黃 磊, 高國(guó)輝, 馬佳駿, 羅澤天, 齊 玉

(天津理工大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院, 天津 300384)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織最近的一份報(bào)告顯示,環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因素導(dǎo)致約25%的人類(lèi)死亡,相當(dāng)于每年死亡1 260萬(wàn)人[1]。各種類(lèi)型的環(huán)境污染物往往分布廣泛,難以識(shí)別和定位,合成生物學(xué)技術(shù)有望為環(huán)境中的污染物監(jiān)測(cè)和有效、有針對(duì)性地修復(fù)提供新的可能[2]。地球上人類(lèi)的工業(yè)活動(dòng)、石油泄漏、無(wú)節(jié)制地使用塑料以及電子廢物等有害物的填埋都導(dǎo)致了各類(lèi)污染物的大量釋放,如多氯聯(lián)苯(PCBs)、多環(huán)芳烴(PAHs)、揮發(fā)性有機(jī)物(VOCs)和多溴聯(lián)苯(PBBs)等。持久性有機(jī)污染物(POPs)由于被固體顆粒吸附的速度比其溶解在水中的速度更快,因此可能通過(guò)有毒的農(nóng)副產(chǎn)品進(jìn)入我們的食物鏈和衛(wèi)生系統(tǒng)[3]。另外,全球人口的不斷增長(zhǎng),對(duì)糧食的需求不斷提高,也強(qiáng)化了修復(fù)受污染場(chǎng)地的重要性[4]。合成生物學(xué)是將工程、科學(xué)和技術(shù)應(yīng)用于編輯生物體的遺傳物質(zhì),進(jìn)而執(zhí)行新的功能的一門(mén)學(xué)科[5]。這可以為應(yīng)對(duì)當(dāng)前環(huán)境挑戰(zhàn)提供強(qiáng)有力的解決方案。規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列(Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats,CRISPR)技術(shù)在基因工程細(xì)菌和古細(xì)菌的生物修復(fù)中得到了廣泛應(yīng)用,生物修復(fù)領(lǐng)域也出現(xiàn)了很多新的先進(jìn)技術(shù),包括生物膜工程、人工微生物群落的構(gòu)建、基因驅(qū)動(dòng)、酶和蛋白質(zhì)工程等。生物修復(fù)中基因工程微生物的環(huán)境安全問(wèn)題是這一領(lǐng)域研究的關(guān)鍵,包括基因工程微生物與本土微生物群落的基因水平相互作用、對(duì)非目標(biāo)微生物群落的選擇壓力以及抗生素抗性基因的意外擴(kuò)散等[6]。

1 基因工程中的合成生物學(xué)工具

建立一個(gè)基因工程系統(tǒng)需要一個(gè)合適的底盤(pán)細(xì)胞和基因編輯工具來(lái)控制和監(jiān)測(cè)基因的重組。在合成生物學(xué)技術(shù)的幫助下,生物修復(fù)的最新趨勢(shì)是應(yīng)用非模式化生物作為宿主,利用CRISPR作為基因編輯工具,生物遺傳電路作為工程化工具,來(lái)去除環(huán)境中的污染物[7]。根據(jù)代謝途徑的可行性和實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)的便利性,微生物可以被分為模式和非模式生物兩種類(lèi)型,其中第一類(lèi)是大多數(shù)合成生物學(xué)工作優(yōu)先考慮的對(duì)象。然而,非模式生物由于其具有獨(dú)特的基于代謝途徑、碳源利用和對(duì)極端環(huán)境天然抗性的選擇性污染物降解能力,近年來(lái)在生物修復(fù)研究中得到了廣泛關(guān)注。盡管由于基因組GC含量高給非模式生物的基因改造帶來(lái)了相當(dāng)大的限制,但科學(xué)界通過(guò)發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)新的遺傳組分 (如報(bào)告基因、穿梭載體、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和啟動(dòng)子),成功地解決了一些物種的相關(guān)問(wèn)題[8]。本文后續(xù)將討論用于生物修復(fù)的合成生物學(xué)工具的具體類(lèi)別,包括基因驅(qū)動(dòng)和CRISPR工具,生物遺傳電路,酶和蛋白質(zhì)工程以及一些新的生物修復(fù)技術(shù)。

1.1 基因驅(qū)動(dòng)和CRISPR工具

基因驅(qū)動(dòng)是一種新的可用于大規(guī)模污染的生物修復(fù)策略,它可以使特定的優(yōu)勢(shì)基因在整個(gè)微生物群落或單個(gè)物種中擴(kuò)散[9]。之前,石油衍生物污染地點(diǎn)的生物修復(fù)主要應(yīng)用水平基因轉(zhuǎn)移技術(shù),主要是通過(guò)接種攜帶有效降解基因(alma、xylE、p450cam)的大腸埃希菌(Escherichiacoli)到被污染的沉積物中。因?yàn)闆](méi)有外來(lái)物種干擾生態(tài)系統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn),所以將降解基因轉(zhuǎn)移到原位微生物群落中是可行的。這使得原位微生物群落獲得了相關(guān)的降解基因,進(jìn)而去除了石油烴類(lèi)物質(zhì)[10]。

有多種基因編輯技術(shù)可以作為人工分子剪刀在特定位點(diǎn)切割DNA,包括TALEN、ZFN和CRISPR。其中CRISPR技術(shù)應(yīng)用于細(xì)菌系統(tǒng)是最有效和直接的。它最顯著的優(yōu)勢(shì)是能夠應(yīng)用于多個(gè)位點(diǎn),并且高效地實(shí)現(xiàn)常見(jiàn)的基因工程目的,包括插入、刪除、替代和位點(diǎn)突變[11]。CRISPR工具包主要應(yīng)用于假單胞菌(Pseudomonas)和大腸埃希菌等模式微生物。目前,其應(yīng)用也已擴(kuò)展到非模式生物,如橡膠紅球菌 (Rhodococcusruber)TH、睪酮單胞菌(Comamonastestosteroni)和無(wú)色桿菌(Achromobactersp.)HZ01[6]。天津理工大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院生物化工課題組(本課題組)也應(yīng)用CRISPR技術(shù)對(duì)芽胞桿菌屬(Bacillus)進(jìn)行了改造,以期提高芽胞桿菌未來(lái)的應(yīng)用潛力[12-13]。最近,又開(kāi)發(fā)出多種基于CRISPR技術(shù)的極端微生物基因修飾系統(tǒng),包括嗜熱菌、嗜酸菌和嗜鹽菌,這些系統(tǒng)可以在利用微生物進(jìn)行生物修復(fù)研究中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14]。CRISPR也被應(yīng)用于產(chǎn)生物表面活性劑的微生物,以提升其降解芳香烴和農(nóng)藥的生物電動(dòng)力學(xué)修復(fù)系統(tǒng)效率[15]。

CRISPR干擾(CRISPRi)這種工程學(xué)工具,可以通過(guò)下調(diào)不利基因的表達(dá),調(diào)節(jié)相應(yīng)的代謝通量來(lái)過(guò)表達(dá)所需的目的產(chǎn)物[16]。相反,CRISPR激活(CRISPRa)工具可以使生物體能夠上調(diào)所需的目的基因[16]。例如,DeLorenzo等[17]報(bào)道了CRISPRi工具的應(yīng)用,在非模式木質(zhì)纖維素分解細(xì)菌渾濁紅球菌(Rhodococcusopacus) PD630中構(gòu)建了第一個(gè)靶向基因表達(dá)抑制系統(tǒng)。

總的來(lái)說(shuō),CRISPR在生物修復(fù)中的應(yīng)用很廣泛,但其在增強(qiáng)生物去除、抗逆性和優(yōu)化生物降解途徑方面的研究較少,值得未來(lái)進(jìn)一步關(guān)注。CRISPR技術(shù)在生物修復(fù)中的早期應(yīng)用之一是靶向基因的敲除和導(dǎo)入,這有助于研究人員驗(yàn)證特定基因的作用和功能。在Gallo等[18]最近的一項(xiàng)研究中,通過(guò)使用Thermo-Cas9工具進(jìn)行靶向基因敲除證實(shí)了亞砷酸鹽抗性基因(TtarsM)對(duì)嗜熱細(xì)菌(Thermusthermophilus) HB27解毒系統(tǒng)的作用。這些靶向基因敲除方法也可以提高非模式生物中CRISPR工具的編輯效率,進(jìn)一步為CRISPRi和CRISPRa以及多重基因組編輯進(jìn)行代謝途徑改造提供了可能[19]。

目前一些研究表明,應(yīng)用CRISPR技術(shù)可以通過(guò)生物轉(zhuǎn)化的方式將一些工業(yè)廢物轉(zhuǎn)化為高附加值產(chǎn)品。在針對(duì)木質(zhì)纖維素的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中,科學(xué)家引入了一種基于CRISPR的過(guò)表達(dá)木質(zhì)素分解酶蛋白的工程技術(shù)[20]。另一個(gè)受益于CRISPR的生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域是將CO、CO2和CH4(也稱(chēng)為C-1氣體)等溫室氣體發(fā)酵生成各種附加值產(chǎn)品。許多產(chǎn)醋酸菌的大規(guī)模應(yīng)用都受到其生長(zhǎng)速度和一碳?xì)怏w產(chǎn)量低的制約,最近CRISPR介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)顯示出克服這一限制的可能性。永達(dá)梭菌(Clostridiumljungdahlii)和石灰真桿菌(Eubacteriumlimosum)是兩種主要進(jìn)行CRISPR介導(dǎo)基因編輯的產(chǎn)乙酸菌[21]。例如,在永達(dá)梭菌中利用兩個(gè)啟動(dòng)子(Pthl、ParaE)表達(dá)Cas9和sgRNA并刪除4個(gè)基因(pta、adhE1、ctf和pyrE),這樣既提升了菌株的生長(zhǎng)速度也促進(jìn)了C-1氣體發(fā)酵生成乙酸和乙醇[22]。將CRISPRi工具箱應(yīng)用于永達(dá)梭菌還可以增強(qiáng)溫室氣體發(fā)酵產(chǎn)丁酸的效率并減少相關(guān)碳源進(jìn)入產(chǎn)乙醇支線途徑的量[23]。

由于序列與目標(biāo)位置相似,因此會(huì)導(dǎo)致在不需要的位置發(fā)生DNA切割,這種現(xiàn)象稱(chēng)為脫靶,脫靶也是CRISPR基因修飾廣泛應(yīng)用的主要挑戰(zhàn)之一[24]。在開(kāi)發(fā)基于CRISPR基因驅(qū)動(dòng)的生物修復(fù)時(shí)要注意這部分情況,防止對(duì)自然生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響。目前為止,為了確保CRISPR基因工程和基因驅(qū)動(dòng)的安全性,全世界范圍已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多相應(yīng)策略(表1)。

包括國(guó)家圖書(shū)館在事業(yè)發(fā)展、資源建設(shè)、信息組織、服務(wù)創(chuàng)新、技術(shù)應(yīng)用、管理體制改革以及國(guó)家數(shù)字圖書(shū)館建設(shè)等方面的歷程與新的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，并為其未來(lái)發(fā)展探討思路、提供參考借鑒。

表1 針對(duì)工程物種的生物安全方法

1.2 遺傳電路

遺傳電路類(lèi)似于普通電路,主要由以下幾種分子基因設(shè)計(jì)和構(gòu)建,包括報(bào)告基因、代謝基因、啟動(dòng)子、復(fù)制子和選擇性標(biāo)記。這些元件可以用來(lái)改變細(xì)胞行為,提高代謝產(chǎn)量或監(jiān)測(cè)后續(xù)的代謝活動(dòng)。構(gòu)建合適的遺傳電路最重要的是選擇合適的遺傳元件。例如,缺乏報(bào)告系統(tǒng)和可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子會(huì)降低產(chǎn)乙酸工程菌利用空氣污染物轉(zhuǎn)化為附加值產(chǎn)品的能力。因此,對(duì)于遺傳重組,表征新的和有效的遺傳組分是至關(guān)重要的[20]。例如,耐重金屬貪銅菌 (Cupriavidusmetallidurans) CH34是一種多用途化能自養(yǎng)微生物,可用于芳香族化合物的降解、廢水生物發(fā)電和貴金屬的生物礦化。開(kāi)發(fā)高效的可誘導(dǎo)或組成型啟動(dòng)子有助于控制蛋白質(zhì)生產(chǎn)和優(yōu)化CRISPR編輯效率[26]。

遺傳電路的應(yīng)用也可以與CRISPRi相結(jié)合來(lái)建立轉(zhuǎn)錄邏輯門(mén),通過(guò)電路輸出結(jié)果來(lái)控制細(xì)胞行為,如糖分消耗等[26]。目前,在乙酸菌中已經(jīng)成功實(shí)施這一策略,這樣可以將代謝活動(dòng)與環(huán)境變化聯(lián)系起來(lái),例如考察pH的改變與底物生長(zhǎng)濃度變化的關(guān)系等[21]。

1.3 酶與蛋白質(zhì)工程

復(fù)雜結(jié)構(gòu)環(huán)境污染物的生物處理,如紙漿廢水中的木質(zhì)素、農(nóng)藥、芳香烴和塑料,都依賴(lài)于微生物降解酶的強(qiáng)大活性。然而,這些酶的自然產(chǎn)量不足,但可以通過(guò)遺傳操縱增強(qiáng)酶的表達(dá)量[27]。目前,很多工具被用于基因工程生物修復(fù)系統(tǒng)酶的優(yōu)化,包括理性、半理性設(shè)計(jì)和定向進(jìn)化[20]。通過(guò)替換活性部位中的官能團(tuán)對(duì)羧化酶進(jìn)行合理的重組,可將一種劇毒的苯酚衍生物(4-羥基苯乙烯)的生物降解率提高40%,同時(shí)將立體異構(gòu)選擇性提高39倍[28]。另一方面,定向進(jìn)化是一種基于隨機(jī)突變的非結(jié)構(gòu)性方法,已經(jīng)發(fā)展出許多新功能,例如測(cè)定生物修復(fù)應(yīng)用的真菌木質(zhì)素分解酶的極端pH抗性[20]。在酵母細(xì)胞中建立甲基化合成功能的最好方法是在過(guò)氧化物酶體中定向表達(dá)蛋白質(zhì),這在甲基化微生物的生物碳捕獲過(guò)程中尤其重要,特別是在消耗甲醇的酵母中,如解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)[29]。 除上述方法之外,當(dāng)具有污染物降解能力的基因在微生物宿主中表達(dá)時(shí),重組DNA和異源表達(dá)技術(shù)也可以用于大規(guī)模酶的生產(chǎn)和純化,通過(guò)定點(diǎn)誘變方法,底物的活性和范圍得到了改善[30]。對(duì)不可培養(yǎng)環(huán)境樣本的宏基因組分析也有助于研究人員發(fā)現(xiàn)編碼具有特定功能的降解酶的新基因[30]。

1.4 優(yōu)勢(shì)突變的快速篩選與選擇

采用實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性馴化(ALE)技術(shù),建立了一種新的快速鑒定有益突變體的篩選方法。這可以促進(jìn)后續(xù)的逆向工程和構(gòu)建高污染物耐受性降解菌株的發(fā)展。傳統(tǒng)意義上,全基因組測(cè)序是在菌株逐步適應(yīng)有毒物質(zhì)或次生長(zhǎng)條件后進(jìn)行的,以揭示菌株的遺傳變化[31]。然而,在ALE期間多重突變的出現(xiàn)使得定位突變基因變得困難且耗時(shí)。應(yīng)用快速優(yōu)勢(shì)突變篩選與選擇(RAMSES)方法,在指數(shù)生長(zhǎng)期向培養(yǎng)物中加入突變的DNA會(huì)導(dǎo)致DNA通過(guò)等位基因的置換而摻入染色體中,然后在增加選擇壓力的情況下進(jìn)行突變株的篩選,此時(shí)只有優(yōu)勢(shì)突變株才能生長(zhǎng)[32]。一些科學(xué)家利用這種方法來(lái)表征木質(zhì)素降解菌(Acinetobacterbaylyi) ADP1在暴露于高濃度阿魏酸鹽(一種木質(zhì)素衍生芳香化合物)后的有益突變。他們進(jìn)一步用有益的突變(基因hcaE、hcaK)來(lái)改造細(xì)菌,以提高其對(duì)阿魏酸鹽的耐受性[32](圖1)。

圖1 貝利不動(dòng)桿菌ADP1中可能的芳香酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)示意圖[32]Fig.1 Schematic of possible aromatic acid transport systems in Acinetobacter baylyi ADP1[32]藍(lán)色：轉(zhuǎn)運(yùn)體;綠色：孔道蛋白。虛線箭頭表示多個(gè)步驟blue： transporters; green： porins. The dashed arrow refers to multiple steps

2 生物修復(fù)應(yīng)用方面的最新成就

生物修復(fù)研究工作始于基本的原位修復(fù)技術(shù),如生物強(qiáng)化、生物隔離、生物通風(fēng),以及非原位方法,如堆肥、土地耕作、生物堆填和生物反應(yīng)器[8]。這些方法主要應(yīng)用于一些未改造的生物體,進(jìn)而減輕相應(yīng)的環(huán)境污染程度。后續(xù)研究人員開(kāi)始評(píng)估新的天然生物酶、分離不同的微生物,并且運(yùn)用簡(jiǎn)單的基因編輯方法進(jìn)行生物改造。目前采用合成生物學(xué)新技術(shù)(如生物膜工程及合成微生物群落)已經(jīng)成功突破了生物修復(fù)屏障。

2.1 生物膜工程

生物膜工程是生物修復(fù)領(lǐng)域的一項(xiàng)最新發(fā)現(xiàn),該技術(shù)旨在減弱有毒金屬、烴類(lèi)化合物及農(nóng)藥在自然界中的影響并進(jìn)而克服天然生物膜的局限性。合成生物膜主要通過(guò)整合信號(hào)通路、代謝途徑工程及胞外聚合物(EPS)重排設(shè)計(jì)完成[33]。生物膜的再生能力使其能夠可持續(xù)利用,EPS組成的可控性使其能夠滿(mǎn)足各種生物修復(fù)的目的。生物浸出(從固體基質(zhì)中溶解重金屬)、金屬腐蝕抑制及利用微生物燃料電池(MFC)處理廢水是一些傳統(tǒng)的生物修復(fù)應(yīng)用,而生物膜工程可以對(duì)其做進(jìn)一步的改進(jìn)。例如,建立選擇性汞解毒系統(tǒng),其中汞檢測(cè)器(MerR啟動(dòng)子)會(huì)在大腸埃希菌中組成型表達(dá)。然后,通過(guò)一種名為Curli的合成納米纖維動(dòng)態(tài)隔離游離的汞[34]。此外,通過(guò)用稀土結(jié)合標(biāo)簽修飾的Curli纖維,可以制備對(duì)稀有元素(Tb3+)具有選擇性吸附能力的功能性生物膜[35]。這些研究說(shuō)明了如何利用工程化生物膜從廢水和固體廢物中選擇性地回收重金屬。未來(lái)合成生物膜的環(huán)境研究方向包括更大規(guī)模的試驗(yàn)、響應(yīng)電路的優(yōu)化、將相關(guān)研究從蛋白質(zhì)研究擴(kuò)展到其他生物膜成分(如多糖和核酸)上[33]。

2.2 合成微生物群落

通過(guò)在人為選擇的微生物群落中找到所需的優(yōu)良性狀,可以極大地提高生物修復(fù)水平[36]。合成微生物群落包括具有預(yù)期性質(zhì)的特定菌株的共同培養(yǎng),在這種設(shè)定中,每個(gè)微生物都可以部分參與降解途徑。因此,可以避免單一菌株的過(guò)度工程化及其相關(guān)的代謝負(fù)擔(dān)。Jia等[37]成功構(gòu)建了一個(gè)雙基因工程菌群落,其中大腸埃希菌HY1被接入4個(gè)表達(dá)菲雙加氧酶的基因,而銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) PH2中導(dǎo)入一個(gè)高效的兒茶酚雙加氧酶基因,使兩株菌各自負(fù)責(zé)菲降解途徑的一部分,從而共同降解目標(biāo)污染物,這與單獨(dú)培養(yǎng)相比,共培養(yǎng)體系有利于菌株的長(zhǎng)期共存,對(duì)菲的去除效率更高。此外,了解微生物群落成員之間的合作效應(yīng)可以為發(fā)現(xiàn)新的酶和生物降解途徑開(kāi)辟道路,從而實(shí)現(xiàn)更高效的污染物去除[38]。

如何保持微生物群落結(jié)構(gòu)在生態(tài)學(xué)和進(jìn)化上的穩(wěn)定性是該領(lǐng)域急需解決的問(wèn)題之一。最近Schlembach等[42]引入了各種在線和離線監(jiān)測(cè)以及控制混合培養(yǎng)動(dòng)態(tài)的測(cè)量技術(shù)。例如應(yīng)用繁殖體策略來(lái)評(píng)估兩個(gè)人工構(gòu)建的細(xì)菌群落的可重復(fù)性及功能穩(wěn)定性[43]。最近也有綜述總結(jié)了用于工程化合成微生物群落的可用工具包,包括群體感應(yīng)信號(hào)分子、誘導(dǎo)劑及共養(yǎng)相互作用[44]。

最近在共培養(yǎng)方法上改進(jìn)的空間連接微生物群落(SLMC),為建立具有不相容生理需求的合成微生物群落提供了可能 (例如嗜酸菌與嗜堿菌、需氧菌與厭氧菌的共培養(yǎng)),而這是使用傳統(tǒng)技術(shù)不可能實(shí)現(xiàn)的。SLMC涉及到的是工程化培養(yǎng)環(huán)境,而不是微生物菌株本身,并在互聯(lián)模塊內(nèi)共同培養(yǎng)不同種類(lèi)的微生物[45]。SLMC使不相容菌株之間的代謝物可以進(jìn)行交換,并在選擇微生物群落組成方面提供了更大的靈活性。然而,控制每個(gè)模塊和通量交換中的群體大小仍具有挑戰(zhàn)性,并且限制了該技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用[45]。

2.3 土壤的生物修復(fù)

土壤修復(fù)的物理和化學(xué)途徑包括土壤挖掘和溶劑清洗,而這可能會(huì)破壞土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)、養(yǎng)分循環(huán)和有機(jī)質(zhì)儲(chǔ)存,進(jìn)而對(duì)土壤質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響[46]。因此,生物修復(fù)作為一種低成本、省人力、省能源、無(wú)二次污染的治理方法推廣就顯得尤為重要。主要土壤污染物生物修復(fù)的最新趨勢(shì)見(jiàn)表2。

表2 用于土壤生物修復(fù)的基因工程微生物

2.3.1 重金屬的去除 有多種方法可以減輕重金屬對(duì)環(huán)境的威脅,其中可持續(xù)性、環(huán)境友好的選擇包括生物淋濾(萃取和溶解)、生物吸附、生物還原(納米顆粒生物合成)、生物礦化(沉淀和固定)、植物修復(fù)等。也有一些新型的方法,如綁定多肽和鐵載體應(yīng)用[67]。但所需時(shí)間較長(zhǎng)而且金屬去除率不足限制了這些工藝的大規(guī)模應(yīng)用。因此,合成生物學(xué)家開(kāi)始通過(guò)修飾活的有機(jī)體系統(tǒng)來(lái)應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)[68]。提高生物修復(fù)菌株對(duì)重金屬的耐受性是提高處理速度和效率的常見(jiàn)做法,其中提高耐受性的方法之一是插入重金屬抗性基因。Li等[69]在大腸埃希菌中表達(dá)豆梨中的植物螯合素合酶基因PcPCS1,使大腸埃希菌能耐受200 μmol/L的Hg2+,且能夠在100 μmol/L的含Hg2+培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)。相比于野生型大腸埃希菌只能積累0.49 mg/g的Hg2+,轉(zhuǎn)PcPCS1基因的大腸埃希菌對(duì)Hg2+的積累量增加到了0.82 mg/g。最近也發(fā)現(xiàn)了幾種提高微生物對(duì)銅耐受性的工程化策略[70]。而對(duì)酸硫桿菌屬(Acidithiobacillusspp.)來(lái)說(shuō),尋找基因重組所需的合適遺傳元件是非常重要的。一種已經(jīng)確定了監(jiān)測(cè)基因表達(dá)和調(diào)控方法的高效報(bào)告基因,可應(yīng)用于所有酸性硫桿菌[71]。此前,研究人員曾應(yīng)用遺傳工具尋求其他類(lèi)型的微生物底盤(pán)細(xì)胞,如異養(yǎng)菌、藍(lán)藻和甲烷氧化菌[50]。合成生物學(xué)工具在金屬的生物回收中的應(yīng)用尚處于起步階段。上述微生物過(guò)程的進(jìn)一步改進(jìn)可以為綠色有效的修復(fù)金屬污染和從電子廢物等危險(xiǎn)固體廢物中回收金屬提供新的可能。

2.3.2 烴類(lèi)化合物的降解 合成生物學(xué)對(duì)烴類(lèi)化合物生物修復(fù)的影響越來(lái)越大。烴類(lèi)化合物包括多環(huán)芳烴、石油及其衍生物、六氯環(huán)己烷(HCH)、芳香族染料、氯代烷烴、多氯聯(lián)苯和有機(jī)鹵化物[72]。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)促進(jìn)多環(huán)芳烴等化合物的生物降解策略包括：在基因表達(dá)調(diào)控的基礎(chǔ)上,尋找相關(guān)生長(zhǎng)與降解基因以及與降解相關(guān)的酶基因,提高生物催化劑的活性,并構(gòu)建新的降解途徑[73]。最近,合成生物學(xué)工具已成功用于操縱大腸埃希菌中的基因表達(dá),并優(yōu)化芳香族污染物的生物修復(fù)以及硝基烷烴氧化酶(NOE)在兩個(gè)嗜熱細(xì)菌中的同源和異源過(guò)表達(dá)[74]。另外,Wang等[75]在大腸埃希菌BL21中重建了苯酚完全生物降解的人工代謝途徑,其中苯酚被苯酚羥化酶降解為兒茶酚,然后通過(guò)環(huán)裂解轉(zhuǎn)化為粘康酸,最后在三羧酸(TCA)循環(huán)中徹底分解。本課題組目前主要以已篩選得到的苯系物高效降解菌為底盤(pán)細(xì)胞構(gòu)建多環(huán)芳烴降解通路并提高其耐鹽能力,使其能夠應(yīng)用于混合污染鹽漬化土壤的生物修復(fù)[76-77]。能夠降解聚氨酯(PU)的微生物包括假單胞菌、芽胞桿菌、不動(dòng)桿菌、棒狀桿菌(Corvnebacterium)等細(xì)菌和曲霉(Aspergillus)、擬青霉(Pestalotiopsis)、枝孢霉(Cladosporium)、鐮刀菌(Fusarium)、青霉菌(Penicillium)等真菌,其中曲霉菌在PU解聚中顯示出最強(qiáng)大的能力[78]。導(dǎo)致PU分解的微生物酶主要有水解酶(蛋白水解酶)、酯酶、尿酶和酰胺酶。

2.3.3 塑料的降解 塑料的微生物降解是一個(gè)酶促過(guò)程,目前已經(jīng)分離篩選得到多種降解塑料的微生物,包括放線菌、藻類(lèi)、細(xì)菌和真菌[79]。合成生物學(xué)中的不同方法如宏基因組學(xué)、克隆和計(jì)算方法等都已被用來(lái)增強(qiáng)假單胞菌屬、埃希氏菌屬和芽胞桿菌屬物種在塑料酶促解聚中的能力[79]。塑料生物降解的大多數(shù)工程研究都集中在修飾編碼有效降解酶基因上,假單胞菌是細(xì)菌宿主克隆有效降解酶方面研究最多的菌株之一[80]。然而,非細(xì)菌宿主最近也吸引了研究者的注意力。聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯因其具有較強(qiáng)的解聚性和難水解性,是近20年來(lái)生物修復(fù)研究者研究最多的塑料。一項(xiàng)新的研究報(bào)告表明通過(guò)在遺傳宿主中表達(dá)阪崎氏菌(Sdeonellasakaisis)中的一個(gè)關(guān)鍵酶(PETase),實(shí)現(xiàn)了三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)作為藻類(lèi)遺傳宿主成功在低成本生長(zhǎng)條件下將聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)降解(圖2a)[81]。最近,對(duì)角質(zhì)酶的熱穩(wěn)定性和活性的研究促進(jìn)了PET的降解,使其生物降解率超過(guò)了90% (比以前發(fā)現(xiàn)的酶高出33倍)[82]?？梢酝ㄟ^(guò)分子對(duì)接和結(jié)合模式分析確定氨基酸殘基的突變,從而提高酶的催化活性。為了解釋來(lái)自垃圾填埋場(chǎng)裂解聚醚-聚氨酯(PE)-PU塑料的微生物群落的作用機(jī)制,Gaytán采用了一種新的結(jié)合物理和化學(xué)分析手段的元基因組方法(基于就近連接)(圖2b)[83]。研究結(jié)果揭示了每個(gè)物種的降解基因和降解酶,為了解每個(gè)物種如何增強(qiáng)和促進(jìn)塑料的生物降解提供了新的思路。最近,Carr等[84]也提供了在本土菌群中確定的聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)水解酶的清單。

圖2 合成生物學(xué)技術(shù)對(duì)塑料的降解Fig.2 Degradation of plastics by synthetic biology techniquesa：AP_SP-PETase-FLAG蛋白示意圖和PETase-GFP表達(dá)圖;b：BP8細(xì)胞培養(yǎng)后附著在聚醚-聚氨酯-丙烯酸酯上的掃描電子顯微鏡圖a：Schematic of AP_SP-PETase-FLAG protein, and PETase GFP expression diagram;b： Scanning electron microscopy image of BP8 cells attaching to olyether-polyurethane-acrylate after cultivation

2.3.4 農(nóng)藥的降解 近年來(lái),人們應(yīng)用了不同的策略來(lái)提升農(nóng)藥的生物修復(fù)效率,一般把重點(diǎn)放在人工選擇微生物群落上,利用適應(yīng)性基因丟失、代謝負(fù)荷分解、酶工程和群體感應(yīng)來(lái)加強(qiáng)殺蟲(chóng)劑的去除。Li等[85]開(kāi)發(fā)了一種合成微生物群落(PSC-1)來(lái)有效降解七種持久性農(nóng)藥：毒死蜱、吡蟲(chóng)啉、多菌靈、百菌清、λ-氯氟氰菊酯、β-氯氰菊酯和溴氰菊酯[86]。有機(jī)磷化合物(OPCs)是廣泛分布的一類(lèi)殺蟲(chóng)劑,在最近的一項(xiàng)研究中,設(shè)計(jì)了一種有機(jī)磷酸酯水解酶(OPH)來(lái)改善OPCs的降解。定點(diǎn)突變可以提高OPH水解酶的立體異構(gòu)選擇性。蛋白質(zhì)融合、固定化和化學(xué)修飾等工程方法可以提高其催化性能、酶穩(wěn)定性和底物親和力[87]。在某些情況下,可以將一個(gè)完整的生物降解途徑導(dǎo)入到新菌株并整合進(jìn)染色體中。Zhao等[88]采用一種新的構(gòu)建生物降解途徑的策略,實(shí)現(xiàn)了γ-六氯環(huán)己烷(γ-HCH) (一種有機(jī)氯農(nóng)藥)和1,2,3-三氯丙烷(一種有毒溶劑)的完全去除[88]。

3 展 望

環(huán)境中的污染物類(lèi)型廣泛,往往難以識(shí)別和定位。開(kāi)發(fā)新的、快速的、安全的并且具有成本效益的技術(shù)來(lái)消除它們是非常重要的。生物修復(fù)作為污染物去除技術(shù)已經(jīng)非常成功,雖然一些微生物具有較好的降解能力,但由于污染物的持久性,仍然需要對(duì)這項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化改良。多年來(lái),不同科學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)步帶來(lái)了各種降解技術(shù)的改進(jìn)。系統(tǒng)生物學(xué)、分子工具和多組學(xué)的知識(shí)是合成生物學(xué)的基礎(chǔ),它開(kāi)創(chuàng)了生物修復(fù)的新時(shí)代。對(duì)經(jīng)過(guò)基因和代謝優(yōu)化的微生物進(jìn)行分析、設(shè)計(jì)、構(gòu)建和微調(diào),可最大限度地降解污染物。

合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使得開(kāi)發(fā)生物傳感器來(lái)檢測(cè)和監(jiān)測(cè)污染物,了解微生物動(dòng)力學(xué)來(lái)構(gòu)建復(fù)合菌群以及創(chuàng)造新的代謝途徑或增強(qiáng)酶促作用成為可能。另外,仍然有必要進(jìn)行更多的現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn),以支持在實(shí)驗(yàn)室獲得的不同結(jié)果,并為工程化微生物進(jìn)入環(huán)境建立必要的安全參數(shù)。生物修復(fù)的一個(gè)重要瓶頸是現(xiàn)有方法能夠降解的污染物范圍有限。此外,生物修復(fù)可能緩慢且低效,使其在某些應(yīng)用中不切實(shí)際,而生物強(qiáng)化可通過(guò)將外源微生物引入到污染環(huán)境來(lái)幫助克服這些困難。宏基因組研究也有助于加速鑒定新酶和新的微生物。

盡管關(guān)鍵挑戰(zhàn)有待解決,但合成生物學(xué)仍有很大可能解決環(huán)境問(wèn)題和限制環(huán)境危害,同時(shí)將其轉(zhuǎn)化為環(huán)境安全的物質(zhì)。我們需要更加努力來(lái)加速?gòu)哪壳暗膫鹘y(tǒng)方法向合成生物學(xué)方法的過(guò)渡。隨著更多合成生物學(xué)方法的開(kāi)發(fā),期望設(shè)計(jì)更多的微生物來(lái)更有效地感知、量化和靶向特定的環(huán)境污染物。