于思琪, 湯金榮, 張彩虹, EI THINZAR SOE, 梁革梅,2*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室, 北京 100193; 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院西部農(nóng)業(yè)研究中心, 昌吉 831100)

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)高度保守,在細胞增殖、分化和遷移等過程中發(fā)揮著重要作用,還參與細胞對環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)、炎癥反應(yīng)、抗逆性等多種重要的生理過程[1]。MAPK通過4級磷酸化級聯(lián)反應(yīng)給鄰近的蛋白質(zhì)傳遞信號[2],主要有4條信號通路,分別為:c-Jun氨基末端激酶途徑(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、蛋白激酶 P38 途徑(protein kinase 38,P38)、細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶途徑(extracellular signal-regulated protein kinase,ERK)和ERK5/BMK1(big MAP kinase 1)途徑[3]。JNK信號通路是MAPK中的重要通路之一,已有文獻報道昆蟲JNK 在響應(yīng)殺蟲劑、低溫、外來病原微生物、紫外輻射的應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用,如:低溫可以誘導(dǎo)激活西花薊馬Frankliniellaoccidentalis體內(nèi)JNK、P38信號通路,引起應(yīng)激反應(yīng)[4];煙粉虱Bemisiatabaci的JNK基因在響應(yīng)細菌、真菌的脅迫時發(fā)揮著重要作用[5];白紋伊蚊Aedesalbopictus的JNK基因響應(yīng)熱滅活細菌脅迫,且在30 min時表達量達到最大[6];當棉鈴蟲Helicoverpaarmigera受到紫外輻射時,其JNK信號通路被激活并發(fā)生一系列的應(yīng)激反應(yīng)[7]。而且JNK信號通路還參與昆蟲的發(fā)育和免疫反應(yīng)等,如JNK在果蠅Drosophila的形態(tài)發(fā)育和免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮作用[8];白紋伊蚊幼蟲的JNK基因被干擾后48 h死亡率會顯著增加[9]。

Bt是目前世界上產(chǎn)量最大、應(yīng)用最廣的生物殺蟲劑。由于Bt殺蟲蛋白具有殺蟲效果好、安全、高效等優(yōu)點[10-13],Bt殺蟲基因已廣泛用于抗蟲轉(zhuǎn)基因作物的研制[14],但是靶標害蟲對其也存在一系列的應(yīng)激與免疫反應(yīng),甚至有些靶標害蟲產(chǎn)生了抗性[1,15-21]。因此,明確Bt蛋白殺蟲機制和昆蟲對殺蟲蛋白產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)的作用機制對延長Bt產(chǎn)品的使用壽命具有重要意義。研究表明,小菜蛾P(guān)lutellaxylostella中腸Bt殺蟲蛋白受體受位于抗性基因座內(nèi)的MAPK途徑調(diào)控,與敏感品系相比,Bt Cry1Ac抗性品系中MAP4K4基因顯著上調(diào),并反式調(diào)控多個抗性基因差異表達[22-25]。

JNK途徑可由多種生物因子或非生物因子激活,昆蟲取食Bt殺蟲蛋白后其免疫系統(tǒng)會產(chǎn)生一系列的應(yīng)激、免疫反應(yīng)[26-27]。因此,我們推測JNKs可能參與棉鈴蟲抵御Bt殺蟲蛋白傷害及對其產(chǎn)生抗性的過程。本研究克隆得到兩條棉鈴蟲JNK基因序列,分別命名為HaJNK1、HaJNK2,通過熒光定量PCR分析了HaJNKs的時空表達譜,并比較了棉鈴蟲取食Cry1Ac蛋白后對HaJNKs表達量的影響,以期為進一步揭示棉鈴蟲HaJNKs基因在抵御Bt殺蟲蛋白及對其產(chǎn)生抗性機制中的作用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試昆蟲:棉鈴蟲96S敏感品系,1996年采自河南省新鄉(xiāng)市棉田,在實驗室人工飼養(yǎng)至今,未接觸任何Bt殺蟲蛋白或殺蟲劑。幼蟲用人工飼料飼養(yǎng),成蟲飼喂10%的糖水[28]。飼養(yǎng)溫度為(27±2)℃,光周期為L∥D=14 h∥10 h,相對濕度為(75±10)%。

供試殺蟲蛋白:Cry1Ac蛋白,購自北京綻諾思特生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1樣品收集

不同組織:選取2日齡的5齡棉鈴蟲90頭,每30頭作為1個重復(fù),共3個重復(fù)。幼蟲置于冰上解剖并分別截取以下10種組織:頭、表皮、唾液腺、脂肪體、前腸、中腸、后腸、馬氏管、血淋巴、性腺,取樣后在0.7% NaCl溶液中清洗,濾紙吸干,然后立刻置于1.5 mL離心管中,放入液氮或-80℃保存。

不同發(fā)育時期:收集不同發(fā)育時期的棉鈴蟲,卵400粒、1齡幼蟲100頭、2齡幼蟲50頭、3齡幼蟲20頭、4齡和5齡幼蟲各10頭、雌蛹、雄蛹、雌成蟲、雄成蟲各10頭為1次重復(fù),每個時期設(shè)3次重復(fù)。取樣后立刻置于液氮或-80℃保存。

1.2.2RNA提取與cDNA合成

按照說明書用TRIzol試劑提取總RNA,并在NanoDrop 1000(Thermo Fisher)紫外分光光度計檢測總RNA的濃度和質(zhì)量,確保A260/A280、A260/A230均在1.8～2.2范圍內(nèi),之后用瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量。按照HiScript III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)試劑盒說明書合成cDNA第一鏈(南京諾唯贊生物科技股份有限公司),并置于-20℃保存(用于定量的樣品取1 μg RNA用于反轉(zhuǎn)錄)。

1.2.3HaJNK基因的克隆

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫的棉鈴蟲HaJNK序列,利用primer3 plus設(shè)計PCR特異性引物(表1),以4齡幼蟲中腸cDNA為模板,進行PCR擴增,體系如下:2 × Phanta Max Master Mix 25 μL,上、下游引物各2 μL,cDNA模板2 μL,超純水 19 μL。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性15 s,60℃退火15 s,72℃延伸1 min 30 s,35個循環(huán),72℃延伸5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收目的條帶并純化,而后將純化產(chǎn)物連接到pEASY-Blunt Simple(全式金北京生物技術(shù)有限公司)克隆載體上,并轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細胞中,待細胞復(fù)蘇后,取200 μL涂在含有氨芐抗生素的培養(yǎng)基上,37℃過夜培養(yǎng),之后挑取單克隆,菌液PCR驗證后挑取陽性菌液送至深圳華大基因有限公司進行測序。

1.2.4序列分析以及進化樹的構(gòu)建

利用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進行拼接并比對,利用NCBI中ORF finder預(yù)測開放閱讀框,并翻譯成氨基酸序列。利用ExPaSy(http:∥web.expasy.org/compute_pi)預(yù)測HaJNK蛋白的分子量和等電點,Sig-nalP 4.1 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/Sig-nalP/)預(yù)測HaJNK的信號肽,NCBI CDD(Conserved Domain Database)預(yù)測HaJNK的保守結(jié)構(gòu)域,利用SWISS MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org/)預(yù)測蛋白的三級結(jié)構(gòu)。利用NCBI-Blast(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在線搜索得到棉鈴蟲HaJNK的同源蛋白,使用MEGA 7.0軟件鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5RT-qPCR分析HaJNK的時空表達

基于HaJNK基因序列,用Primer5設(shè)計RT-qPCR特異性引物,內(nèi)參基因為RPS15(基因序列號:AY818611.1)與18S(基因序列號:AB620126.1),合成并進行引物擴增效率檢測(表1)。模板為棉鈴蟲不同發(fā)育時期、不同組織的cDNA,利用ABI QuantStudio 6(Thermo Fisher)高產(chǎn)率實時熒光定量PCR儀擴增。反應(yīng)總體系20 μL:2×TaqPro Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL,上、下游引物各0.4 μL,超純水為7.2 μL,cDNA模板2 μL。反應(yīng)條件參照TaqPro Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒的說明書:95℃預(yù)變性30 s;95℃變性10 s,60℃退火/延伸20 s,40個循環(huán);采用2-ΔΔCt法分析HaJNK基因的相對表達量[29]。

表1 本研究所用引物

1.2.6取食Cry1Ac對HaJNKs基因表達量的影響

用20、40、80 ng/μL Cry1Ac分別處理4齡棉鈴蟲,分別在0、3、6、12、24、48 h時取樣,每次取10頭為1個重復(fù)，每個時間段3個生物學(xué)重復(fù)。進行熒光定量PCR檢測HaJNKs基因的變化。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS Statistics 26軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)分析不同發(fā)育時期、組織的表達量之間以及Cry1Ac處理前后HaJNK表達量的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 HaJNK基因克隆和生物信息學(xué)分析

經(jīng)克隆及多次重復(fù)測序得到兩條HaJNK序列,分別命名為HaJNK1、HaJNK2,其開放閱讀框分別為1 191 bp和1 143 bp,分別編碼396、380個氨基酸。部分序列對比如圖1所示。預(yù)測HaJNK1和HaJNK2的蛋白分子量分別為45.07 kD和43.32 kD,等電點為6.49、6.06。HaJNK1與HaJNK2均存在于細胞質(zhì)中,無信號肽。HaJNK1與HaJNK2蛋白的三維結(jié)構(gòu)存在差異,HaJNK1在起始位置多兩個發(fā)夾結(jié)構(gòu)(圖2)。

圖1 棉鈴蟲HaJNKs的部分DNA序列與氨基酸序列

圖2 預(yù)測的棉鈴蟲HaJNKs蛋白三維結(jié)構(gòu)

2.2 HaJNK進化樹分析

序列對比結(jié)果顯示，棉鈴蟲的HaJNK與鱗翅目昆蟲的同源性都較高,其中HaJNK1與黏蟲聚為一支,親緣關(guān)系較近, HaJNK2與家蠶聚為一支,它們的親緣關(guān)系較近(圖3)。

圖3 基于HaJNK氨基酸序列采用鄰接法構(gòu)建棉鈴蟲和相關(guān)昆蟲的系統(tǒng)進化樹

2.3 HaJNK的時空表達譜

2個HaJNK基因在棉鈴蟲的各個發(fā)育階段都有表達,不同發(fā)育階段的表達量存在顯著差異(HaJNK1:F=47.81,P=0.001;HaJNK2:F=38.34,P=0.001)。HaJNK1和HaJNK2均在卵期表達量最高,其次HaJNK1在雌成蟲、2齡幼蟲中表達量較高,HaJNK2表達量較高的是雌成蟲和1齡幼蟲(圖4)。

圖4 HaJNK基因在棉鈴蟲不同發(fā)育時期的表達量

2個HaJNK基因在棉鈴蟲的不同組織中均有表達,不同組織中的表達量存在顯著差異(HaJNK1:F=31.39,P=0.001;HaJNK2:F=20.88,P=0.001)。其中HaJNK1在性腺中表達量最高,其次是唾液腺,頭和表皮中也有較高的表達量;HaJNK2在頭部表達量最高,顯著高于其他組織(圖5)。

圖5 HaJNK基因在棉鈴蟲不同組織的表達量

2.4 取食Cry1Ac后HaJNKs表達量變化

取食相同濃度Cry1Ac不同時間的棉鈴蟲中HaJNKs的表達量存在顯著差異，P值均小于0.05。隨時間的變化HaJNK1和HaJNK2的表達量都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(圖6)。HaJNK1和HaJNK2的表達量分別在20 ng/μL的Cry1Ac處理6 h、40 ng/μL的Cry1Ac處理12 h和80 ng/μL的Cry1Ac處理12 h后達到最高;HaJNK1和HaJNK2均在80 ng/μL Cry1Ac處理12 h時表達量達到最高。

圖6 不同濃度Cry1Ac脅迫處理后棉鈴蟲HaJNKs表達量的變化

3 結(jié)論與討論

MAPK信號通路在調(diào)節(jié)生物生長、發(fā)育、繁殖過程中起到至關(guān)重要的作用,也是免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵因子,JNK作為其中一種重要通路發(fā)揮的作用不可小覷[6]。已有報道表明JNK在昆蟲抵御低溫、紫外、外來病原微生物脅迫過程中起到了重要作用。本文利用1對引物克隆棉鈴蟲的HaJNK基因,通過大量樣本測序發(fā)現(xiàn),除了已經(jīng)被鑒定過的HaJNK1之外,還發(fā)現(xiàn)HaJNK2基因,同時兩個HaJNK基因還存在不同的剪切本。經(jīng)過序列比對,發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲HaJNK2與HaJNK1序列一致性達98.77%,Query Cover為92.00%。經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)兩個HaJNK在起始位置相差16個氨基酸(圖1b),蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn),這16個氨基酸編碼的蛋白質(zhì)折疊成為2個發(fā)夾結(jié)構(gòu)(圖2a)。由于前人研究發(fā)現(xiàn)激酶的磷酸化會受到發(fā)夾結(jié)構(gòu)的影響,而磷酸化水平會直接影響蛋白質(zhì)功能[30]。因此,我們推測這可能造成HaJNK1和HaJNK2在棉鈴蟲體內(nèi)發(fā)揮不同的功能。

進化樹分析結(jié)果表明,棉鈴蟲HaJNK1與二化螟、家蠶進化為同一支,再與棉鈴蟲HaJNK2聚為一支,它們在親緣關(guān)系上較近。因此,可能與其他鱗翅目昆蟲的JNK基因存在類似的功能,參與抵御外來病原微生物等的應(yīng)激及免疫反應(yīng)。時空表達譜分析表明HaJNKs在棉鈴蟲不同組織、不同齡期均有表達,說明HaJNK存在于棉鈴蟲的整個生命過程中,可能參與生物體的生長、發(fā)育、繁殖等過程。隨著棉鈴蟲的生長發(fā)育HaJNKs的表達量呈現(xiàn)出先高后低的趨勢,HaJNKs在卵期高表達,顯著高于其他發(fā)育時期,HaJNK1在性腺中表達量最高,其次是唾液腺,HaJNK2在頭部表達量最高,其次是性腺。報道顯示,果蠅卵期JNK高表達可能是因為JNK通路參與卵的形成,并在卵泡細胞和其他上皮細胞的形態(tài)發(fā)生過程中起到重要作用[31];棉鈴蟲頭部HaJNK表達量高可能是由于復(fù)眼視網(wǎng)膜細胞是昆蟲感受外界光刺激的主要場所,HaJNK將外界光刺激的胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi),因此含有復(fù)眼的頭部HaJNK高表達[7]。我們推測HaJNK基因在棉鈴蟲各發(fā)育時期、組織中發(fā)揮著重要的功能,除參與卵形成、感受光刺激等功能外,還可能參與性別分化[32],且兩種HaJNK基因在不同的組織中發(fā)揮的功能有所不同。

棉鈴蟲受到Cry1Ac脅迫誘導(dǎo)后HaJNKs的表達量呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。低濃度(20 ng/μL)Cry1Ac處理6 h后,HaJNK1和HaJNK2表達量達到最高,分別為對照組棉鈴蟲的2.23倍、2.39倍;高濃度(40 ng/μL、80 ng/μL)Cry1Ac處理12 h后,HaJNK1和HaJNK2表達量達到最高,其中80 ng/μL處理分別為對照組棉鈴蟲的3.32倍、2.71倍。這與其他昆蟲中的報道類似,經(jīng)過Cry蛋白處理后亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis的MAPKs基因有明顯的上調(diào)現(xiàn)象[33],推測受到Cry蛋白的脅迫后引起了MAPK通路的免疫反應(yīng)。煙粉虱被病原菌侵染后JNK的mRNA水平與蛋白磷酸化水平顯著升高,說明JNK信號通路在煙粉虱抵抗病原菌侵染過程中起到重要作用[5];JNK信號通路被果蠅免疫反應(yīng)中的LSP所激活,參與果蠅的免疫反應(yīng)[8]。而且,棉鈴蟲取食Cry1Ac后HaJNK表達量的升高,也可能激活MAPK通路,通過反式調(diào)控棉鈴蟲中腸上相關(guān)Bt受體蛋白基因的表達,降低受體蛋白與Bt蛋白的結(jié)合,從而減少對棉鈴蟲的為害[34-35]。關(guān)于HaJNK在Cry1Ac對棉鈴蟲的毒力過程中的作用,后續(xù)我們將進一步探索研究。