李佳，何俊，劉福明

據(jù)統(tǒng)計，全球范圍內心腦血管疾病發(fā)病率、死亡率均較高[1]，預后不良[2]。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心腦血管疾病的高危因素及病理基礎，在青年期其常表現(xiàn)為亞臨床動脈粥樣硬化（subclinical atherosclerosis，Sub-AS）[3]。Sub-AS是一種長期動態(tài)累積、緩慢進展的疾病，其起病隱匿，故早期發(fā)現(xiàn)并有效干預Sub-AS對降低心腦血管疾病發(fā)生率大有裨益[4]。雖然降脂西藥治療Sub-AS的效果明顯，但其作用靶點單一[5]，且長期使用還存在不良反應[6]。中醫(yī)藥在降脂方面經(jīng)驗豐富，安全性較高[5]，但其治療機制及有效成分尚不明確。中醫(yī)無Sub-AS病名，根據(jù)其病理過程，有學者提出“脈中積”的觀點[7]，認為Sub-AS患者以氣血虧虛、脈道不利為“本”，病位在血脈，痰、瘀、毒是其主要病理因素[8]，其早期治療應以抗炎和抗氧化為主[9]。絞股藍具有清熱解毒、益氣養(yǎng)陰、健脾化痰等功效?，F(xiàn)代藥理學研究表明，絞股藍具有降糖、降脂、調節(jié)免疫、抗氧化等作用[10]，是醫(yī)食同源類新植物資源?；⒄瓤苫到舛?、退黃祛瘀，具有抗炎、調控代謝、抗AS等作用[11]。二者配伍，標本兼治，血清脈堅，氣血調暢[12-13]。

近年來從分子、信號通路層面挖掘疾病的發(fā)生機制是常用的藥物研究方法[14]，與中醫(yī)“多靶點、整體觀”的理念相似[15]。本研究基于網(wǎng)絡藥理學與分子對接技術探討絞股藍-虎杖治療Sub-AS的潛在分子機制，以期為后續(xù)研究提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究流程 本研究流程見圖1。

圖1 研究流程Figure 1 Research process

1.2 絞股藍、虎杖活性成分靶點及篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺[16]（http://tcmspw.com/）檢索“絞股藍”“虎杖”，獲得相應的化學組成成分，設置藥動學參數(shù)，檢索過濾器進行吸收、分布、代謝和排泄（ADME）的初步篩選，設置口服生物利用度≥30%和藥物相似度指數(shù)≥0.18，獲得活性成分及靶蛋白。排除無潛在目標信息的活性成分，補充文獻報道的活性成分。然后通過Uniprot蛋白質數(shù)據(jù)庫[17]（https://www.uniprot.org）對靶蛋白進行標準化，狀態(tài)設置為“reviewed”，物種設置為“homo sapiens”。去除重復和無對應基因名稱的靶蛋白后，獲得絞股藍、虎杖的活性成分靶點。

1.3 Sub-AS相關靶點篩選及絞股藍-虎杖治療Sub-AS潛在靶點的獲取 以“Subclinical atherosclerosis”為檢索詞，從GeneCards[18]（https://www.genecards.org/）、OMIM[19]（https://omim.org/）、DrugBank[20]（https://www.drugbank.ca）數(shù)據(jù)庫收集Sub-AS相關靶點，刪重后合并靶點，補充文獻報道的已知靶點。使用UniProt數(shù)據(jù)庫將藥物活性成分靶點和疾病相關靶點統(tǒng)一規(guī)范為GeneSymbol，之后將其導入Venny在線平臺（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）映射并取交集，繪制韋恩圖，最終獲得絞股藍-虎杖治療Sub-AS的潛在靶點。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡構建及拓撲分析 使用在線數(shù)據(jù)庫STRING 11.5[21]（https://string-db.org）分析絞股藍-虎杖治療Sub-AS的潛在靶點在網(wǎng)絡中的相互關系，物種限定為“homo sapiens”，最小相互作用閾值定為“高置信度（0.7）”，同時隱藏PPI網(wǎng)絡中的不相連節(jié)點。將PPI網(wǎng)絡分析結果從STRING 11.5中導出并導入Cytoscape[22]，構建PPI網(wǎng)絡并進行優(yōu)化分析，通過內置的“Network Analyzer”分析節(jié)點的拓撲參數(shù)，運行CytoHubba插件并通過多種拓撲計算方法預測PPI網(wǎng)絡中的關鍵節(jié)點和子網(wǎng)絡，篩選最大基團中心性（maximal clique centrality，MCC）、最大鄰域分量（maximum neighborhood component，MNC）、邊過濾成分（edge percolated component，EPC）、度值、緊密性算法中排名前20的關鍵節(jié)點，并取其交集作為絞股藍-虎杖治療Sub-AS的關鍵靶點。

1.5 GO功能富集分析 將絞股藍-虎杖治療Sub-AS的關鍵靶點導入Metascape數(shù)據(jù)庫[23]（https://metascape.org/），設置P＜0.01，物種限定為“homo sapiens”，選擇GO條目下的細胞組成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）3部分分別進行GO功能富集分析，進一步尋找靶點顯著富集的主要功能注釋。

1.6 KEGG通路富集分析 運行Cytoscape 3.9.1軟件中的ClueGO插件，導入絞股藍-虎杖治療Sub-AS的關鍵靶點，設置P＜0.01，Kappa系數(shù)為0.5，進行KEGG通路富集分析。

1.7 構建藥物活性成分-疾病靶點-通路網(wǎng)絡 通過Cytoscape 3.9.1軟件，篩選絞股藍、虎杖中度值較高的活性成分、疾病靶點、相關KEGG信號通路，構建藥物活性成分-疾病靶點-通路網(wǎng)絡。之后，應用Network Analyzer分析各節(jié)點的網(wǎng)絡拓撲參數(shù)，包括度值、中心性和緊密性，并根據(jù)上述參數(shù)判斷抗Sub-AS的重要靶點、發(fā)揮治療作用的主要活性成分及信號通路。

1.8 分子對接技術 從TCMSP、RCSB（http://www.rcsb.org/pdb）、PubChem[24]（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫獲取小分子配體和受體，以分辨率＜2.5 A和參考文獻支持為篩選條件。通過ChemOffice對小分子配體進行能量最小化處理，并以“mol”格式存儲。運行PyMol 2.5.2對受體進行去水、去殘基，以“pdb”格式保存[25]。在Auto Dock Tools 1.5.7中打開配體和受體，確定配體和受體結合位點grid box的位置和大小，并以“pdbqt”格式導出[26]。使用AutoDock vina V1.2.0軟件進行分子對接操作，通過化合物與靶蛋白的親和力得分判斷分子間結合的穩(wěn)定性。運行PyMol軟件，調整透明度顯示結合位點，進行可視化分析。其中分子對接得分Affinity≥-5.00 kcal/mol且＜-4.25 kcal/mol表示配體和受體之間具有結合活性，Affinity≥-7.00 kcal/mol且＜-5.00 kcal/mol表示配體和受體之間具有良好的結合活性，Affinity＜-7.00 kcal/mol表示配體和受體之間具有強烈的對接活性[27]。

2 結果

2.1 絞股藍、虎杖活性成分及靶點 本研究共得到絞股藍、虎杖活性成分24種，靶點208個；其中絞股藍活性成分14種、虎杖活性成分9種、二者共同活性成分1種，見表1。

表1 絞股藍、虎杖活性成分Table 1 Active ingredient of gynostemma pentaphyllum and fallopia japonica

2.2 Sub-AS相關靶點 本研究篩選出Sub-AS相關靶點1 398個，其中GeneCards數(shù)據(jù)庫1 273個、OMIM數(shù)據(jù)庫125個。刪重、合并后得到1 321個Sub-AS相關靶點。

2.3 絞股藍-虎杖治療Sub-AS的潛在靶點 分析絞股藍、虎杖與Sub-AS相關靶點，共得到97個絞股藍-虎杖治療Sub-AS的潛在靶點，見圖2。

圖2 絞股藍-虎杖治療Sub-AS潛在靶點的韋恩圖Figure 2 Venn diagram of potential targets of gynostemma pentaphyllum and fallopia japonica in the treatment of Sub-AS

2.4 絞股藍-虎杖治療Sub-AS的關鍵靶點 將97個絞股藍-虎杖治療Sub-AS的潛在靶點上傳至STRING平臺，初步構建一個包含97個節(jié)點、511條邊、平均節(jié)點度值為10.5、平均局部聚類系數(shù)為0.466的PPI網(wǎng)絡。使用“Network Analyzer”進行網(wǎng)絡拓撲分析，結果顯示，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白介素（interleukin，IL）6、IL4、IL10、IL1B、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）A、基質金屬蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP）9、CXCL8、CCL2、細胞間黏附分子（intercellular cell adhesion molecule，ICAM）1、RELA是絞股藍-虎杖治療Sub-AS的關鍵靶點，見表2。

表2 多種拓撲計算方法中排名前20的關鍵節(jié)點Table 2 Top 20 key nodes in various topology calculation methods

2.5 GO功能富集分析 應用Metascape平臺對絞股藍-虎杖治療Sub-AS的核心靶點進行GO主要功能注釋，結果顯示，CC條目91個，主要包括膜筏、受體復合體、外側細胞膜、細胞外基質等；MF條目128個，主要涉及信號受體調節(jié)活動、氧化還原反應等；BP條目253個，主要包括正調控細胞運動、調控細胞附著、負調控細胞分化等。

2.6 KEGG通路富集分析 通過Cytoscape 3.9.1軟件對絞股藍-虎杖治療Sub-AS的核心靶點進行KEGG通路富集分析和可視化分析，結果顯示，核心靶點主要參與的通路有TNF信號通路、IL-17信號通路、脂質及動脈粥樣硬化、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路等。

2.7 藥物活性成分-疾病靶點-通路網(wǎng)絡構建 結合藥物活性成分、疾病靶點、PPI網(wǎng)絡及可能參與Sub-AS的前10條KEGG通路，構建了一個包含39個節(jié)點和184條邊的絞股藍-虎杖活性成分-疾病靶點-通路網(wǎng)絡，見圖3。其中度值最高的藥物活性成分是槲皮素，其次為木犀草素、β-谷甾醇，見表3；度值最高的疾病靶點是HSP90AB1，其次是PTGS2、RELA、TNF、IL6、IL1B、ICAM1，見表4；富集的通路主要包括IL-17信號通路和癌癥通路，其次是脂質和動脈硬化、流體剪切應力與動脈粥樣硬化，見表5。

圖3 絞股藍-虎杖活性成分-疾病靶點-通路網(wǎng)絡Figure 3 Network of active component-disease target-pathway of gynostemma pentaphyllum-fallopia japonica

表3 絞股藍-虎杖主要活性成分網(wǎng)絡節(jié)點特征參數(shù)Table 3 Characteristic parameters of main active components network node of gynostemma pentaphyllum-fallopia japonica

表4 絞股藍-虎杖主要靶點網(wǎng)絡節(jié)點特征參數(shù)Table 4 Characteristic parameters of main target network node of gynostemma pentaphyllum-fallopia japonica

表5 絞股藍-虎杖治療Sub-AS的關鍵靶點KEGG通路富集分析結果Table 5 Enrichment results of the Sub-AS key target KEGG pathway treated with gynostemma pentaphyllum-fallopia japonica

2.8 分子對接結果 將篩選出的主要疾病靶點（HSP90AB1、PTGS2、RELA、TNF、IL6、IL1B、ICAM1、VEGFA、CCL2、MMP9、CXCL8）分別與虎杖、絞股藍核心活性成分（槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇）進行分子對接，結果顯示，平均Affinity為-7.2 kcal/mol，其中Affinity≥-7.00 kcal/mol且＜-5.00 kcal/mol占97.0%，Affinity＜-7.00 kcal/mol占48.5%，見圖4。其中槲皮素-TNF、槲皮素-PTGS2、木犀草素-PTGS2、木犀草素-ICAM1、木犀草素-HSP90AB1的對接模式較好，見圖5。

圖4 分子對接熱圖Figure 4 Molecular docking thermogram

圖5 結合活性較高的藥物活性成分與靶點分子對接模式Figure 5 Docking mode between active components of drugs with high binding activity and target molecules

3 討論

Sub-AS一般指存在AS斑塊證據(jù)但無重要動脈明顯狹窄，且無明顯臨床表現(xiàn)的一種亞臨床狀態(tài)，其病理表現(xiàn)為動脈彈性減弱、血管僵硬度增加，但其是心腦血管疾病的重要危險因素和預測因子[28]。目前，Sub-AS的發(fā)病率尚無具體數(shù)據(jù)。早期識別并積極干預Sub-AS能有效延緩AS進展、預防心腦血管疾病的發(fā)生，這也正好契合了中醫(yī)“未病先防、欲病早治”的理念。中醫(yī)學認為，Sub-AS的病機為本虛標實，是諸多復雜病因作用于本虛之體，瘀、痰、毒內蘊，三者相互膠著，進而促使疾病的發(fā)生和進展。Sub-AS的治療應以“讓濁歸清”為原則，同時兼顧治病求本、滋養(yǎng)臟腑[29]。絞股藍可入肺、脾、腎經(jīng)，其在清熱化痰的同時可健脾以壯中州，增強脾臟化濁生血之功效；此外，其還可以滋陰補腎、固護元氣?；⒄乳L于清熱解毒、活血化瘀，可入肝經(jīng)，條達氣機、通暢氣血運行。本研究利用網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術，從微觀角度分析絞股藍-虎杖抗Sub-AS的具體分子機制。

本研究結果顯示，TNF、IL6、IL4、IL10、IL1B、VEGFA、MMP9、CXCL8、CCL2、ICAM1、RELA是絞股藍-虎杖治療Sub-AS的關鍵靶點。既往研究表明，在炎癥因素刺激下，細胞黏附因子增加，單核細胞黏附于內皮細胞，血管平滑肌細胞遷移、增殖，巨噬細胞聚集在血管內膜[30]。AS早期主要表現(xiàn)為內皮下泡沫細胞積聚，在動脈管壁上形成脂肪條紋，且隨著時間推移泡沫細胞死亡并累及血管平滑肌細胞，使其分泌纖維成分，形成閉塞性纖維斑塊[31-32]。IL-10可能通過抑制活性氧中間產(chǎn)物生成而阻止或逆轉Sub-AS中的炎癥反應。RELA是NF-κB家族相關轉錄因子，其可以結合miRNA，并在抑制炎癥反應及調節(jié)內皮細胞增殖、凋亡、黏附等過程中發(fā)揮重要作用[33]。本研究分子對接結果顯示，槲皮素-TNF、槲皮素-PTGS2、木犀草素-PTGS2的對接模式較好。TNF包括TNF-α和TNF-β，其中TNF-α是一種促炎細胞因子，具有廣泛的生物學活性[34]。在TNF-α的誘導下，內皮細胞可通過NF-κB通路而促進各種趨化性細胞因子（CCL2、CXCL8等）、ICAM、VEGF的表達；此外，TNF-α還能誘發(fā)IL-6、IL-1β等的分泌，刺激MMP尤其是MMP-9的產(chǎn)生，而MMP-9又可以促進細胞外基質的過度降解，導致纖維帽變薄，從而影響斑塊的穩(wěn)定性[35]。既往研究發(fā)現(xiàn)，PTGS2受多種炎癥細胞因子調控，而中藥可通過下調AS小鼠PTGS2表達而發(fā)揮抗AS效果[36]。

本研究KEGG通路富集分析結果顯示，絞股藍-虎杖治療Sub-AS的核心靶點主要通過調控TNF信號通路、IL-17信號通路而發(fā)揮抗Sub-AS作用，其中IL-17信號通路的富集結果更明顯，HSP90AB1、PTGS2、RELA、TNF、IL6、IL1B、ICAM1、VEGFA、CCL2、MMP9、CXCL8既屬于IL-17信號通路的靶點，同時也是絞股藍-虎杖治療Sub-AS的核心靶點，故推測IL-17信號通路可能在絞股藍-虎杖治療Sub-AS中發(fā)揮重要作用。IL-17家族成員與其受體結合后可誘導下游相關信號通路如NF-κB、MAPK等介導炎癥反應，其中IL-17A、IL-17F可通過激活NF-κB信號通路而上調炎癥因子、細胞因子等的表達；TNF-α與其受體結合后，可通過激活下游的NF-κB、MAPK信號通路而進一步促進炎癥因子釋放[37]，與吳迪等[38]研究結果一致，推測絞股藍-虎杖可能通過激活NF-κB通路、抑制炎癥因子表達而發(fā)揮抗Sub-AS作用。

槲皮素是一種天然黃酮類化合物，具有多種生物學活性，如心臟保護作用、抗動脈硬化、抗氧化、抗炎、抗心肌細胞凋亡等[39]。木犀草素亦屬于黃酮類化合物[40]，其常用于治療心血管疾病。研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素主要通過抑制NF-κB活性而抑制MMP分泌，進而發(fā)揮抑制炎癥反應的作用[41]。β-谷甾醇是一種常見的植物甾醇，其在抗炎、抗氧化、免疫調節(jié)和抗腫瘤等方面具有較強的活性；此外，其還能抑制TNF-α引起的細胞黏附因子表達及RELA-NF-κB亞基磷酸化，進而影響炎性因子的釋放。既往研究證實，炎癥反應是引起斑塊不穩(wěn)定的重要原因，而抑制炎癥應答能阻止血管炎癥的發(fā)生和發(fā)展，進而有效抑制AS進展[42]。而在治療AS的中草藥中，虎杖和絞股藍具有抗炎作用[12-13]。

綜上所述，絞股藍-虎杖抗Sub-AS的主要活性成分有槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇等，其可作用于TNF、IL6等多個靶點，通過調控IL-17信號通路、TNF信號通路等發(fā)揮作用，這為后期的動物實驗或細胞實驗奠定基礎。

作者貢獻：劉福明進行文章的構思與設計，結果分析與解釋；何俊進行研究的實施與可行性分析，負責文章的質量控制及審校，并對文章整體負責、監(jiān)督管理；李佳進行數(shù)據(jù)收集、整理、分析，負責撰寫、修訂論文。

本文無利益沖突。