姚雙艷, 張 耀, 楊 越, 舍澤龍, 王 煥, 卞會敏,吳雪明, 魏紀珍, 安世恒

(小麥玉米作物學國家重點實驗室, 河南省害蟲綠色防控國際聯(lián)合實驗室, 河南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院, 鄭州 450002)

棉鈴蟲Helicoverpaarmigera屬鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae,是重要的農(nóng)業(yè)害蟲,為害棉花、小麥、煙草、花生等多種作物,在世界范圍內(nèi)廣泛分布[1-3]。長期以來,化學防治是防治棉鈴蟲的重要手段之一,可以在短時間內(nèi)迅速且有效地控制棉鈴蟲種群數(shù)量,進而確保農(nóng)作物產(chǎn)量[1]。但化學防治中產(chǎn)生的諸多問題,尤其是棉鈴蟲抗藥性的快速發(fā)展,迫使研究者尋求更安全更有效的防治方法。隨著轉蘇云金芽胞桿菌Bacillusthuringiensis(Bt)殺蟲蛋白棉花的大面積種植,棉鈴蟲的為害再次得到了很好的控制[4]。但隨著我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結構的調(diào)整,非轉Bt作物上棉鈴蟲為害更加猖獗[5]。同時,在轉Bt基因作物持續(xù)的高壓選擇下,棉鈴蟲對Bt蛋白的抗性也逐漸凸顯[4]。因此,從多維度研究和探索棉鈴蟲的防治方法勢在必行。

棉鈴蟲除寄主廣、遷移能力強、環(huán)境適應能力強等特點外,巨大的繁殖潛能也是其暴發(fā)成災、連年猖獗的重要原因。性信息素是昆蟲交配繁殖的關鍵化學信號[6]。在蛾類中,主要是由雌蛾釋放性信息素吸引雄蛾前來交配[7]。因此,干擾雌蛾的性信息素生物合成可以有效影響雌雄蛾的交配,進而降低后代種群數(shù)目,最終達到防治害蟲的目的。所以,探索和開發(fā)影響棉鈴蟲性信息素生物合成的相關基因對其防治具有重要意義。

NF-κB是廣泛存在于脊椎動物和無脊椎動物中,特異性結合免疫球蛋白,進而促進免疫相關基因表達的細胞核轉錄因子[8-9]。大量研究表明,NF-κB廣泛參與多細胞動物的免疫應答、炎癥反應、細胞凋亡和生長發(fā)育[9-10]。NF-κB家族主要包括Relish、Dorsal和Dif3個成員,這些基因在進化過程中高度保守[11]。由于獲得性免疫系統(tǒng)的缺失,在長期的進化過程中無脊椎動物進化出一套復雜而高效的免疫體系[12]。在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中,Relish不僅通過免疫缺陷(immunodeficiency,IMD)信號通路介導抗革蘭氏陰性菌的免疫過程[13];還可以通過靶向轉化生長因子-β-活化激酶1(transforming growth factor-β-activating kinase 1,TAK1)調(diào)控c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)介導的免疫反應[14];在斜紋夜蛾Spodopteralitura中也證實了IMD通路下游的Relish參與調(diào)控大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)引起的斜紋夜蛾的免疫反應[15];在柞蠶Antheraeapernyi中,Relish通過調(diào)控自噬相關基因5(autophagy-related gene 5,ATG5)的活性進而調(diào)控其先天性免疫[11]。在甲殼動物三疣梭子蟹Portunustrituberculatus等和節(jié)肢動物中國明對蝦Fenneropenaeuschinensis、羅氏沼蝦Macrobrachiumrosenbergii等物種也證實Relish參與其免疫過程[16-19]。

目前對Relish的研究多集中于其在先天性免疫應答中的作用,在蛾類性信息素生物合成中的功能未見報道。本研究對Harelish在性信息素生物合成中的功能進行研究,分析了Harelish對棉鈴蟲性信息素生物合成關鍵酶鈣調(diào)磷酸酶(CaN)活性和性信息素含量的影響,以期為通過性信息素生物合成通路進行防蟲控蟲提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲飼養(yǎng)

棉鈴蟲卵購自河南省濟源白云實業(yè)有限公司,在室內(nèi)以人工飼料于人工氣候箱[溫度(26±1)℃,相對濕度(75±1)%,光周期L∥D=14 h∥10 h]中飼養(yǎng)多代[20-21]。

1.2 時空表達樣品準備

不同組織樣品準備:解剖羽化后48 h的棉鈴蟲雌蛾,分別取中腸(midgut,MG)、表皮(epidermis,EP)、腦(brain,Br)、觸角(antennae,Ant)、脂肪體(fat body,FB)、肌肉(muscle,MS)和性信息素腺體(sex pheromone gland,PG)等組織,用TRIzol試劑(Invitrogen,美國)提取其RNA并反轉錄為cDNA,用于后續(xù)熒光定量檢測。

不同時期樣品準備:解剖分離不同時期,即羽化前72 h(標記為-72 h)、羽化前48 h(標記為-48 h)、羽化前24 h(標記為-24 h),新羽化(標記為0 h)、羽化后24 h(標記為24 h)、羽化后48 h(標記為48 h)和羽化后72 h(標記為72 h)的性信息素腺體,以解剖鑷在顯微鏡下處理干凈后,用TRIzol試劑提取其RNA并反轉錄為cDNA,用于后續(xù)熒光定量檢測。

1.3 dsRNA體外合成和RNAi

按照T7 RNAi Transcription試劑盒(TR102)(諾唯贊,中國)說明書體外合成dsRNA。首先,以性信息素腺體cDNA和包含T7啟動子的特異性引物(表1)進行PCR擴增,純化PCR產(chǎn)物作為后續(xù)合成dsRNA的模板。取純化PCR產(chǎn)物1 μg,加入NTP Mix 8 μL，10× Transcription Buffer 2 μL 和T7 Enzyme Mix 2 μL,以RNase-free H2O補足20 μL后放入PCR儀中37℃反應2 h,以合成dsRNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測合成的dsRNA質(zhì)量,然后用酚/氯仿對該產(chǎn)物進行抽提純化,并用Nanodrop 2000紫外微量分光光度計(Thermo Fisher Scientific,美國)測定dsHarelish的濃度。以合成的增強綠色熒光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein gene, EGFP)的dsRNA作為對照。

表1 本試驗所用的引物

將新羽化的棉鈴蟲雌蛾頭部剪除,并置于室溫24 h。將體外合成的dsHarelish以10 μg/頭的量注射入預處理的雌蛾體內(nèi),置于室溫24 h后取其性信息素腺體,-20℃保存,用于后續(xù)熒光定量檢測、GC-MS和酶活測定。以注射dsEGFP的雌蛾作為對照。每處理注射15頭,3次重復。

1.4 熒光定量PCR檢測

使用TRIzol試劑提取樣品總RNA,并通過Nanodrop2000紫外微量分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度和質(zhì)量。采用HiScript Ⅲ RT SuperMix試劑盒(諾唯贊,中國)合成cDNA,作為熒光定量PCR的模板。采用Actin(ACT)和Elongation factor 1 alpha(EF-1α)作為內(nèi)參基因,在ABI 7500 PCR儀器上使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(諾唯贊,中國)對Harelish的相對表達量進行實時熒光定量PCR檢測。熒光定量PCR反應程序為：95℃預變性5 min;95℃變性15 s和60℃延伸20 s,循環(huán)40次。采用雙內(nèi)參法對Harelish基因的相對表達量進行量化[22]。

1.5 性信息素Z11-16∶Ald含量檢測

處理組和對照組分別注射dsHarelish和dsEGFP后繼續(xù)培養(yǎng)24 h,再依次按照10 pmol/頭的量注射體外合成的具有活性的性信息素合成激活肽(pheromone biosynthetic activating neuropeptide,PBAN)溶液,并于28℃培養(yǎng)1 h,取性信息素腺體置于200 μL正己烷中。將萃取后的正己烷樣品上機(安捷倫7890B),參照Yao等的方法設定檢測程序[23],快速升溫至60℃保持2 min,然后以5℃/min升溫至230℃,在此期間性信息素組分全部洗脫;隨后以20℃/min的速度將柱子(安捷倫HP-5MS)加熱至245℃,并在此溫度下保持15 min;最后將氫火焰離子檢測器(FID檢測器)保持在250℃,對樣品組分進行檢測。采用面積歸一法對性信息素主要組分Z11-16∶Ald的含量進行量化。進行3個生物學重復,每個生物學重復的樣品由15頭性信息素腺體組成。

1.6 CaN酶活測定

斷頭處理的雌蛾按10 μg/頭分別注射dsHarelish和dsEGFP,室溫繼續(xù)飼養(yǎng)24 h。解剖性信息素腺體,置于昆蟲細胞培養(yǎng)液(Grace’s Insect Cell Culture Medium)中,用PBAN(10 pmol/L)孵育30 min后將性信息素腺體收集到1.5 mL的離心管中進行研磨和離心，上清分為兩份置于冰上。取其中一份,以蛋白定量測定試劑盒(南京建成,中國)測定其蛋白濃度;另一份則按照鈣調(diào)磷酸酶(CaN)檢測試劑盒(南京建成,中國)說明書和Du等[6]的方法進行CaN活性檢測。進行3個生物學重復,每個重復包含40頭性信息素腺體樣品。

1.7 數(shù)據(jù)處理

本研究中,所有試驗均進行3次生物學重復,數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010整理,統(tǒng)計結果后使用GraphPad Prism 8.3.0繪制柱狀圖。不同時期和不同組織中Harelish的表達量差異采用Tukey’s test進行多重比較(α=0.05, DPS 7.05)。Harelish基因的RNAi效果及后續(xù)的性信息素含量和CaN活性檢測均以IBM SPSS Statistics 23中的Student’st測驗分析數(shù)據(jù)之間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 不同組織中Harelish表達量分析

實時熒光定量qRT-PCR檢測結果顯示，Harelish基因在棉鈴蟲雌蛾中腸、表皮、腦、觸角、脂肪體、肌肉和性信息素腺體中均有表達,在觸角中表達量最高,肌肉組織中表達量最低,在性信息素腺體中具有較高的表達量(圖1)。

圖1 棉鈴蟲雌蛾不同組織Harelish基因的表達量

2.2 不同發(fā)育時期Harelish表達量分析

對Harelish基因在棉鈴蟲性信息素腺體不同發(fā)育時期的相對表達量進行分析,結果顯示Harelish在羽化前72 h和羽化前48 h具有較高的表達量,在羽化前24 h表達量最低,之后,隨著性信息素腺體發(fā)育成熟以及羽化后性信息素的釋放,Harelish的表達量不斷升高,在羽化后24 h達到最高(圖2)。

圖2 不同發(fā)育時間性信息素腺體中Harelish基因的表達量

2.3 對Harelish的干擾效果

將體外合成的EGFP和Harelish的dsRNA注射入新羽化并斷頭的棉鈴蟲雌蛾體內(nèi),以qRT-PCR檢測RNAi效果。結果顯示,與注射dsEGFP的對照相比,注射dsHarelish顯著降低Harelish的相對表達量約54%(圖3)。

圖3 RNAi誘導的Harelish基因在性信息素腺體中的干涉效果

2.4 Harelish對性信息素生物合成量的影響

確認體外合成的dsRNA具有良好的RNAi效果后,進一步以GC-MS檢測Harelish轉錄水平的降低對棉鈴蟲性信息素Z11-16∶Ald含量的影響。結果顯示,Harelish轉錄水平降低后,Z11-16∶Ald相對含量也顯著上調(diào)約56%(圖4)。

圖4 RNAi誘導的Harelish基因沉默對性信息素生物合成的影響

2.5 Harelish對CaN活性的影響

對dsEGFP和dsHarelish處理后棉鈴蟲雌蛾性信息素腺體中的CaN活性進行檢測。結果顯示,與對照組相比,Harelish轉錄水平的降低可以引起CaN活性的顯著上調(diào)(圖5)。

圖5 RNAi誘導的Harelish基因沉默對CaN活性的影響

3 結論與討論

通過分析Harelish基因在棉鈴蟲雌蛾不同組織中的表達量,發(fā)現(xiàn)其在棉鈴蟲雌蛾中腸、表皮、腦、觸角、脂肪體、肌肉和性信息素腺體等7個組織中均有表達,但表達量有所差異。該結果與斜紋夜蛾、三疣梭子蟹、中國明對蝦、羅氏沼蝦等物種中的研究結果相似[16-19],均表明了該基因在不同組織中的普遍表達。Relish是NF-κB家族的重要成員,參與了斜紋夜蛾、黑腹果蠅、柞蠶等昆蟲的IMD免疫信號通路[11, 13, 15]。脂肪體是昆蟲重要的免疫組織,Harelish基因在脂肪體中具有較高表達量說明該基因參與了棉鈴蟲的免疫反應,該結果同家蠶Bombyxmori、斜紋夜蛾中的研究結果一致[15, 24]。盡管Harelish基因在各個組織或器官中均廣泛存在,但目前關于該基因的研究則集中于其參與生物體的免疫過程,對該基因在其他組織中的功能鮮有研究。該基因在棉鈴蟲雌蛾性信息素腺體中具有較高的表達量,表明其在性信息素腺體中可能行使特定的生物學功能。

NF-κB家族是一種具有多種生理功能的轉錄因子,除參與機體的免疫反應和炎癥反應外,還參與了細胞的分化、增殖和凋亡等有關基因的轉錄[25]。昆蟲蛹期時其內(nèi)部進行著劇烈的組織解離和組織發(fā)生的生理活動,這也和本研究中Harelish基因在蛹期具有較高的表達量相一致。隨著成蟲羽化后,其表達量逐漸升高,在24 h達到最高,48 h和72 h亦具有較高表達量。在家蠶、棉鈴蟲、亞洲玉米螟、黏蟲Mythimnaseparata、斜紋夜蛾等鱗翅目蛾類中,雌蛾羽化后其性信息素開始合成和釋放,但是性信息素釋放的模式卻不盡相同[6, 23, 25-26]。其中家蠶羽化后立即釋放性信息素[26-27],斜紋夜蛾在羽化后第1個暗夜其性信息素釋放達到高峰[27],棉鈴蟲和亞洲玉米螟在羽化后3 d均大量釋放性信息素,在第2個暗夜其性信息素釋放和交配率均達到高峰[6, 23]。Harelish基因在不同發(fā)育時期的表達模式與其性信息素釋放模式相一致。同時,棉鈴蟲、家蠶和亞洲玉米螟性信息素合成相關基因PBANR、CaN、ACC、去飽和酶、FAR等均具有相似的表達模式[6, 23, 27]。最后,基于RNAi誘導的Harelish基因沉默對性信息素含量的影響,進一步證實了Harelish基因參與了棉鈴蟲性信息素生物合成。

在家蠶、棉鈴蟲、亞洲玉米螟等蛾類性信息素生物合成的研究中,PBANR、CaN、ACC、去飽和酶、FAR等基因轉錄水平下降引起雌蛾性信息素含量下降,即這些基因正向調(diào)控了蛾類性信息素的生物合成[6, 23, 27]。而在本研究中,Harelish基因轉錄水平降低時,其性信息素含量上升。該結果意味著Harelish基因負向調(diào)控了棉鈴蟲的性信息素生物合成,這也是鱗翅目蛾類性信息素生物合成中首次關于抑制因子的研究。

在棉鈴蟲中,其性信息素的生物合成通路已進行了明確而詳盡的闡述。主要的通路為:CaN由相應的第二信使Ca2+激活后,通過激活下游信號乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase,ACC),進而調(diào)控了其性信息素的生物合成過程[6]。同時CaN也被證實參與了家蠶、美洲棉鈴蟲Helicoverpazea、黏蟲、亞洲玉米螟等多種蛾類的性信息素生物合成[6, 23, 27]。本研究中,Harelish基因轉錄水平降低時,CaN活性升高。該結果與性信息素檢測結果一致,即Harelish基因通過抑制性信息素生物合成關鍵酶CaN,進而抑制了棉鈴蟲性信息素的生物合成。但是Harelish基因如何調(diào)控CaN還需要進一步研究。