王惠鑫, 陳淑婷, 王 凱, 郜曉妍, 謝桂英, 陳文波, 趙新成

(河南省害蟲綠色防控國際聯(lián)合實驗室, 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 鄭州 450002)

5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)是生物體內(nèi)一種重要的生物胺類,其作為神經(jīng)遞質(zhì)控制和調(diào)節(jié)生物體的多種重要生理活動[1-3]。研究表明,5-HT參與調(diào)控果蠅Drosophila和雙斑蟋蟀Gryllusbimaculatus的攻擊行為、睡眠和晝夜節(jié)律[4-7],參與果蠅和意大利蜜蜂Apismellifera的取食、學(xué)習(xí)和記憶等生理功能[8-12]。5-HT主要通過作用于特異性的G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs)發(fā)揮相應(yīng)的生理功能[3]。因此,昆蟲5-HT受體被人們視為潛在的新型殺蟲劑的作用靶標(biāo),盡管目前還沒有針對5-HT受體殺蟲劑的應(yīng)用,但科研人員已對該類受體能否成為新型殺蟲劑的靶標(biāo)進(jìn)行了探索。如利用遺傳和藥理學(xué)試驗證明,5-HT受體非選擇性拮抗劑metitepine可抑制果蠅5-HT2A,從而影響其取食活動[11]。Cai等[13]以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Haemonchuscontortus5-HT受體的配體PAPP為先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化來開發(fā)新型分子農(nóng)藥,共篩選出23個對黏蟲Mythimnaseparata具有抑制生長或是殺蟲活性的化合物。

目前在昆蟲體內(nèi)克隆鑒定到的5-HT受體并不多,且都屬于GPCRs[3]。根據(jù)氨基酸同源性及其偶聯(lián)介導(dǎo)的第二信號通路,昆蟲5-HT受體主要包括5-HT1、5-HT2和5-HT7受體類型[3]。在大多數(shù)昆蟲體內(nèi)各鑒定到2種5-HT1(5-HT1A和5-HT1B)和2種5-HT2(5-HT2A和5-HT2B)亞型,及1種5-HT7受體型[3,14-16]。另在菜粉蝶Pierisrapae體內(nèi)除鑒定到已知的5種5-HT受體外,還新鑒定到一種與脊椎動物沒有同源性的新型5-HT8 受體[17]。對昆蟲5-HT受體介導(dǎo)的生理功能研究表明,菜粉蝶5-HT1B和5-HT2B介導(dǎo)了血細(xì)胞的吞噬作用,可調(diào)控其免疫功能[18];果蠅5-HT1B參與調(diào)控對光的節(jié)律反應(yīng);埃及伊蚊Aedesaegypti5-HT2B參與成蚊脂質(zhì)積累及生長發(fā)育[19];果蠅5-HT7受體在其正常求偶與交配行為中扮演了重要角色[20];果蠅和家蠶Bombyxmori5-HT1A參與調(diào)控運動能力[21-22]。盡管5-HT及其受體在昆蟲生理活動中扮演了重要角色,但目前并沒有作用于5-HT受體靶標(biāo)的殺蟲劑問世。鑒于5-HT系統(tǒng)在調(diào)控昆蟲各種生理活動及行為方面的重要性,基于該類受體靶標(biāo)的新型殺蟲劑亟待研發(fā)。

棉鈴蟲Helicoverpaarmigera是世界上重要的農(nóng)作物害蟲之一,可為害多種作物。在我國,種植轉(zhuǎn) Bt棉及施用化學(xué)農(nóng)藥是主要的防控措施。然而,棉鈴蟲對傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥抗藥性增加及我國20多年種植單一類型Bt棉導(dǎo)致棉鈴蟲種群內(nèi)抗性基因頻率增加,使得近年來棉鈴蟲發(fā)生為害有增加的趨勢[23]。因此,尋找新型作用靶標(biāo)基因及開發(fā)新型靶標(biāo)位點殺蟲劑顯得尤為緊迫。本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)合RT-PCR克隆獲得了棉鈴蟲5-HT1和5-HT2基因,采用多序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建對5-HT受體基因進(jìn)行了分析,最后利用實時熒光定量PCR(real time quantitative PCR,RT-qPCR)對5-HT受體基因在棉鈴蟲幼蟲及成蟲不同組織的表達(dá)模式進(jìn)行分析,旨在為探究棉鈴蟲5-HT受體功能及探索其作為新型殺蟲劑靶標(biāo)位點的潛能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

棉鈴蟲于2018年采自河南省新鄉(xiāng)市郊區(qū)棉田,置于室內(nèi)人工氣候箱內(nèi)飼養(yǎng),培養(yǎng)條件為25～28℃,相對濕度70%～80%,光周期為L∥D=14 h∥10 h。幼蟲人工飼料配方及飼養(yǎng)方法參照梁革梅等[24]的方法進(jìn)行。幼蟲化蛹后,將雌雄蛹分開置于養(yǎng)蟲籠中,成蟲羽化后,給予10%蔗糖水補(bǔ)充營養(yǎng)。

1.2 棉鈴蟲總RNA提取與cDNA合成

采用TRIzol(美國Invitrogen公司)法提取棉鈴蟲幼蟲各個組織(頭、腸、上表皮、脂肪體和馬氏管)及雌雄成蟲各個組織(腦、觸角、腹部、翅和足)的RNA。用NanoDrop 2000超微量分光光度計(Thermo Fisher Scientific,MA,USA)檢測RNA濃度,并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(TaKaRa,大連,中國)反轉(zhuǎn)錄為cDNA,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 棉鈴蟲腦轉(zhuǎn)錄組測序和5-HT受體基因鑒定

濃度和純度檢驗合格的棉鈴蟲成蟲腦RNA(棉鈴蟲雌雄成蟲各100頭,使用鑷子打開其頭殼取出腦,提取腦RNA)送南京派森諾基因科技有限公司構(gòu)建cDNA文庫,由該公司采用Illumina HiSeqTM2500平臺進(jìn)行高通量測序獲取原始reads,去冗余獲得clean reads,進(jìn)一步利用Trinity軟件對獲取的clean reads進(jìn)行拼接。

在NCBI數(shù)據(jù)庫中對已知鱗翅目昆蟲的5-HT受體基因序列進(jìn)行比對,構(gòu)建本地數(shù)據(jù)庫,利用tBLASTn篩選棉鈴蟲腦轉(zhuǎn)錄組中的5-HT1和5-HT2序列。對篩選到的序列進(jìn)行人工校正。

1.4 基因克隆

根據(jù)棉鈴蟲腦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析獲得5-HT受體基因,利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物(表1),并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以成蟲cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。50 μL反應(yīng)體系:2×Phanta Max Buffer 25 μL、ddH2O 17 μL、10 μmol/L上、下游引物各2 μL、dNTP Mix 1 μL、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL、cDNA模板 2 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min;95℃變性15 s,退火溫度(表1)退火15 s,72℃延伸3 min,40個循環(huán);72℃再延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測,進(jìn)行切膠回收與純化,將回收產(chǎn)物連接到pMD-19T克隆載體上,轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞,并將經(jīng)菌液PCR鑒定為陽性的克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1 本研究中所用引物

1.5 棉鈴蟲5-HT1和5-HT2基因序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

使用ORF finder(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)對棉鈴蟲5-HT1和5-HT2進(jìn)行開放閱讀框預(yù)測。利用TMHMM 2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)對受體跨膜區(qū)域進(jìn)行預(yù)測。使用ClustalX對棉鈴蟲5-HT受體和其他昆蟲的5-HT受體進(jìn)行序列比對。利用MEGA 7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。進(jìn)化樹基于最大似然法原理,采用Bootstrap法進(jìn)行1 000次循環(huán)檢驗。在系統(tǒng)進(jìn)化樹分析中以家蠶和果蠅的神經(jīng)肽FMRF-amide受體作為外群。

1.6 實時熒光定量PCR

采用SYBR Green I實時熒光定量PCR在StepOne Plus實時熒光定量PCR儀(ABI,USA)上檢測5-HT1和5-HT2在棉鈴蟲幼蟲和成蟲不同組織中的相對表達(dá)水平。取20頭5齡棉鈴蟲幼蟲,于Ringer’s溶液中解剖獲得頭、腸、上表皮、脂肪體和馬氏管組織。取3日齡未交配雌雄成蟲各30頭,用鑷子打開頭殼取出腦,解剖剪截取觸角、腹部、翅和足。均設(shè)3次生物學(xué)重復(fù),獲取組織液氮冷凍后保存于-80℃冰箱,RNA提取和cDNA合成參照1.2。RT-qPCR反應(yīng)體系為25 μL:2×SYBR Premix ExTaq12.5 μL，cDNA模板2 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性3 min,95℃ 5 s,60℃ 30 s,40個循環(huán)。采用2-△△Ct法計算基因在不同組織間的相對表達(dá)量[25]。以棉鈴蟲β-actin基因(GenBank登錄號:HM629442.1)作為內(nèi)參對照。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

棉鈴蟲5-HT1和5-HT2在幼蟲和成蟲不同組織的相對表達(dá)量在DPS 7.05統(tǒng)計軟件中進(jìn)行One-way ANOVA方差分析,多重比較采用Tukey’s HSD法,雌雄成蟲相同組織基因相對表達(dá)量進(jìn)行Studentt測驗,差異顯著性檢驗水平為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉鈴蟲5-HT1和5-HT2基因的鑒定與序列驗證

棉鈴蟲腦轉(zhuǎn)錄組測序后清除帶接頭和低質(zhì)量序列共獲得雌腦45 981 772條和雄腦45 003 444條clean reads,序列經(jīng)過組裝后獲得37 174條 unigenes,平均長1 082 bp,N50和N90值分別為1 903 bp和413 bp。

在棉鈴蟲腦轉(zhuǎn)錄組(未發(fā)表數(shù)據(jù))中共鑒定到2個5-HT1和2個5-HT2亞型受體基因。根據(jù)同源序列比對將其命名為5-HT1A、5-HT1B、5-HT2A和5-HT2B(GenBank登錄號為ON921708～ON921711)。其開放閱讀框全長分別為1 401,1 347,1 917 bp和1 899 bp,分別編碼466,448,638和632個氨基酸,預(yù)測分子量分別為51.90,48.79,70.74 kD和69.92 kD,氨基酸序列都包含有7個跨膜區(qū)域,屬于典型的G蛋白偶聯(lián)受體。4個基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后,電泳顯示在約1 400 bp和1 900 bp位置各出現(xiàn)明亮的擴(kuò)增條帶,與預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致(圖1),測序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組的序列相同。

圖1 棉鈴蟲5-HT1和5-HT2基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 氨基酸序列相似性及進(jìn)化樹分析

4種棉鈴蟲5-HT受體間氨基酸序列相似性較低,僅有約18%～48%。而同一類型受體與其他鱗翅目昆蟲該類受體氨基酸序列相似性高于75%,與赤擬谷盜Triboliumcastaneum、意大利蜜蜂和果蠅的5-HT受體氨基酸序列相似性分別為50%、45%和35%左右。盡管與非鱗翅目5-HT受體氨基酸序列相似性較低,但是該類受體所具有的一些保守序列在同類受體氨基酸系列中具有高度保守性,如位于胞內(nèi)第二loop環(huán)N端的三聯(lián)D-R-Y模體,位于第6跨膜區(qū)的共有序列FxxxWxP及其緊鄰的一對苯丙氨酸殘基,一個位于第3跨膜區(qū)高度保守的天冬氨酸殘基等,這些保守區(qū)域被認(rèn)為可能參與了受體的激活及配體的結(jié)合[16,26-28](圖2,圖3)。

圖2 棉鈴蟲與其他昆蟲5-HT1亞型受體氨基酸序列比對

圖3 棉鈴蟲與其他昆蟲5-HT2亞型受體氨基酸序列比對

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明,不同家族的5-HT受體各自聚為一支,形成了3個分支;而5-HT1和5-HT2家族可明顯分別分成兩個亞家族,每個亞家族分支中鱗翅目昆蟲優(yōu)先聚為一類,與果蠅,意大利蜜蜂和赤擬谷盜進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn);棉鈴蟲5-HT受體與家蠶和煙草天蛾Manducasexta5-HT受體有較近的進(jìn)化關(guān)系(圖4)。

圖4 基于棉鈴蟲5-HT受體氨基酸序列采用最大似然法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 5-HT1和5-HT2基因在幼蟲不同組織中的差異表達(dá)

5-HT1A在幼蟲時期顯著、特異性地在頭部和上表皮組織高表達(dá),而在腸道、脂肪體和馬氏管組織中幾乎不表達(dá)(圖5a)。5-HT1B在棉鈴蟲幼蟲頭部高表達(dá),其次是馬氏管,前者比后者高2.2倍,而在腸道、脂肪體和上表皮組織低表達(dá)(圖5b)。5-HT2A和5-HT2B在幼蟲頭部表達(dá)量顯著高于其他組織(圖5c,5d)。

圖5 5-HT1和5-HT2基因在棉鈴蟲幼蟲不同組織的表達(dá)量

2.4 5-HT1和5-HT2基因在雌雄成蟲不同組織的差異表達(dá)

5-HT1A在棉鈴蟲腦和觸角高表達(dá),且在雄蟲腦表達(dá)水平顯著高于雌蟲腦,在雌蟲觸角和腹部的表達(dá)量顯著高于在雄蟲(圖6a)。5-HT1B在雌雄成蟲腦和雄蟲腹部高表達(dá),且在雄蟲腹部和翅的表達(dá)量顯著高于雌蟲,而在雌蟲觸角的表達(dá)量顯著高于雄蟲(圖6b)。5-HT2A在雌雄成蟲觸角顯著高表達(dá),在雌蟲觸角中的表達(dá)量是腦中表達(dá)量的4.4倍,在雄蟲觸角中的表達(dá)量是腦中表達(dá)量的5.8倍,且其在翅和足表達(dá)量具有性別差異(圖6c)。5-HT2B在雌蟲腹部顯著高表達(dá),是其在雄蟲腹部表達(dá)量的6.8倍,而其在雄蟲腦部表達(dá)量是雌蟲腦部表達(dá)量的3.4倍(圖6d)。

圖6 5-HT1和5-HT2基因在棉鈴蟲成蟲不同組織的表達(dá)量

3 結(jié)論與討論

截至目前,在昆蟲體內(nèi)鑒定到的5-HT受體都屬于GPCRs[3]。本研究中,通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)合RT-PCR技術(shù)各鑒定克隆到2類棉鈴蟲5-HT受體基因，5-HT1和5-HT2(5-HT1A,5-HT1B,5-HT2A和5-HT2B),它們都具有7次跨膜結(jié)構(gòu)域,屬于典型的GPCRs。其保守氨基酸序列內(nèi)同樣具有生物胺受體保守的三聯(lián)D-R-Y和FxxxWxP等特征序列,同源性比較結(jié)果顯示,棉鈴蟲5-HT1和5-HT2氨基酸序列與家蠶和煙草天蛾親緣關(guān)系更近。

大量行為試驗表明,組織特異性表達(dá)的基因所行使的功能常與該組織發(fā)揮的生理功能相關(guān)。昆蟲5-HT受體在腦及腹神經(jīng)索高表達(dá),進(jìn)一步證實5-HT受體在昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起到重要的神經(jīng)信號調(diào)節(jié)作用[3,28-29]。如5-HT1A受體在意大利蜜蜂腦內(nèi)參與視覺信息處理的部位高表達(dá),進(jìn)一步通過行為試驗證實5-HT1A受體參與調(diào)控意大利蜜蜂對光反應(yīng)過程[30]。果蠅5-HT1A、5-HT2A和5-HT7受體在成蟲頭部表達(dá),其主要參與果蠅的學(xué)習(xí)和記憶過程[31];在幼蟲期,這些受體參與了嗅覺行為選擇和嗅覺學(xué)習(xí)及記憶等[32]。對小菜蛾P(guān)lutellaxylostella和埃及伊蚊5-HT受體組織表達(dá)研究表明,5-HT受體基因在成蟲期的表達(dá)量顯著高于幼蟲期,并且5-HT受體基因在雌雄成蟲體內(nèi)的表達(dá)量具有顯著的性別差異,在雄成蟲的表達(dá)量顯著高于雌成蟲[29,33]。

本研究發(fā)現(xiàn), 5-HT1B和5-HT2B在棉鈴蟲成蟲腦的表達(dá)量約是幼蟲頭部表達(dá)量的100倍,5-HT2A在成蟲觸角的表達(dá)量約是幼蟲頭部表達(dá)量的100倍,推測此3類受體主要在棉鈴蟲成蟲期發(fā)揮重要生理功能。5-HT1A在成蟲腦的表達(dá)量約是幼蟲頭部表達(dá)量的4倍,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于以上3類基因在成蟲與幼蟲間的表達(dá)差異。有研究表明5-HT1A參與調(diào)控家蠶成蟲和幼蟲的運動能力[22]。據(jù)此推測棉鈴蟲5-HT1A在成蟲和幼蟲期可能發(fā)揮類似的功能,因此其在成蟲和幼蟲期都需大量表達(dá)。4種棉鈴蟲5-HT受體基因都在幼蟲期頭部顯著高表達(dá),推測這4種5-HT受體在幼蟲期可能主要參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控。5-HT1A和5-HT1B分別在棉鈴蟲幼蟲期的上皮組織和馬氏管的表達(dá)量僅次于在頭部表達(dá)量,推測這兩種受體可能在表皮形成、幼蟲運動及代謝物吸收和排泄等活動中發(fā)揮功能。5-HT1A、5-HT1B和5-HT2B在棉鈴蟲雌雄成蟲的腦、觸角或腹部表達(dá)具有性別差異,推測這些受體可能參與到特定的性行為中(嗅覺識別及生殖發(fā)育等)。5-HT1A和5-HT2B在棉鈴蟲雌成蟲腹部表達(dá)量顯著高于雄成蟲,5-HT1B在雄成蟲腹部表達(dá)量顯著高于雌成蟲,推測該類受體可能在雌雄生殖系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。Ling等[19]發(fā)現(xiàn)5-HT2B參與埃及伊蚊成蟲脂質(zhì)積累,我們發(fā)現(xiàn)5-HT2B在棉鈴蟲雌成蟲腹部高表達(dá),因此可推測其在棉鈴蟲雌性生殖過程中同樣扮演了重要的角色。5-HT1A和5-HT1B在雌成蟲觸角的表達(dá)量顯著高于雄成蟲觸角,而觸角是昆蟲主要的嗅覺器官,棉鈴蟲雌成蟲觸角在感受寄主植物揮發(fā)氣味及產(chǎn)卵寄主植物選擇中具有重要作用,推測這2種受體可能參與了該生理過程中。4種5-HT受體基因在棉鈴蟲幼蟲階段低表達(dá),而在成蟲期高表達(dá),推測這些受體可能主要參與成蟲嗅覺識別、生殖發(fā)育、求偶和寄主植物定位等生理功能。

本研究從棉鈴蟲轉(zhuǎn)錄組中篩選并克隆了4種5-HT受體基因(5-HT1A、5-HT1B、5-HT2A和5-HT2B),分析明確了此4種基因的序列特征,并對這4種基因的mRNA表達(dá)模式進(jìn)行了解析。該研究結(jié)果為未來利用RNA干擾或CRISPR基因編輯技術(shù)進(jìn)一步研究該類基因的功能奠定了基礎(chǔ)。