二代病例并及時治療。

通過表型藥物敏感性試驗結合基因分型技術可確定家庭病例間的傳播鏈。本研究顯示，3例二代病例的表型耐藥譜與一代病例一致，1例不一致。不一致的可能原因為：一是二代病例從其他途徑感染，非家庭內傳播；二是雖然是家庭內傳播，但也會發(fā)生不同抗結核藥品藥物敏感性試驗穩(wěn)定性不一致的情況，比如，異煙肼和利福平的穩(wěn)定性最高，其他抗結核藥品穩(wěn)定性較差，可重復性也較差，這就可能導致家庭病例之間利福平和異煙肼的耐藥檢測結果一致，而乙胺丁醇、鏈霉素、卡拉霉素和左氧氟沙星等的表型耐藥譜不一致。本研究中，僅有1例二代病例比一代病例增加了鏈霉素耐藥，認為可能是不同的抗結核藥品藥物敏感性試驗穩(wěn)定性不一致所致。

進一步對結核分枝桿菌進行基因分型，以確定家庭病例分離菌株之間是否有同源性，探索病例之間是否存在傳播鏈。MIRU-VNTR分型方法是一種簡便快速的結核分枝桿菌基因分型方法，是結核病分子流行病學研究中的重要工具，可用于探索結核病傳播機制、接觸者調查和同源性調查[16]。雖然目前全基因組測序的費用進一步降低，使其越來越多地應用于結核分枝桿菌的基因分型，但MIRU-VNTR分型仍然不失為一種低成本且快速的分型方法。MDR-TB家庭內傳播基因分型的報道較少，且多為個例或少數(shù)報道。本研究采用國際標準24位點MIRU-VNTR分型，發(fā)現(xiàn)6例MDR-PTB患者中有4例的基因型完全相同，另2例也僅1個位點不同。如果以1個位點以內為成簇定義，則可認為6例MDR-PTB患者全部為成簇病例，這與Cavany等[17]在配對的結核病密切接觸者中發(fā)現(xiàn)基因分型成簇率為79%的結果相似，提示結核分枝桿菌家庭內傳播的可能性極高。

綜上所述，武漢市MDR-PTB患者家庭密切接觸者存在較高的家庭內傳播風險，應當對MDR-PTB患者家庭密切接觸者做好宣傳教育、篩查及隨訪，減少MDR-PTB的家庭內傳播。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻周燕和周萌：實施研究、數(shù)據(jù)收集、整理及統(tǒng)計分析、撰寫及修改文章；彭軍: 實施研究、數(shù)據(jù)整理及統(tǒng)計分析、撰寫及修改文章：段瓊紅: 查閱文獻、修改文章；陳軍：匹配標本，實施細菌學、分子生物學檢測，整理部分數(shù)據(jù)；周美蘭：整理部分數(shù)據(jù)、查閱文獻、修改文章；張云俠和梁軍：醞釀和設計實驗、篩選研究對象、查閱文獻、修改文章