溫雪梅, 秦子昕, 路 偉, 黃建輝,歐陽(yáng)嘉敏, 萬(wàn) 妍, 邵雪花

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶果樹(shù)生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東省熱帶亞熱帶果樹(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510640; 2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 棉花教育部工程研究中心,自治區(qū)農(nóng)林有害生物監(jiān)測(cè)與安全防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 烏魯木齊 830052; 3.廣東省中山市坦洲鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心, 中山 528400)

斜紋夜蛾Spodopteralitura(Fabricius)是一種世界性分布的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng),其幼蟲(chóng)可為害十字花科、茄科、豆科以及花卉等300多種植物[1-2]。其繁殖力高、生命周期短和遷移能力強(qiáng)等特點(diǎn)增加了田間防治難度[3],化學(xué)防治為其主要防治手段,但隨著人們對(duì)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的重視,對(duì)綠色食品、有機(jī)食品的需求越來(lái)越多,這為生物農(nóng)藥的發(fā)展帶來(lái)新的契機(jī)。因此,挖掘靶向斜紋夜蛾的高活性天然產(chǎn)物非常重要。

東革內(nèi)酯(eurycomalactone,EC)來(lái)源于東革阿里Eurycomalongifolia(Jack)根部。該類(lèi)化合物是一類(lèi)具有苦味的降三萜類(lèi)物質(zhì),不僅在醫(yī)學(xué)上具有抗瘧疾[4]、抗腫瘤、抗癌[5-7]、抗炎、抗病毒[8]等藥理作用,在農(nóng)業(yè)上亦對(duì)多種害蟲(chóng)具有拒食和毒殺等生物活性。從印度黃楝樹(shù)Samaderaindica種子和樹(shù)皮中分離的4個(gè)苦木苦味素類(lèi)化合物(indaquassin C和samaderines A、B、C)對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)具有良好的拒食作用[9];從牛筋果Harrisoniaperforata(Blanco)枝葉中分離得到苦木苦味素類(lèi)化合物perforalactone A和perforalactone B對(duì)蚜蟲(chóng)具有較好的毒殺活性[10];從鴉膽子Bruceajavanica(Linn)中分離得到的苦木苦味素類(lèi)化合物鴉膽因D對(duì)小菜蛾P(guān)lutellaxylostella的拒食活性為印楝素的6.2倍[11]。近期,作者從東革阿里中分離得到了東革內(nèi)酯、寬纓酮(eurycomanone)、13,21-dihydroeurycomanone、11-dehydroklaineanone、15β-hydroxyklaineanone、eurycolactone F、6α-hydroxyeurycomalactone等7個(gè)苦木苦味素類(lèi)化合物。研究表明,寬纓酮對(duì)草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda、斜紋夜蛾、小菜蛾及甜菜夜蛾Spodopteraexigua等鱗翅目害蟲(chóng)的拒食及抑制生長(zhǎng)活性與印楝素相當(dāng)或更高,同時(shí)兼具良好的植物內(nèi)吸特性[12-18]。東革內(nèi)酯具有抗癌、抗炎及抗病毒等藥理作用,臨床上常被作為有效的核因子κB(NF-κB)抑制劑使用[19],但其是否可抑制昆蟲(chóng)細(xì)胞增殖及毒理機(jī)制目前尚未見(jiàn)報(bào)道?；诖?本文以斜紋夜蛾卵巢細(xì)胞SL-221為研究對(duì)象,采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度東革內(nèi)酯對(duì)SL-221細(xì)胞的毒力,并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定該化合物對(duì)SL-221細(xì)胞周期、線粒體膜電位及凋亡的影響;最后,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)探究東革內(nèi)酯處理SL-221細(xì)胞后相關(guān)基因的表達(dá)情況,旨在探究東革內(nèi)酯誘導(dǎo)SL-221細(xì)胞發(fā)生凋亡的分子機(jī)制,為斜紋夜蛾的綠色防控和東革內(nèi)酯的開(kāi)發(fā)利用提供新的視角。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1供試細(xì)胞

斜紋夜蛾卵巢細(xì)胞SL-221,由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所資源與環(huán)境實(shí)驗(yàn)室提供,用SIM SF昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基(含5%胎牛血清),在27℃恒溫箱中培養(yǎng)。

1.1.2供試藥劑

東革內(nèi)酯(eurycomalactone,EC),分子量348,CAS號(hào):23062-24-0,由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所資源與環(huán)境實(shí)驗(yàn)室提供,結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 東革內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)式

1.1.3供試試劑和儀器

供試試劑及試劑盒:胎牛血清購(gòu)自蒙馬生物科技有限公司;SIM SF Expression Medium(MSF1)、CCK-8(M128)、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(C1052)、Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(CA1020)、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(M8650)和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;RNA提取試劑盒、呲溜極速反轉(zhuǎn)錄試劑盒和2×M5 HiPer Realtime PCR Super mix with Low Rox(SYBR green with anti-Taq)(MF797-05)均購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司;PBS緩沖液購(gòu)自博奧森生物技術(shù)有限公司;印楝素,純度≥98%,由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

供試儀器:恒溫培養(yǎng)箱(DH-360)購(gòu)自北京科偉永興儀器有限公司;多功能酶標(biāo)儀(Spark)購(gòu)自上海帝肯實(shí)驗(yàn)器材有限公司;流式細(xì)胞儀(FACS Verse)購(gòu)自上海土森視覺(jué)科技有限公司;熒光定量PCR儀(Quant Studio 3)購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1CCK-8法檢測(cè)東革內(nèi)酯對(duì)SL-221細(xì)胞的毒力

將凍存的SL-221細(xì)胞置于37℃水浴迅速攪拌融化,在超凈工作臺(tái)內(nèi)將細(xì)胞液轉(zhuǎn)入2 mL離心管,800 r/min離心5 min,棄上清,用2 mL含10%胎牛血清的SIM SF昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)于細(xì)胞培養(yǎng)瓶,27℃恒溫箱中培養(yǎng)。用DMSO將東革內(nèi)酯配制成10 mg/mL的母液,并用無(wú)血清SIM SF培養(yǎng)基逐級(jí)稀釋至100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL和1.562 5 μg/mL。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SL-221細(xì)胞,用含5%胎牛血清的SIM SF培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至5×105cfu/mL,接種于96孔板,每孔100 μL,置于27℃恒溫箱過(guò)夜。試驗(yàn)前棄去96孔板中原有的含血清培養(yǎng)基,分別加入各濃度含藥培養(yǎng)基,每濃度4板重復(fù),以含0.1% DMSO的無(wú)血清SIM SF培養(yǎng)基作為空白對(duì)照,以相同濃度印楝素處理作為陽(yáng)性對(duì)照,置于27℃恒溫箱孵育48 h。48 h后向每孔中加入10 μL CCK-8溶液,繼續(xù)避光孵育2～3 h。最后用酶標(biāo)儀測(cè)定其在450 nm處的吸光度,根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞抑制率,并利用SPSS軟件計(jì)算其抑制中濃度(IC50)。

細(xì)胞增殖抑制率=(A零加藥-A加藥)/(A零加藥-A空白)×100%,式中,A加藥為含有SL-221細(xì)胞、含藥培養(yǎng)基和CCK-8溶液孔的吸光度;A空白為含有含藥培養(yǎng)基和CCK-8溶液孔的吸光度;A零加藥為含SL-221細(xì)胞、CCK-8溶液但無(wú)藥劑孔的吸光度。

1.2.2東革內(nèi)酯對(duì)SL-221細(xì)胞形態(tài)的影響

用DMSO將東革內(nèi)酯配制成10 mg/mL母液,在無(wú)血清SIM SF昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基中添加?xùn)|革內(nèi)酯使其終濃度為4 μg/mL。用含5%胎牛血清的SIM SF培養(yǎng)基將SL-221細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(5×105cfu/mL),取2 mL接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿(d=6 cm)中,置于27℃恒溫箱培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到85%～90%時(shí),棄去原有培養(yǎng)基,更換為含4 μg/mL東革內(nèi)酯的SIM SF培養(yǎng)基,培養(yǎng)0、3、6、12、24 h和48 h后在倒置顯微鏡下觀察,其中0 h為對(duì)照。拍照記錄細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)東革內(nèi)酯對(duì)SL-221細(xì)胞周期的影響

用DMSO將東革內(nèi)酯配制成10 mg/mL母液,進(jìn)而配制含1 μg/mL東革內(nèi)酯的無(wú)血清SIM SF培養(yǎng)基。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SL-221細(xì)胞(5×105cfu/mL)接種至12孔板,每孔2 mL,于27℃恒溫箱培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到85%～90%時(shí),棄去原有培養(yǎng)基,加入含1 μg/mL東革內(nèi)酯的SIM SF培養(yǎng)基,培養(yǎng)0、3、6、12、24 h和48 h,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔, 試驗(yàn)重復(fù)3次,于27℃恒溫箱中分別孵育0、3、6、12、24 h和48 h,其中0 h為對(duì)照。之后收集細(xì)胞,800 r/min離心5 min,棄上清。用PBS洗滌細(xì)胞,然后加入預(yù)冷的70%乙醇置于4℃冰箱過(guò)夜。次日用PBS洗滌細(xì)胞2次,加入100 μL RNaseA溶液重懸細(xì)胞,37℃水浴30 min;之后加入400 μL PI染色液,4℃避光孵育30 min。完成后立即用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處檢測(cè)紅色熒光,用FlowJo軟件統(tǒng)計(jì)分析處于G0/G1(DNA合成前期)、S(DNA合成期)和G2/M(DNA合成后期)的細(xì)胞數(shù)量。

1.2.4JC-1熒光標(biāo)記法檢測(cè)東革內(nèi)酯對(duì)SL-221細(xì)胞線粒體膜電位的影響

細(xì)胞處理方法和重復(fù)情況同1.2.3。收集1 μg/mL東革內(nèi)酯分別處理0、3、6、12、24 h和48 h后的細(xì)胞,用PBS清洗細(xì)胞2次。之后加入0.5 mL JC-1染色工作液,37℃避光孵育20 min;孵育結(jié)束后,600 r/min離心4 min,棄上清,用JC-1染色緩沖液(1×)清洗細(xì)胞2次;再加入1 mL JC-1染色緩沖液(1×)重懸細(xì)胞。最后置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)585 nm,發(fā)射波長(zhǎng)590 nm處的PE(紅色)熒光;激發(fā)波長(zhǎng)515 nm,發(fā)射波長(zhǎng)529 nm處的FITC(綠色)熒光,并計(jì)算紅綠熒光的相對(duì)比例來(lái)衡量線粒體膜電位變化情況(紅綠熒光的相對(duì)比例=紅色熒光百分比/綠色熒光百分比)。

1.2.5Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染檢測(cè)東革內(nèi)酯對(duì)SL-221細(xì)胞凋亡的影響

Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒是一種采用Annexin Ⅴ-FITC與PI雙染法進(jìn)行細(xì)胞早期凋亡分析的檢測(cè)試劑盒。正常細(xì)胞具有完好的細(xì)胞膜,此時(shí)細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸(phosphotidylserine,PS)位于胞膜內(nèi)側(cè)。細(xì)胞早期凋亡時(shí),細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,使胞膜內(nèi)側(cè)的PS外翻到胞膜表面。根據(jù)Annexin Ⅴ易于結(jié)合PS并對(duì)其高度親和的特性可檢測(cè)凋亡的細(xì)胞。熒光染料碘化丙啶(propidiumiodide,PI)不能通過(guò)正常細(xì)胞,但能對(duì)凋亡晚期的細(xì)胞進(jìn)行染色,因此將Annexin Ⅴ與PI配合染色,以區(qū)別凋亡早期細(xì)胞和凋亡晚期細(xì)胞。細(xì)胞處理方法和重復(fù)情況同1.2.3。收集1 μg/mL東革內(nèi)酯分別處理0、3、6、12、24 h和48 h后的細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次,800 r/min離心5 min,棄上清;加入250 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞;取100 μL細(xì)胞懸液放入流式管中,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL PI溶液,輕搖混勻,避光孵育15 min。置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)535 nm,發(fā)射波長(zhǎng)615 nm處的PI(紅色)熒光;激發(fā)波長(zhǎng)488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)525 nm處的FITC(綠色)熒光,并用FlowJo軟件分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6RT-qPCR法檢測(cè)東革內(nèi)酯對(duì)SL-221細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)情況的影響

細(xì)胞處理方法同1.2.3,以SL-Actin作為內(nèi)參基因,引物序列見(jiàn)表1,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。收集1、2 μg/mL和4 μg/mL東革內(nèi)酯分別處理0、3、6、12、24 h和48 h后的SL-221細(xì)胞,其中0 h為對(duì)照,利用RNA提取試劑盒提取其總RNA,再通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。反應(yīng)體系(20 μL):5×Sprint gDNA Remover Mix 2 μL、RNA模板1 μL、DEPC-ddH2O 7 μL,將反應(yīng)液混勻,42℃溫育2 min,冰上冷卻;再加入5×M5 Sprint RT Mix 4 μL、DEPC-ddH2O 6 μL,50℃ 5 min、85℃ 5 s。利用SYBR green with anti-Taq試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系(10 μL):cDNA 1 μL、2×M5 HiPer Realtime PCR Super mix with Low Rox 5 μL、Primer 0.5 μL,RNase Free ddH2O 3.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性 30 s;95℃ 5 s,60℃ 30 s,40個(gè)循環(huán);95℃ 15 s,60℃ 1 min,95℃ 15 s。每樣品重復(fù)3次,通過(guò)熒光定量PCR得到目的基因與內(nèi)參基因的Ct值,利用2-ΔΔCt法(△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)計(jì)算不同處理時(shí)間下SL-221細(xì)胞相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 斜紋夜蛾生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因 RT-qPCR 引物序列

1.3 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)結(jié)果均為3次以上重復(fù)試驗(yàn)所得,運(yùn)用IBM SPSS Statistics 19軟件分析數(shù)據(jù),各處理組所得平均值之間的差異通過(guò)單因素方差分析及Duncan氏多重比較進(jìn)行檢驗(yàn)評(píng)估,P<0.05表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異,使用ImageJ軟件處理細(xì)胞圖片,FlowJo軟件分析細(xì)胞流式數(shù)據(jù),Origin 2017進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CCK-8法檢測(cè)東革內(nèi)酯對(duì)SL-221細(xì)胞的毒力

檢測(cè)結(jié)果(表2)顯示,東革內(nèi)酯對(duì)SL-221細(xì)胞48 h的IC50為1.98 μg/mL,而陽(yáng)性對(duì)照印楝素48 h的IC50為7.51 μg/mL,東革內(nèi)酯對(duì)SL-221細(xì)胞有明顯的抑制細(xì)胞增殖的活性。濃度為1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL和100 μg/mL的東革內(nèi)酯處理48 h的細(xì)胞增殖抑制率分別為43.87%、58.96%、66.52%、74.42%、79.41%、81.51%和86.97%(圖2)。東革內(nèi)酯對(duì)SL-221細(xì)胞的抑制增殖活性與濃度呈正相關(guān)。

表2 東革內(nèi)酯對(duì)SL-221細(xì)胞的毒力

圖2 東革內(nèi)酯處理SL-221細(xì)胞48 h的細(xì)胞增殖抑制率

2.2 東革內(nèi)酯處理后SL-221細(xì)胞形態(tài)變化

經(jīng)4 μg/mL東革內(nèi)酯處理后SL-221細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)了明顯變化。從圖3可以看出,0 h(對(duì)照)時(shí),SL-221細(xì)胞形態(tài)飽滿光滑,呈圓形或橢圓形;處理 3 h 和6 h后,細(xì)胞膜光滑度下降,部分細(xì)胞膨脹;12 h后,細(xì)胞膨脹明顯,細(xì)胞膜表面粗糙;處理24 h后,細(xì)胞膜粗糙,細(xì)胞腫脹破裂,并可見(jiàn)凋亡小體(圖3e);48 h后,細(xì)胞內(nèi)容物溢出,凋亡小體數(shù)量明顯增多,大部分細(xì)胞不能維持貼壁(細(xì)胞培養(yǎng)瓶底)生長(zhǎng)。綜上,隨著藥劑處理時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯,細(xì)胞活力下降,東革內(nèi)酯對(duì)SL-221細(xì)胞增殖的抑制活性呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性。

圖3 4 μg/mL東革內(nèi)酯處理后SL-221細(xì)胞形態(tài)圖

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)東革內(nèi)酯對(duì)SL-221細(xì)胞周期的影響

經(jīng)1 μg/mL東革內(nèi)酯處理0、3、6、12、24 h和48 h的SL-221細(xì)胞中處于不同周期的細(xì)胞百分率的分布情況見(jiàn)圖4 a,其統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖4 b。從結(jié)果可以看出,與0 h(對(duì)照)相比,12、24 h和48 h的G0/G1期細(xì)胞百分率均顯著下降P<0.05),而G2/M期細(xì)胞百分率均顯著上升(P<0.05)。其中,處理48 h的G0/G1期細(xì)胞所占百分率從(35.80±3.58)%下降至(20.67±2.10)%,S期細(xì)胞所占百分率由(33.47±8.34)%下降至(16.90±3.03)%,而G2/M期細(xì)胞所占百分率從(30.47±5.43)%增加至(62.67±0.67)%。由此可見(jiàn),東革內(nèi)酯可將SL-221細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。

圖4 東革內(nèi)酯對(duì)SL-221細(xì)胞周期的影響

2.4 JC-1熒光標(biāo)記法檢測(cè)東革內(nèi)酯對(duì)SL-221細(xì)胞線粒體膜電位的影響

經(jīng)1 μg/mL東革內(nèi)酯處理不同時(shí)間的SL-221細(xì)胞線粒體膜電位的分布情況見(jiàn)圖5a。在線粒體膜電位較高時(shí),JC-1聚集形成聚合物,可以產(chǎn)生紅色熒光;在線粒體膜電位較低時(shí),JC-1為單體,可以產(chǎn)生綠色熒光。SL-221細(xì)胞線粒體膜電位變化情況的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖5 b,隨著處理時(shí)間的增加,SL-221細(xì)胞線粒體紅/綠熒光比例顯著下降(P<0.05)。0 h(對(duì)照)SL-221細(xì)胞線粒體紅/綠熒光比例為11.55,處理3、6、12、24 h和48 h時(shí),SL-221細(xì)胞線粒體紅/綠熒光比例分別為3.51、1.40、0.33、0.29和0.19,與0 h(對(duì)照)相比下降了69.61%、87.88%、97.14%、97.49%和98.35%。可見(jiàn),東革內(nèi)酯可顯著降低SL-221細(xì)胞的線粒體膜電位,且呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性。

圖5 東革內(nèi)酯對(duì)SL-221細(xì)胞線粒體膜電位的影響

2.5 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染檢測(cè)東革內(nèi)酯對(duì)SL-221細(xì)胞凋亡的影響

Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染檢測(cè)1 μg/mL東革內(nèi)酯處理不同時(shí)間下,不同類(lèi)型的SL-221細(xì)胞的分布情況見(jiàn)圖6 a。其中Q1象限為壞死細(xì)胞,Q2和Q3象限分別為晚期凋亡細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞,Q4為正常細(xì)胞。Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖6 b。結(jié)果顯示,東革內(nèi)酯處理不同時(shí)間下,SL-221正常細(xì)胞百分率與0 h(對(duì)照)相比顯著下降(P<0.05),而早期凋亡細(xì)胞百分率顯著上升(P<0.05)。其中,處理48 h與0 h相比,SL-221正常細(xì)胞百分率由75.47%降低至32.80%,早期凋亡細(xì)胞百分率由8.42%增加到32.03%,晚期凋亡細(xì)胞百分率由11.43%增加到33.13%。由此可見(jiàn),東革內(nèi)酯可誘導(dǎo)SL-221細(xì)胞凋亡,且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)凋亡加劇。

圖6 東革內(nèi)酯對(duì)SL-221細(xì)胞凋亡的影響

2.6 RT-qPCR法檢測(cè)東革內(nèi)酯對(duì)SL-221細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)情況的影響

1、2、4 μg/mL東革內(nèi)酯處理SL-221細(xì)胞后,SL-p53、SL-CytochromeC和SL-InR基因表達(dá)均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)(圖7),處理48 h,SL-p53基因表達(dá)與對(duì)照相比分別上調(diào)17.53、67.92倍和90.10倍;SL-CytochromeC基因表達(dá)與對(duì)照相比分別上調(diào)38.03、65.15倍和74.15倍;SL-InR基因表達(dá)與對(duì)照相比分別上調(diào)2.34、4.19倍和4.34倍。SL-Bcl-2、SL-mTOR和SL-PI3K基因的表達(dá)量隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。其中,1、2、4 μg/mL東革內(nèi)酯分別處理48 h后,與對(duì)照相比,SL-Bcl-2基因表達(dá)分別下調(diào)94.76%、96.49%和96.94%;SL-mTOR基因表達(dá)與對(duì)照相比分別下調(diào)96.10%、97.30%和98.14%;SL-PI3K基因表達(dá)與對(duì)照相比分別下調(diào)86.55%、87.01%和93.05%。

圖7 東革內(nèi)酯對(duì)SL-221細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)情況的影響

綜上,1、2、4 μg/mL東革內(nèi)酯可誘導(dǎo)凋亡標(biāo)志基因SL-p53、SL-InR和SL-CytochromeC顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05),同時(shí)抑制凋亡抑制因子SL-Bcl-2的表達(dá)。細(xì)胞凋亡信號(hào)通路上游的SL-mTOR和SL-PI3K基因表達(dá)均受到顯著抑制(P<0.05)。表明東革內(nèi)酯可通過(guò)InR-PI3K-mTOR-Bcl-2信號(hào)通路誘導(dǎo)SL-221細(xì)胞凋亡。

3 結(jié)論與討論

斜紋夜蛾屬于重大農(nóng)業(yè)害蟲(chóng),目前主要依靠化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防控,但監(jiān)測(cè)表明其已對(duì)多種化學(xué)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生了抗性[20-21]。因此,尋找高效低毒的藥物及靶點(diǎn)是農(nóng)藥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。從天然產(chǎn)物中挖掘新活性物質(zhì),研發(fā)替代防治產(chǎn)品至關(guān)重要。本文比較了印楝素與東革內(nèi)酯對(duì)SL-221細(xì)胞增殖的抑制作用,發(fā)現(xiàn)東革內(nèi)酯能以更小的劑量(IC50為1.98 μg/mL)抑制SL-221細(xì)胞增殖,隨著東革內(nèi)酯濃度增高,SL-221細(xì)胞數(shù)目減少,細(xì)胞膨脹、核固縮(細(xì)胞核染色質(zhì)DNA濃聚、皺縮,使核體積減小)破碎,細(xì)胞碎片增多,提示其可能具有開(kāi)發(fā)為防控斜紋夜蛾的藥物的潛力。東革內(nèi)酯能否通過(guò)誘導(dǎo)凋亡來(lái)抑制SL-221細(xì)胞增殖,目前仍不清楚。我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn),東革內(nèi)酯能使SL-221的細(xì)胞周期停滯于G2/M期,降低線粒體膜電位,且能顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡(apoptosis)是一種特殊的細(xì)胞死亡方式,又被稱(chēng)為程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death, PCD),指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,由基因控制的細(xì)胞自主有序的主動(dòng)死亡過(guò)程[22]。在形態(tài)方面,細(xì)胞凋亡表現(xiàn)為:細(xì)胞質(zhì)濃縮、染色質(zhì)聚集、核酸內(nèi)切酶活化和出現(xiàn)凋亡小體等特征。發(fā)生過(guò)程包括:凋亡的起始、凋亡小體形成和凋亡小體被鄰近細(xì)胞吞噬并消化[23]。通常情況下,細(xì)胞凋亡是機(jī)體為了維持各器官的穩(wěn)定性而進(jìn)行的一種自我調(diào)控,但當(dāng)細(xì)胞凋亡調(diào)控失衡時(shí),可引起細(xì)胞過(guò)度增殖或過(guò)度凋亡,導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生[24]。細(xì)胞凋亡主要有內(nèi)源性和外源性兩種途徑。內(nèi)源性途徑主要包括細(xì)胞應(yīng)激、DNA損傷、發(fā)育信號(hào)、存活因子缺失等[25]。這個(gè)途徑是由Bcl-2家族介導(dǎo),該家族存在兩種類(lèi)型的蛋白,促凋亡蛋白(Bax、Bad等)和抑凋亡蛋白(Bcl-2)[26]。在內(nèi)源性途徑中,CytochromeC的表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡起著關(guān)鍵作用[27]。CytochromeC從線粒體釋放到胞質(zhì)中,形成凋亡復(fù)合體,進(jìn)而激活核酸內(nèi)切酶切割DNA,促使細(xì)胞凋亡[28]。p53是一種腫瘤抑制因子,它可以對(duì)細(xì)胞應(yīng)激或DNA損傷作出響應(yīng),被激活后的p53可誘導(dǎo)細(xì)胞的周期停滯、凋亡和衰老[29-30]。當(dāng)?shù)鞍妆磉_(dá)異常時(shí)可能促使細(xì)胞進(jìn)入不可逆的凋亡階段。我們發(fā)現(xiàn)東革內(nèi)酯可抑制凋亡因子SL-Bcl-2的表達(dá),促進(jìn)SL-p53、SL-InR和SL-CytochromeC基因的表達(dá)。InR-PI3K/mTOR是一條經(jīng)典的胞內(nèi)信號(hào)通路,主要調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、自噬和凋亡等,其異?；罨虮灰种凭鶗?huì)誘導(dǎo)下游信號(hào)途徑的紊亂。PI3K是該信號(hào)通路的重要組成因子,可在多種生長(zhǎng)因子的刺激下被激活,參與細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié),降低細(xì)胞自噬力[31-32]。mTOR位于PI3K/mTOR信號(hào)通路的下游,屬于磷酸肌醇激酶家族成員,PI3K激活后,其下游的mTOR也被激活,mTOR激活可抑制細(xì)胞自噬[33]。本研究表明SL-mTOR和SL-PI3K基因表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.05),進(jìn)一步證實(shí)了東革內(nèi)酯可誘導(dǎo)SL-221細(xì)胞凋亡,這與印楝素可誘導(dǎo)SL-1細(xì)胞凋亡的結(jié)果一致[34]。

近年來(lái)研究表明,活性成分可通過(guò)上調(diào)InR,負(fù)反饋抑制PI3K/Akt通路來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[35]。本試驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)東革內(nèi)酯可顯著上調(diào)InR基因的表達(dá),同時(shí)抑制PI3K和mTOR基因的表達(dá),因此,我們推測(cè)東革內(nèi)酯誘導(dǎo)SL-221細(xì)胞發(fā)生的凋亡可能與抑制PI3K和mTOR的磷酸化、抑制Bcl-2的表達(dá),促使細(xì)胞凋亡有關(guān)。

綜上所述,東革內(nèi)酯可通過(guò)InR-PI3K-mTOR-Bcl-2信號(hào)通路誘導(dǎo)SL-221細(xì)胞發(fā)生凋亡,后續(xù)將進(jìn)一步研究東革內(nèi)酯是否還通過(guò)誘導(dǎo)其他死亡方式發(fā)揮抑制昆蟲(chóng)細(xì)胞增殖及其具體機(jī)制,為東革內(nèi)酯的開(kāi)發(fā)和利用提供新的依據(jù)和思路。