鄒 芬, 何烈干, 李湘民, 黃瑞榮, 馬輝剛

(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 南昌 330200)

芋Colocasiaesculenta(L.)Schott為天南星科芋屬作物,在世界熱帶濕潤(rùn)地區(qū)大量種植[1],在我國(guó)則主產(chǎn)于廣西、廣東、福建等地[2]。芋富含糖類、蛋白質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[3],是一些發(fā)展中國(guó)家的重要主食作物[4],據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織報(bào)道芋現(xiàn)已成為全球消耗量排名第五的塊根類蔬菜[5]。為助力產(chǎn)業(yè)扶貧,江西九江永修縣在2018年首次引進(jìn)種植了約1 333 m2檳榔芋。2020年6月-7月,筆者到該地調(diào)查后發(fā)現(xiàn)在檳榔芋葉片上出現(xiàn)大量壞死斑,部分植株葉柄上也有該癥狀(圖1a～c),與已報(bào)道的芋疫病癥狀基本一致[6]。

芋疫病主要由卵菌芋疫霉PhytophthoracolocasiaeRacib引起,是芋生產(chǎn)中最具破壞性的病害,現(xiàn)已成為全世界芋種植的主要制約因素,每年造成的損失達(dá)25%～50%[7]。對(duì)病原菌進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定是病害有效防控的前提。以往對(duì)芋疫病的鑒定主要基于病害癥狀和病原菌形態(tài)學(xué)觀察,隨著分子生物學(xué)方法的快速發(fā)展,周清平等[8]和陸葉等[9]利用ITS通用引物對(duì)芋疫病病原菌進(jìn)行了鑒定。但是卵菌種間相似度較高,ITS并不能完全區(qū)分親緣關(guān)系較近的種[10]。研究表明,多基因序列分析能更準(zhǔn)確地鑒定病原菌,三磷酸鳥苷(GTP)結(jié)合蛋白基因(Ypt1)和β微管蛋白基因(β-tubulin)也常被用于卵菌特異性分離鑒定的靶標(biāo)[11-12]。

當(dāng)前可通過種植抗病品種、加強(qiáng)田間管理、輪作、套作等方式對(duì)芋疫病進(jìn)行防治,但化學(xué)防治仍是防控該病害最快、最有效的方法。Cox 等[13]對(duì)巴布亞新幾內(nèi)亞地區(qū)芋疫病藥劑防治試驗(yàn)表明,甲霜靈和王銅防效顯著;周清平等[8]對(duì)芋疫病防治藥劑的篩選結(jié)果表明,60%錳鋅·氟嗎啉可濕性粉劑、50%烯酰嗎啉可濕性粉劑和72%霜脲·錳鋅可濕性粉劑的防效均在60%以上;葉泉清等[2]對(duì)廣西荔浦芋的藥劑防治試驗(yàn)結(jié)果表明，50%烯酰嗎啉水分散粒劑和58%甲霜·錳鋅可濕性粉劑防效較好,平均防效分別為58.8%和52.4%。然而,由于化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期使用,加上卵菌遺傳變異快,病原菌抗藥性的發(fā)生時(shí)有報(bào)道[14]。據(jù)報(bào)道致病疫霉P.infestans、古巴假霜霉Pseudoperonosporacubensis、腐霉Pythiumsp.等病原菌對(duì)甲霜靈均產(chǎn)生了抗性[15-17]。因此,亟須篩選出對(duì)檳榔芋有良好防治效果的常用殺菌劑,從而有針對(duì)性地對(duì)芋疫病進(jìn)行防治。

本研究采用形態(tài)學(xué)觀察、致病性測(cè)定、分子生物學(xué)鑒定聯(lián)合多基因序列分析對(duì)檳榔芋疫病的病原菌進(jìn)行分離鑒定,并測(cè)定了7種常用殺菌劑對(duì)病原菌的抑制效果,以期為該病害的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1供試菌株

辣椒疫霉P.capsici標(biāo)準(zhǔn)交配型A1、A2菌株由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所戚仁德研究員惠贈(zèng)。

1.1.2供試藥劑

96.8%烯酰嗎啉(dimethomorph)原藥,安徽豐樂農(nóng)化有限責(zé)任公司;97%霜脲氰(cymoxanil)原藥,上海升聯(lián)化工有限公司;20%氟嗎啉可濕性粉劑,沈陽科創(chuàng)化學(xué)品有限公司;23.4%雙炔酰菌胺懸浮劑、500 g/L氟啶胺懸浮劑,先正達(dá)生物科技(中國(guó))有限公司;0.3%丁子香酚可溶液劑,河南省焦作華生化工有限公司;45%敵磺鈉濕粉,遼寧省丹東市農(nóng)藥總廠。

1.1.3供試培養(yǎng)基

V8培養(yǎng)基:將罐裝V8飲料(330 mL)倒入燒杯中,加入3.3 g CaCO3,混勻后用4層紗布過濾,按1∶9加入純水進(jìn)行稀釋,如配固體培養(yǎng)基再按1.5%加入瓊脂粉;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA):馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g,蒸餾水定容至1 L。

1.2 病原菌的分離與純化

于2020年6月至7月從江西省九江市永修縣采集典型的檳榔芋疫病染病葉片和葉柄帶回實(shí)驗(yàn)室,采用常規(guī)組織分離法分離病原菌。具體方法為:將葉片和葉柄用滅菌水沖洗干凈,稍微晾干,切取葉片和葉柄病健交界處3 mm×3 mm大小的組織塊,先用75%乙醇消毒15 s,隨后置于1%次氯酸鈉溶液中浸泡1～2 min,最后用無菌水漂洗3次,用滅菌濾紙吸干水分后置于含50 μg/mL氨芐青霉素和100 μg/mL利福平的V8培養(yǎng)基上,放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)5 d,待菌落長(zhǎng)出后進(jìn)行單孢分離純化[18],純化后接種于V8斜面培養(yǎng)基,置于13℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 致病性測(cè)定

按照柯赫氏法則,采用游動(dòng)孢子懸浮液接種離體葉片以測(cè)定菌株致病性。從田間摘取健康且長(zhǎng)勢(shì)較為一致的檳榔芋葉片帶回實(shí)驗(yàn)室,用70%乙醇對(duì)葉片表面進(jìn)行消毒。將供試菌株接種于V8平板上,25℃黑暗培養(yǎng)5 d,加入滅菌水誘導(dǎo)游動(dòng)孢子釋放,配制成3×104個(gè)/mL的游動(dòng)孢子懸浮液,在每張葉片背面左半部分選取兩個(gè)點(diǎn)滴10 μL游動(dòng)孢子懸浮液,右邊以滅菌水為對(duì)照,放入托盤中保濕,25℃黑暗培養(yǎng),逐日觀察葉片發(fā)病情況。待發(fā)病后進(jìn)行病原菌的再分離。

1.4 形態(tài)學(xué)觀察

將純化的菌株接種于V8平板上,置于25℃黑暗下培養(yǎng)5 d,觀察菌落形態(tài)特征,參照鄭小波[19]、陸家云[20]的方法測(cè)量孢子囊的大小。將純化的菌株同時(shí)和辣椒疫霉標(biāo)準(zhǔn)交配型A1、A2菌株對(duì)峙培養(yǎng)以誘導(dǎo)有性器官雄器、藏卵器和卵孢子產(chǎn)生,在顯微鏡下觀察各個(gè)有性器官形態(tài)并拍照測(cè)量,每種性器官至少測(cè)量50個(gè)數(shù)據(jù)。

1.5 病原菌分子生物學(xué)鑒定

采用CTAB法提取病原菌菌絲體DNA,分別使用核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)/ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[9]、三磷酸鳥苷(GTP)結(jié)合蛋白基因Ypt1引物Yph1F(5′-CGACCATKGGTGTGGACTTT-3′)/Yph2R(5′-ACGTTCTCMCAGGCGTATCT-3′)[11]、β微管蛋白基因β-tubulin引物BT5(5′-GTATCATGTGCACGTACTCGG-3′)/BT6(5′-CAAGAAAGCCTTACGACGGA-3′)[12]對(duì)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)體系(50 μL)為:10×PCR Buffer 5 μL、dNTPs 4 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、100 ng/μL DNA模板1 μL,5 U/μLTaq酶0.5 μL,ddH2O補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性25 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,送至擎科生物(長(zhǎng)沙)技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將所得序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù),并進(jìn)行Blastn比對(duì),下載鄰近屬種序列,使用Bioedit 軟件對(duì)序列進(jìn)行整理,將各基因序列首尾串聯(lián),使用ClustalX工具對(duì)多基因序列進(jìn)行比對(duì),應(yīng)用MEGA 7.0軟件鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 供試菌株對(duì)7種殺菌劑的敏感性測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[21]測(cè)定檳榔芋疫病病原菌對(duì)7種殺菌劑的敏感性。將殺菌劑配制成不同濃度的母液,并按照1∶1 000的比例制成系列質(zhì)量濃度的含藥PDA平板。將供試菌株于PDA平板上活化,于25℃黑暗下培養(yǎng)6 d,用直徑5 mm的打孔器打取菌餅,將菌絲面朝下接種于含藥平板中央,以無藥平板為對(duì)照,每個(gè)處理重復(fù)3次,置于生化培養(yǎng)箱中25℃黑暗培養(yǎng)7 d,采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。利用SPSS 17.0軟件求出EC50、b±標(biāo)準(zhǔn)誤差、卡方值和P值。

2 結(jié)果與分析

2.1 檳榔芋疫病田間癥狀觀察及致病性測(cè)定

田間調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn),檳榔芋疫病主要危害葉片,開始產(chǎn)生水漬狀斑點(diǎn),隨后迅速擴(kuò)展為大的褐色輪紋狀病斑,病斑周圍分泌出淡黃色的小液滴,中間腐敗穿孔,僅留葉脈呈破傘狀(圖1a-c),部分葉柄上也有病斑出現(xiàn)。

本次共采集了20片葉片和10個(gè)葉柄,最終分離純化獲得3株菌株,分別命名為JJYT-1、JJYT-2、JJYT-3,將分離純化的病原菌接種健康葉片,接種24 h后葉片開始褪綠,出現(xiàn)圓形水漬狀淺褐色病斑,3 d后病斑逐漸擴(kuò)大,顏色加深,病斑周圍有淡黃色暈圈,中間開始腐爛,對(duì)照處理無癥狀(圖1d-e)。從發(fā)病部位進(jìn)行病原菌的再分離,獲得與原菌株一致的菌,表明接種菌株為引起檳榔芋疫病的病原菌。

圖1 檳榔芋疫病的田間發(fā)病癥狀及致病性測(cè)定

2.2 病原菌形態(tài)學(xué)觀察

病原菌菌落在V8培養(yǎng)基上呈圓形,邊緣整齊,菌落白色,氣生菌絲較少。孢子囊主要呈長(zhǎng)橢圓形,少部分為卵圓形,頂端具乳突,大小為(39.0～67.3)μm×(21.9～30.6)μm,平均51.6 μm×25.8 μm,長(zhǎng)寬比2.0(1.7～2.4)。供試菌株自身未見卵孢子產(chǎn)生,和辣椒疫霉A1標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)峙培養(yǎng)8 d后,在兩菌交界處有大量藏卵器、雄器和卵孢子產(chǎn)生。藏卵器呈球形,大小為(26.8～38.4)μm,平均33.1 μm,卵孢子大小為(17.6～31.3)μm,平均26.6 μm,雄器圍生,大小為(11.7～17.6)μm×(8.2～16.2)μm,平均14.6 μm×11.4 μm,與鄭小波[19]和陸家云[20]描述的芋疫霉形態(tài)基本一致。

圖2 檳榔芋疫病病原菌形態(tài)特征

2.3 分子生物學(xué)鑒定

使用ITS、Ypt1、β-tubulin基因通用引物對(duì)分離得到的3株菌株分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,可分別擴(kuò)增出約820、415 bp和700 bp的特異性條帶。將序列提交至GenBank,JJYT-1菌株獲得登錄號(hào)分別為MT936521、MT977413、MT977414;JJYT-2菌株獲得登錄號(hào)分別為OM108210、OM162131、OM162133;JJYT-3菌株獲得登錄號(hào)分別為 OM108211、OM162132、OM162134。3株菌株的ITS、Ypt1、β-tubulin序列與NCBI上P.colocasiae相關(guān)序列相似性均為99%～100%。通過MEGA 7.0構(gòu)建ITS-Ypt1-β-tubulin多基因進(jìn)化樹,結(jié)果表明3株菌株與Phytophthoracolocasiae聚于同一分支(圖3)。

圖3 基于 ITS、Ypt1和β-tubulin基因構(gòu)建的檳榔芋疫病病原菌JJYT-1、JJYT-2和JJYT-3的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 7種殺菌劑對(duì)檳榔芋疫病病原菌的毒力

由表1結(jié)果可知:供試的7種殺菌劑對(duì)檳榔芋疫病病原菌菌絲生長(zhǎng)均有不同程度的抑制作用。其中23.4%雙炔酰菌胺SC對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制效果最好,EC50為0.006 μg/mL;96.8%烯酰嗎啉TC、0.3%丁子香酚SL、20%氟嗎啉WP、500 g/L氟啶胺SC、97%霜脲氰TC對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制效果也較好,EC50介于0.094～1.272 μg/mL之間;45%敵磺鈉WG對(duì)病原菌的抑制效果最差,EC50為56.923 μg/mL,但45%敵磺鈉WG除了能抑制菌絲生長(zhǎng)速率外,還能抑制菌絲生長(zhǎng)量,隨著濃度的升高,菌絲量明顯減少。

表1 7種殺菌劑對(duì)檳榔芋疫病病原菌的室內(nèi)毒力

3 結(jié)論與討論

國(guó)內(nèi)已有對(duì)芋疫病病原菌鑒定的相關(guān)報(bào)道,王向社等[22]和葉泉清等[2]通過形態(tài)學(xué)觀察和致病性測(cè)定將芋疫病病原菌鑒定為芋疫霉;周清平等[8]和陸葉等[9]等通過形態(tài)學(xué)觀察和ITS序列分析將芋疫病鑒定為芋疫霉。然而,Martin等[10]報(bào)道ITS難以對(duì)部分親緣關(guān)系相近的種如橡樹疫霉P.ramorum和假丁香疫霉P.pseudosyringae進(jìn)行區(qū)分,本研究通過形態(tài)學(xué)觀察、致病性測(cè)定聯(lián)合ITS-Ypt1-β-tubulin多基因序列分析對(duì)芋疫病病原菌的鑒定方法更加準(zhǔn)確和可靠,這是江西省內(nèi)首次對(duì)該病病原菌的鑒定報(bào)道。芋疫霉的寄主范圍較窄,主要寄主為芋屬作物,可通過氣流、雨水、帶菌球莖等傳播,由于該地區(qū)的檳榔芋是從外地引進(jìn),推測(cè)可能是球莖上帶有該病原菌造成此次芋疫病的發(fā)生。

本研究測(cè)定了7種常用殺菌劑對(duì)檳榔芋疫病病原菌的抑制作用,結(jié)果表明,除45%敵磺鈉濕粉外,其余6種殺菌劑抑制效果均較好。在國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的研究報(bào)道中,對(duì)芋疫病化學(xué)防治使用時(shí)間長(zhǎng)、范圍廣的藥劑主要有甲霜靈和烯酰嗎啉,但甲霜靈的作用位點(diǎn)β-1,3 葡聚糖酶單個(gè)核苷酸位點(diǎn)的突變就能引起病原菌抗藥性[23],因此其使用逐漸受到限制。烯酰嗎啉以其抑菌活性強(qiáng)、對(duì)卵菌有特效、且與甲霜靈等苯酰胺類殺菌劑無交互抗性而受到廣泛重視[24],葉泉清等[2]、周清平等[8]和朱敦軍[25]開展的田間藥劑試驗(yàn)結(jié)果表明,50%烯酰嗎啉水分散粒劑、50%烯酰嗎啉可濕性粉劑、50%烯酰嗎啉水分散粒劑對(duì)芋疫病的平均防效分別為58.8%、67.9%和79.2%;黃達(dá)才[26]的研究表明,80%烯酰嗎啉水分散粒劑對(duì)芋疫病平均防效在70%以上;本研究室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明,芋疫霉對(duì)96.8%烯酰嗎啉原藥十分敏感,EC50值為0.094 μg/mL,這與前人發(fā)現(xiàn)烯酰嗎啉對(duì)芋疫病防效良好的結(jié)論基本一致[2,8,25-26]。本研究發(fā)現(xiàn),23.4%雙炔酰菌胺懸浮劑對(duì)芋疫霉菌絲生長(zhǎng)抑制效果優(yōu)于96.8%烯酰嗎啉原藥,其EC50為0.006 μg/mL,方輝等[27]的研究表明,250 g/L雙炔酰菌胺懸浮劑對(duì)芋疫病有較好的防治效果,且顯著優(yōu)于70%甲基硫菌靈可濕性粉劑和70%烯?！に迩杷稚⒘┑某Ｒ?guī)用藥量。雙炔酰菌胺是先正達(dá)公司開發(fā)的新型卵菌病害殺菌劑,也是第一個(gè)商品化的扁桃酰胺類化合物,其對(duì)抑制孢子萌發(fā)具有較高活性,同時(shí)也抑制菌絲體的生長(zhǎng)與孢子的形成,研究表明,其對(duì)卵菌病害如番茄晚疫病和黃瓜霜霉病等具有很好的防治效果[28]。由于芋葉片表面的蠟質(zhì),加上芋疫病多發(fā)生于高溫多雨季節(jié),許多殺菌劑無法吸附在葉片上而導(dǎo)致防效較差[23]。然而,雙炔酰菌胺對(duì)植物表面的蠟質(zhì)具有很高的親和力,耐雨水沖刷,被吸附后的有效成分能夠保護(hù)整個(gè)葉片不受病害侵染[29]。因此,當(dāng)芋疫病發(fā)生時(shí)可優(yōu)選雙炔酰菌胺進(jìn)行防治。此外,0.3%丁子香酚可溶液劑、20%氟嗎啉可濕性粉劑、500 g/L氟啶胺懸浮劑和97%霜脲氰原藥對(duì)芋疫霉菌絲生長(zhǎng)抑制的EC50值分別為0.10、0.275、0.703、1.272 μg/mL,這些數(shù)據(jù)均可為芋疫病田間防治提供一定參考。

本試驗(yàn)僅在室內(nèi)完成,下一步應(yīng)開展田間藥效試驗(yàn)以驗(yàn)證實(shí)際防效。另外,在芋種植過程中,化學(xué)防治芋疫病時(shí)用藥要早,病害零星發(fā)生時(shí)便應(yīng)用藥,同時(shí)應(yīng)避免長(zhǎng)期使用單一藥劑,不同藥劑的輪換使用及復(fù)配劑的使用能有效避免抗藥性的發(fā)生。此外,也應(yīng)加強(qiáng)田間水分管理、增大植株間距、間作等,以達(dá)到對(duì)芋疫病進(jìn)行綜合防治的目的。