叢勝波, 萬 鵬, 李文靜, 李 棟, 孫 俊, 尹海辰*

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華中作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)作物重大病蟲草害防控湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430064; 2.中化現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(湖南)有限公司, 長沙 410205)

棉鈴蟲Helicoverpaarmigera,屬于鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae,綠盲蝽Apolyguslucorum,屬于半翅目Hemiptera盲蝽科Miridae,兩種害蟲廣泛分布于世界各地,在我國棉花、蔬菜和果樹種植區(qū)均有發(fā)生,寄主種類均在200種以上,棉鈴蟲可為害番茄、白菜、甘藍(lán)等,綠盲蝽則對(duì)蘋果、棗、葡萄等50余種經(jīng)濟(jì)作物生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響[1-3]。棉鈴蟲曾經(jīng)在我國長江及黃河流域棉花種植區(qū)造成嚴(yán)重危害,隨著Bt棉花的種植,該蟲的危害得到了有效的控制,綠盲蝽上升成為我國棉花的主要害蟲。然而在Bt棉花的高強(qiáng)度種植區(qū),已有棉鈴蟲耐受性提升的報(bào)道[4-5],綠盲蝽由于具有世代重疊嚴(yán)重、飛行能力強(qiáng)等特點(diǎn),抗藥性風(fēng)險(xiǎn)日益嚴(yán)重[6-7]。綜上所述,急需尋找一種對(duì)棉鈴蟲、綠盲蝽安全高效的防治新手段。

我國的中草藥植物是一類重要的植物資源,除去在醫(yī)藥上的應(yīng)用外,利用植物防治害蟲具有悠久的歷史,早在2000多年前我國就已有相關(guān)記載,近年來科研人員篩選了多種具有較高殺蟲活性的中草藥植物提取物[8-10]。相比于傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥,這些植物源農(nóng)藥來源于自然,對(duì)害蟲的作用方式多樣,因此具有污染小，易降解,害蟲不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)[11-12]。本研究選取了10種中草藥植物,制備了其乙醇提取物,測(cè)定了乙醇提取物對(duì)棉鈴蟲、綠盲蝽兩種害蟲的觸殺活性,并采取萃取、硅膠柱分離等手段,初步對(duì)其有效成分進(jìn)行了分離,本研究以期為兩種害蟲高效安全的新型藥劑開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試蟲飼養(yǎng)

試驗(yàn)所用綠盲蝽和棉鈴蟲采集自湖北省武漢市、鄂州市等地棉田,在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)于(26±1)℃,光周期L∥D=16 h∥8 h,相對(duì)濕度60%條件下分別用四季豆和人工飼料飼養(yǎng)多代,飼養(yǎng)期間未接觸任何藥劑。

1.2 供試中草藥粗提取物的制備

選用苦杏仁(種子)、云木香(根)、香加皮(根皮)、大黃(根)、萹蓄(全株)、薄荷(地上部分)、紫花地丁(全株)、韭菜籽(種子)、澤漆(全株)、五加皮(樹皮)等10種中藥材,本研究所用中草藥均采購自湖北中醫(yī)藥大學(xué),將100 g供試中藥打成粉末后置于250 mL無水乙醇中室溫浸泡15 d,將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑獲得膏狀提取物。

1.3 植物提取物對(duì)棉鈴蟲、綠盲蝽的觸殺活性測(cè)定

將100 mg中草藥乙醇粗提物用少量乙醇溶解,用蒸餾水將樣品稀釋至15 mg/mL,每種粗提物配制1 mL藥液用于試驗(yàn)。每種粗提物設(shè)置3組重復(fù),每個(gè)重復(fù)20頭2齡棉鈴蟲幼蟲或2齡綠盲蝽若蟲,以含有少量乙醇的蒸餾水為對(duì)照組。將試蟲置于培養(yǎng)皿中,用POTTER噴霧塔(北京安迪永富科貿(mào)有限公司,ADPT-1型)噴霧處理,處理后棉鈴蟲置于24孔板內(nèi)飼養(yǎng),每孔放入1塊人工飼料(1 cm3大小)并接入1頭棉鈴蟲幼蟲;綠盲蝽置于玻璃指形管(直徑2 cm,高5 cm)內(nèi)飼養(yǎng),每個(gè)指形管放入1塊四季豆(長約4 cm)并接入20頭綠盲蝽若蟲。統(tǒng)計(jì)藥后1、3、7 d棉鈴蟲幼蟲和綠盲蝽若蟲死亡率。

1.4 不同極性溶劑萃取及萃取物生測(cè)

選擇觸殺活性較高的粗提物進(jìn)行不同溶劑萃取,將10 g粗提物用500 mL純凈水溶解后,依次使用等量的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇4種極性不同溶劑進(jìn)行萃取,萃取后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑,獲得萃取物,將萃取物用于棉鈴蟲、綠盲蝽觸殺活性的生測(cè),生測(cè)方法、濃度及用量等同上。

1.5 萃取物硅膠柱層析分離及生測(cè)

硅膠柱層析分離方法參考李秀梅等[13]的報(bào)道,選擇觸殺活性較高的萃取物,利用相應(yīng)溶劑溶解。采用濕法裝柱,選用200～300目硅膠為吸附劑,洗脫液為石油醚∶乙酸乙酯(3∶1)。每份300 mL,收集流分并編號(hào),并通過經(jīng)TLC檢測(cè)合并相鄰流分中含有相同Rf值洗脫物的流分。流分經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后,供殺蟲活性測(cè)定使用,生測(cè)方法、濃度及用量等同上。

1.6 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)公式計(jì)算校正死亡率：

校正死亡率=(處理死亡率-對(duì)照死亡率)/(1-對(duì)照死亡率)×100%。

不同植物提取物、萃取物及流分之間的校正死亡率通過單因素方差分析LSD法分析,分析軟件使用SPSS Statistics 17.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物提取物對(duì)棉鈴蟲、綠盲蝽的觸殺活性

中草藥乙醇粗提物生測(cè)結(jié)果表明, 10種乙醇粗提物對(duì)棉鈴蟲2齡幼蟲均具有一定的觸殺效果,其中經(jīng)香加皮和苦杏仁處理后的棉鈴蟲幼蟲,藥后7 d校正死亡率較高,分別為56.8%和65.4%(表1)。而對(duì)于綠盲蝽2齡若蟲,粗提物觸殺效果較為顯著,除五加皮提取物外,其余9種提取物均具有顯著的觸殺活性,藥后7 d校正死亡率均在80%以上(表2)。

表1 中草藥乙醇粗提物對(duì)棉鈴蟲2齡幼蟲的觸殺活性1)

表2 中草藥乙醇粗提物對(duì)綠盲蝽2齡若蟲的觸殺活性

2.2 不同極性溶劑萃取組分對(duì)綠盲蝽的活性

由表1和表2可知,中草藥粗提物對(duì)于棉鈴蟲的觸殺活性相對(duì)較差,因此后續(xù)選擇綠盲蝽若蟲為試驗(yàn)對(duì)象?？嘈尤屎腿q蓄提取物對(duì)于綠盲蝽觸殺作用均較強(qiáng),但萹蓄的提取率較低,因此選擇苦杏仁進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。在進(jìn)行分離萃取時(shí),由于乙酸乙酯、正丁醇萃取蒸干后獲得的提取物質(zhì)量過低,因此無法進(jìn)行生測(cè);當(dāng)加入氯仿后苦杏仁粗提物出現(xiàn)析出物,這種析出的不溶物對(duì)綠盲蝽觸殺活性最高,藥后7 d校正死亡率達(dá)96.9%;而氯仿和石油醚的萃取物藥后7 d對(duì)綠盲蝽的校正死亡率僅為6.2%和7.3%,水相未表現(xiàn)出殺蟲活性(表3)。由于氯仿萃取時(shí)析出物對(duì)綠盲蝽表現(xiàn)出最高的觸殺活性,因此選擇其進(jìn)行層析柱分離。

表3 苦杏仁4種萃取物對(duì)綠盲蝽2齡若蟲的觸殺活性

2.3 苦杏仁萃取物硅膠柱層析分離及生物活性

苦杏仁粗提物經(jīng)氯仿萃取時(shí)析出的不溶物經(jīng)層析柱分離后可產(chǎn)生4組流分,生測(cè)結(jié)果表明,流分L36-48對(duì)綠盲蝽2齡若蟲的觸殺活性最高,校正死亡率可達(dá)84.7%(表4)。而L8-15、L18-24兩組流分校正死亡率低于50%。

表4 苦杏仁氯仿萃取析出物不同流分對(duì)綠盲蝽2齡若蟲的觸殺活性

3 討論

本文利用10種中草藥提取物對(duì)棉鈴蟲、綠盲蝽開展觸殺活性測(cè)定,結(jié)果表明，中草藥提取物對(duì)綠盲蝽具有較好的觸殺活性,其中苦杏仁提取物校正死亡率最高。進(jìn)一步分離發(fā)現(xiàn)活性成分可能存在于氯仿萃取時(shí)的析出物中,且流分L36-48觸殺活性最高。

目前,中草藥提取物的殺蟲活性已受到科研人員的廣泛關(guān)注。王謙等[14]采用藥膜法測(cè)定了5種中草藥提取物對(duì)菇蠅的毒殺活性,結(jié)果表明，百部Stemonajaponica和苦參Sophoraflavescens對(duì)菇蠅的毒殺活性顯著;方濤等[15]測(cè)定了28種植物提取物對(duì)棉蚜Aphisgossypii的殺蟲活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)曼陀羅Daturametel、毒參Coniummaculatum、大戟Euphorbiapekinensis等8種植物提取物具有較高殺蟲活性,其中曼陀羅提取物殺蟲活性最高;Abdelatti和Hartbauer[16]研究發(fā)現(xiàn),葛縷子Carumcarvi、橘皮Citrusaurantiumdulcis和平鋪白珠樹Gaultheriaprocumbens等3種提取物的復(fù)配劑對(duì)蝗蟲具有較好的防治效果,噴施24 h后試蟲死亡率可達(dá)80%～100%,且該提取物對(duì)于小麥幼苗無藥害。本文通過對(duì)蘿藦科、薔薇科、大戟科等10種中藥材提取物殺蟲活性的研究,為中草藥植物資源的利用提供了理論支持。

目前,苦杏仁提取物已被證實(shí)對(duì)家蠅Muscadomestica、玉米象Sitophiluszeamais、白紋伊蚊Aedesalbopictus以及黏蟲Mythimnaseparata具有很好的熏蒸、觸殺活性[17-19]。但對(duì)于其有效成分分離鑒定的相關(guān)研究較少,馬玉花等[19]的研究發(fā)現(xiàn),去除HCN的苦杏仁精油的殺蟲活性顯著高于含HCN的苦杏仁精油,其原因可能是精油中微量的HCN不足以對(duì)試蟲造成毒殺作用,而除去HCN后反而提升了精油中有效成分的含量。于新池[20]的研究表明,苦杏仁精油主要成分是苯甲醛、苯甲酸、二甲苯、正十六烷等,然而其抗菌殺蟲活性并不能完全歸因于其主要成分苯甲醛。由此可見,苦杏仁的活性成分目前尚不明確,本文對(duì)其有效成分開展了初步的分離鑒定,為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

在當(dāng)前棉花害蟲抗藥性風(fēng)險(xiǎn)日益嚴(yán)峻的情況下,利用中草藥植物資源開發(fā)新型藥劑是解決防治問題的重要思路。在今后研究中還應(yīng)繼續(xù)開展中草藥植物活性物質(zhì)的鑒定,同時(shí)在觸殺作用以外,苦杏仁等植物提取物還可能存在熏蒸、驅(qū)避等多種作用方式,綜合利用這些植物資源是開發(fā)害蟲高效安全的防治手段的基礎(chǔ)。