史喜德，陳江煒，張旭濤，李亞娟，李飛，劉峰舟

目前，內(nèi)皮細(xì)胞缺血/再灌注損傷的作用機(jī)制尚不十分清楚。微循環(huán)損傷誘發(fā)的炎癥反應(yīng)是缺血/再灌注損傷的主要原因，可導(dǎo)致多種血管疾病進(jìn)展[1-2]。研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞損傷是缺血/再灌注損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3-5]，當(dāng)缺血組織恢復(fù)血流再灌注時(shí)，微血管內(nèi)皮細(xì)胞首先受到損傷。線粒體鈣離子攝入蛋白1（mitochondrial calcium uptake 1，MICU1）是線粒體鈣穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)蛋白，其可參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[6-8]。既往研究證實(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞與缺血/再灌注損傷密切相關(guān)[9-10]，線粒體活性氧（reactive oxygen species，ROS）作為內(nèi)皮細(xì)胞損傷的關(guān)鍵因素可參與細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等多種生理病理過程[11]。既往研究表明，在Hela細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）中沉默MICU1表達(dá)可明顯增加ROS生成[12-13]?；诖耍狙芯坎捎萌毖跖囵B(yǎng)箱構(gòu)建內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）損傷模型，并利用MICU1腺病毒和siRNA干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞H/R損傷模型MICU1的表達(dá)，旨在探討調(diào)控MICU1表達(dá)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞H/R損傷的影響及可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間 本實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2021年12月至2022年7月。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 HUVECs和MICU1腺病毒來自西京醫(yī)院心內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室，siRNA由北京擎科生物科技有限公司合成，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、Trizol試劑、高糖DMEM培養(yǎng)基及胰蛋白酶消化液購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，胎牛血清購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自西安晶彩生物科技有限公司，白介素6（interleukin 6，IL-6）ELISA試劑盒和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factoralpha，TNF-α）ELISA試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒和PVDF膜購(gòu)自美國(guó)密理博公司，羊多抗MICU1抗體（ab-190114）、兔多抗NF-κB p65抗體（AF0246）、兔單抗β-actin抗體（AF5003）、驢抗羊二抗（A0181）、羊抗兔二抗（A0208）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Annexin V-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和DHE-ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海貝博生物科技有限公司，ROS清除劑N，N'-二甲基硫脲（N，N'-dimethylthiourea，DMTU）購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司，引物合成由西安擎科生物公司完成；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)伯樂公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司，NBS Galaxy48R二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 （1）將HUVECs分成對(duì)照組和模型組，對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng)，不加任何干預(yù)；模型組細(xì)胞構(gòu)建H/R損傷模型。檢測(cè)各組MICU1 mRNA、蛋白。（2）將HUVECs分成對(duì)照組、siCtrl+模型組及siMICU1+模型組，對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng)，不加任何干預(yù)；siCtrl+模型組細(xì)胞轉(zhuǎn)染對(duì)照小干擾RNA后構(gòu)建H/R損傷模型；siMICU1+模型組細(xì)胞轉(zhuǎn)染MICU1小干擾RNA后構(gòu)建H/R損傷模型。檢測(cè)各組MICU1蛋白、ROS、NF-κB p65蛋白、炎性因子（TNF-α和IL-6）。（3）將HUVECs分成對(duì)照組、Ad-Ctrl+模型組及Ad-MICU1+模型組，對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng)，不加任何干預(yù)；Ad-Ctrl+模型組細(xì)胞感染對(duì)照腺病毒后構(gòu)建H/R損傷模型；Ad-MICU1+模型組細(xì)胞感染MICU1腺病毒后構(gòu)建H/R損傷模型。檢測(cè)各組MICU1蛋白、ROS、NF-κB p65蛋白、炎性因子（TNF-α和IL-6）及細(xì)胞凋亡率。（4）將HUVECs分成siCtrl+模型組、siMICU1+模型組及siMICU1+DMTU+模型組，siCtrl+模型組細(xì)胞轉(zhuǎn)染對(duì)照小干擾RNA后構(gòu)建H/R損傷模型；siMICU1+模型組細(xì)胞轉(zhuǎn)染MICU1小干擾RNA后構(gòu)建H/R損傷模型；siMICU1+DMTU+模型組細(xì)胞轉(zhuǎn)染MICU1小干擾RNA后加入ROS清除劑DMTU，并構(gòu)建H/R損傷模型。檢測(cè)各組NF-κB p65蛋白、炎性因子（TNF-α和IL-6）及細(xì)胞凋亡率。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 使用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HUVECs。

1.3.3 H/R損傷模型構(gòu)建 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs鋪種于六孔板，每孔細(xì)胞數(shù)約為2.5×105個(gè)，待細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)，更換無血清DMEM培養(yǎng)基，并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至缺氧培養(yǎng)箱（氣體成分：94% N2，1% O2，5% CO2）于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，之后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至普通細(xì)胞培養(yǎng)箱，復(fù)氧6 h，構(gòu)建H/R損傷模型。

1.3.4 病毒轉(zhuǎn)染 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs鋪種于六孔板，每孔細(xì)胞數(shù)約為2.5×105個(gè)。待細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染。按照感染復(fù)數(shù)為50的條件稀釋轉(zhuǎn)染病毒，每孔轉(zhuǎn)染1 ml病毒稀釋液（含20 μl病毒和980 μl無血清DMEM培養(yǎng)基），6 h后補(bǔ)加1 ml含15%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后更換培養(yǎng)基。

1.3.5 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MICU1 mRNA細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化液消化、離心，采用Trizol試劑提取總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。將β-actin作為內(nèi)參基因，MICU1正向引物序列：5'-GGACAGTGGCTAAAGTGGAGC-3'，反向引物序列：5'-CATGAGGCGAGTGAAACCC-3'；β-actin正向引物序列：5'-ACACTGTGCCCATCTACG-3'，反向引物序列：5'-TGTCACGCACGATTTCC-3'。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，采用2-ΔΔCt法計(jì)算MICU1 mRNA表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3.6 采用Western blot法檢測(cè)MICU1蛋白、NF-κB p65蛋白 采用胰蛋白酶消化液常規(guī)消化細(xì)胞并進(jìn)行離心處理，采用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，采用BCA蛋白定量法測(cè)定細(xì)胞總蛋白濃度后將其煮沸15 min至變性。采用10% SDS-PAGE分離蛋白，在恒定電壓（100 V）條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，采用5%脫脂奶粉于室溫條件下封閉1 h，加入一抗于4 ℃孵育過夜，采用TBST緩沖液洗膜3次，加入二抗于室溫條件下孵育1 h，采用TBST緩沖液洗膜3次，采用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)MICU1蛋白、NF-κB p65蛋白。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3.7 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS 細(xì)胞經(jīng)過干預(yù)處理后，使用PBS清洗，之后加入10 μmol/L DHE熒光染料，于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min，采用PBS清洗3次后用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀于488 nm激發(fā)光、590 nm發(fā)射光波長(zhǎng)下檢測(cè)ROS。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3.8 采用ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-6 將細(xì)胞移入15 ml離心管中，500×g離心5 min，留取上清液，采用ELISA試劑盒檢測(cè)TNF-α、IL-6，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.9 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 采用不含EDTA的胰蛋白酶消化液常規(guī)消化六孔板中的內(nèi)皮細(xì)胞，然后采用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加400 μl Binding Buffer輕輕重懸細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個(gè)/ml。在細(xì)胞懸液中加入5 μl Annexin V-PE，室溫避光孵育15 min后加入10 μl 7-AAD染料，輕柔混勻，于4 ℃避光孵育5 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)皮細(xì)胞H/R損傷模型MICU1表達(dá)情況 模型組MICU1 mRNA、蛋白低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1、表1。

圖1 對(duì)照組和模型組MICU1蛋白表達(dá)的SDS-PAGE圖Figure 1 SDS-PAGE map of MICU1 protein expression in control group and model group

表1 對(duì)照組和模型組MICU1 mRNA、蛋白比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of MICU1 mRNA and protein between control group and model group

表1 對(duì)照組和模型組MICU1 mRNA、蛋白比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of MICU1 mRNA and protein between control group and model group

注：MICU1=線粒體鈣離子攝入蛋白1

組別 MICU1 mRNA MICU1蛋白對(duì)照組 1.00±0.08 1.00±0.05模型組 0.41±0.10 0.42±0.02 t值 8.430 17.967 P值 0.001 ＜0.001

2.2 沉默MICU1表達(dá)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞H/R損傷模型的影響

2.2.1 沉默MICU1表達(dá)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞H/R損傷模型MICU1蛋白、ROS的影響 對(duì)照組、siCtrl+模型組、siMICU1+模型組MICU1蛋白、ROS比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。siCtrl+模型組MICU1蛋白低于對(duì)照組，ROS高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；siMICU1+模型組MICU1蛋白低于siCtrl+模型組，ROS高于siCtrl+模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2、表2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)照組、siCtrl+模型組、siMICU1+模型組ROSFigure 2 ROS detected by flow cytometry in the control group，siCtrl+model group and siMICU1+model group

表2 對(duì)照組、siCtrl+模型組、siMICU1+模型組MICU1蛋白、ROS比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of MICU1 protein and ROS in the control group，siCtrl+model group and siMICU1+model group

表2 對(duì)照組、siCtrl+模型組、siMICU1+模型組MICU1蛋白、ROS比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of MICU1 protein and ROS in the control group，siCtrl+model group and siMICU1+model group

注：ROS=活性氧；a表示與對(duì)照組比較，P＜0.05；b表示與siCtrl+模型組比較，P＜0.05

組別 MICU1蛋白 ROS對(duì)照組 1.00±0.05 9.2±3.7 siCtrl+模型組 0.41±0.04a 27.8±3.2a siMICU1+模型組 0.21±0.04b 48.1±2.4b F值 297.710 113.408 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.2.2 沉默MICU1表達(dá)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞H/R損傷模型NF-κB p65蛋白、炎性因子的影響 對(duì)照組、siCtrl+模型組、siMICU1+模型組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。siCtrl+模型組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；siMICU1+模型組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6高于siCtrl+模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 對(duì)照組、siCtrl+模型組、siMICU1+模型組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of NF-κB p65 protein，TNF-α and IL-6 in the control group，siCtrl+model group and siMICU1+model group

表3 對(duì)照組、siCtrl+模型組、siMICU1+模型組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of NF-κB p65 protein，TNF-α and IL-6 in the control group，siCtrl+model group and siMICU1+model group

注：TNF-α=腫瘤壞死因子α，IL-6=白介素6；a表示與對(duì)照組比較，P＜0.05；b表示與siCtrl+模型組比較，P＜0.05

組別 NF-κB p65蛋白 TNF-α（pg/ml） IL-6（pg/ml）對(duì)照組 1.00±0.07 219±24 160±19 siCtrl+模型組 2.03±0.25a 465±28a 440±18a siMICU1+模型組 3.20±0.20b 862±29b 695±30b F值 100.739 437.589 419.720 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 上調(diào)MICU1表達(dá)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞H/R損傷模型的影響

2.3.1 上調(diào)MICU1表達(dá)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞H/R損傷模型MICU1蛋白、ROS的影響 對(duì)照組、Ad-Ctrl+模型組、Ad-MICU1+模型組MICU1蛋白、ROS比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Ad-Ctrl+模型組MICU1蛋白低于對(duì)照組，ROS高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Ad-MICU1+模型組MICU1蛋白高于Ad-Ctrl+模型組，ROS低于Ad-Ctrl+模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4、圖3。

表4 對(duì)照組、Ad-Ctrl+模型組、Ad-MICU1+模型組MICU1蛋白、ROS比較（±s，n=3）Table 4 Comparison of MICU1 protein and ROS in the control group，Ad-Ctrl+model group and Ad-MICU1+model group

表4 對(duì)照組、Ad-Ctrl+模型組、Ad-MICU1+模型組MICU1蛋白、ROS比較（±s，n=3）Table 4 Comparison of MICU1 protein and ROS in the control group，Ad-Ctrl+model group and Ad-MICU1+model group

注：a表示與對(duì)照組比較，P＜0.05；b表示與Ad-Ctrl+模型組比較，P＜0.05

組別 MICU1蛋白 ROS對(duì)照組 1.00±0.15 8.93±3.00 Ad-Ctrl+模型組 0.38±0.08a 27.80±2.20a Ad-MICU1+模型組 2.07±0.26b 18.57±2.65b F值 69.662 38.332 P值 ＜0.001 ＜0.001

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)照組、Ad-Ctrl+模型組、Ad-MICU1+模型組ROSFigure 3 ROS detected by flow cytometry in the control group，Ad-Ctrl+model group and Ad-MICU1+model group

2.3.2 上調(diào)MICU1表達(dá)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞H/R損傷模型NF-κB p65蛋白、炎性因子的影響 對(duì)照組、Ad-Ctrl+模型組、Ad-MICU1+模型組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Ad-Ctrl+模型組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Ad-MICU1+H/R組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6低于Ad-Ctrl+模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表5。

表5 對(duì)照組、Ad-Ctrl+模型組、Ad-MICU1+模型組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6比較（±s，n=3）Table 5 Comparison of NF-κB p65, TNF-αand IL-6 in the control group，Ad-Ctrl+model group and Ad-MICU1+model group

表5 對(duì)照組、Ad-Ctrl+模型組、Ad-MICU1+模型組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6比較（±s，n=3）Table 5 Comparison of NF-κB p65, TNF-αand IL-6 in the control group，Ad-Ctrl+model group and Ad-MICU1+model group

注：a表示與對(duì)照組比較，P＜0.05；b表示與Ad-Ctrl+模型組比較，P＜0.05

組別 NF-κB p65蛋白 TNF-α（pg/ml） IL-6（pg/ml）對(duì)照組 1.00±0.08 192±50 155±25 Ad-Ctrl+模型組 2.17±0.07a 537±50a 443±38a Ad-MICU1+模型組 1.28±0.66b 287±35b 247±38b F值 211.264 45.369 55.940 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3.3 上調(diào)MICU1表達(dá)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞H/R損傷模型細(xì)胞凋亡率的影響 對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（7.367±1.305），Ad-Ctrl+模型組為（26.400±0.819），Ad-MICU1+模型組為（17.533±1.250）。對(duì)照組、Ad-Ctrl+模型組、Ad-MICU1+模型組細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=207.376，P＜0.05）。Ad-Ctrl+模型組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Ad-MICU1+模型組細(xì)胞凋亡率低于Ad-Ctrl+模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)照組、Ad-Ctrl+模型組、Ad-MICU1+模型組細(xì)胞凋亡率Figure 4 Apoptosis rate detected by flow cytometry in the control group，Ad-Ctrl+model and Ad-MICU1+model group

2.4 清除ROS對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞H/R損傷模型的影響

2.4.1 清除ROS對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞H/R損傷模型NF-κB p65蛋白、炎性因子的影響 siCtrl+模型組、siMICU1+模型組、siMICU1+DMTU+模型組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。siMICU1+模型組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6高于siCtrl+模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；siMICU1+DMTU+模型組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6低于siMICU1+模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表6。

表6 siCtrl+模型組、siMICU1+模型組、siMICU1+DMTU+模型組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6比較（±s，n=3）Table 6 Comparison of NF-κB p65 protein，TNF-α and IL-6 in siCtrl+model group，siMICU1+model group and siMICU1+DMTU+model group

表6 siCtrl+模型組、siMICU1+模型組、siMICU1+DMTU+模型組NF-κB p65蛋白、TNF-α、IL-6比較（±s，n=3）Table 6 Comparison of NF-κB p65 protein，TNF-α and IL-6 in siCtrl+model group，siMICU1+model group and siMICU1+DMTU+model group

注：DMTU=N，N'-二甲基硫脲；a表示與siCtrl+模型組比較，P＜0.05；b表示與siMICU1+模型組比較，P＜0.05

IL-6（pg/ml）siCtrl+模型組 1.00±0.09 460±28 437±26 siMICU1+模型組 3.13±0.21a 861±43a 692±33a siMICU1+DMTU+模型組 2.10±0.26b 613±44b 502±28b F值 84.354 81.625 64.004 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001組別 NF-κB p65蛋白 TNF-α（pg/ml）

2.4.2 清除R O S對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞H/R損傷模型細(xì)胞凋亡率的影響 s i C t r l+模型組細(xì)胞凋亡率為（2 6.4 3 3±2.4 0 1），s i M I C U 1+模型組為（35.333±2.669），siMICU1+DMTU+模型組為（23.967±2.157）。siCtrl+模型組、siMICU1+模型組、siMICU1+DMTU+模型組細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=70.111，P＜0.05）。siMICU1+模型組細(xì)胞凋亡率高于siCtrl+模型組，siMICU1+DMTU+模型組細(xì)胞凋亡率低于siMICU1+模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)siCtrl+模型組、siMICU1+模型組、siMICU1+DMTU+模型組細(xì)胞凋亡率Figure 5 Apoptosis rate detected by flow cytometry in the siCtrl+model group，siMICU1+model group and siMICU1+DMTU+model group

3 討論

內(nèi)皮細(xì)胞損傷是缺血/再灌注損傷的關(guān)鍵，內(nèi)皮細(xì)胞可通過合成、分泌多種細(xì)胞因子（包括一氧化氮、內(nèi)皮素1、緩激肽、黏附分子）而參與炎癥反應(yīng)、凝血過程、血管舒張、氧化應(yīng)激的調(diào)控；此外，其還在維持血管生理功能及微循環(huán)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用[14-15]。因此，分析內(nèi)皮細(xì)胞損傷參與缺血/再灌注損傷的機(jī)制對(duì)心血管疾病的防治具有重要意義。

MICU1是線粒體鈣調(diào)控的關(guān)鍵分子。既往研究發(fā)現(xiàn)，高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化患者動(dòng)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中MICU1表達(dá)水平均明顯降低，提示內(nèi)皮細(xì)胞MICU1可能在心血管疾病進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用[16]，本研究結(jié)果與其相似。為了進(jìn)一步明確MICU1在內(nèi)皮細(xì)胞H/R損傷的作用及可能機(jī)制，本研究采用siRNA沉默MCIU1表達(dá)，結(jié)果顯示，siMICU1+模型組TNF-α、IL-6、細(xì)胞凋亡率高于siCtrl+模型組；采用MICU1腺病毒上調(diào)MICU1表達(dá)，結(jié)果顯示，Ad-MICU1+模型組TNF-α、IL-6、細(xì)胞凋亡率低于Ad-Ctrl+模型組，提示下調(diào)MICU1表達(dá)可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞H/R損傷模型發(fā)生炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，而上調(diào)MICU1表達(dá)的作用相反。氧化應(yīng)激是內(nèi)皮功能障礙和血管損傷的重要決定因素[17]。內(nèi)皮細(xì)胞ROS作為信號(hào)分子可參與調(diào)控細(xì)胞生命進(jìn)程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化，從而改變血管張力、導(dǎo)致血管炎癥及血管重塑，進(jìn)而影響血管疾病進(jìn)展[17-18]。既往研究證實(shí)，下調(diào)MICU1表達(dá)可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞ROS的生成[13]，但在H/R條件下，MICU1表達(dá)下調(diào)是否影響內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成尚不十分清楚。本研究結(jié)果顯示，siMICU1+模型組ROS高于siCtrl+模型組，Ad-MICU1+模型組ROS低于Ad-Ctrl+模型組，提示在H/R條件下，下調(diào)MICU1表達(dá)可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成，上調(diào)MICU1表達(dá)可抑制內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成。為了明確調(diào)控MICU1表達(dá)影響內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子釋放、細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，本研究在下調(diào)H/R損傷模型MICU1表達(dá)的同時(shí)，利用DMTU清除內(nèi)皮細(xì)胞ROS，結(jié)果顯示，siMICU1+模型組NF-κB p65蛋白高于siCtrl+模型組，siMICU1+DMTU+模型組NF-κB p65蛋白低于siMICU1+模型組，提示下調(diào)MICU1表達(dá)可導(dǎo)致依賴ROS的NF-κB通路被激活，進(jìn)而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞H/R損傷模型發(fā)生炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡。

綜上所述，下調(diào)MICU1表達(dá)可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞H/R損傷模型發(fā)生炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，而上調(diào)MICU1表達(dá)的作用相反，分析其機(jī)制可能與調(diào)控MICU1表達(dá)可影響依賴ROS的NF-κB通路激活有關(guān)。本研究揭示了MICU1參與內(nèi)皮細(xì)胞H/R損傷的潛在分子機(jī)制，MICU1有望成為內(nèi)皮細(xì)胞H/R損傷的治療靶點(diǎn)，未來仍有待進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)本研究結(jié)論。

作者貢獻(xiàn)：李飛進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)；史喜德進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析，撰寫論文；陳江煒、李亞娟進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；劉峰舟進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋；張旭濤進(jìn)行論文的修訂；李飛、劉峰舟負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，并對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。