徐青霞,潘玉英,2*,楊婷婷,楊金生,張 萌,陳 帆,王瀅贏,唐忠偉
縊蟶對潮間帶原油污染的氧化應激及IBR評價
徐青霞1,潘玉英1,2*,楊婷婷1,楊金生3,張 萌1,陳 帆1,王瀅贏1,唐忠偉1
(1.浙江海洋大學,水產(chǎn)學院,浙江 舟山 316022;2.浙江省海洋漁業(yè)裝備技術研究重點實驗室,浙江 舟山 316022;3.浙江海洋大學,石油化工與環(huán)境學院,浙江 舟山 316022)
通過研究不同濃度原油污染對縊蟶()鰓和內臟團抗氧化酶活性、脂質過氧化及鰓結構的影響,結合綜合生物標志物響應(IBR),探討潮間帶原油污染對生物的毒性效應.結果顯示:在劑量-效應方面,2種組織超氧化物歧化酶(SOD)活性和內臟團中谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)總體上表現(xiàn)為低濃度誘導、高濃度抑制效應;SOD誘導與過氧化氫酶(CAT)抑制同時出現(xiàn),規(guī)律大致相反.在時間-效應上,SOD活性呈升高-降低-升高的趨勢, CAT與GPx呈先降低后升高的趨勢;谷胱甘肽硫轉移酶(GST)在鰓中呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,酶活性最高為371.663U/mgprot.暴露前期(6h)縊蟶2種組織中丙二醛(MDA)含量顯著增加,鰓和內臟團中MDA含量最高值分別為5.030和10.705nmol/mgprot,后期逐漸平穩(wěn).IBR結果表明鰓中生物標志物對原油污染敏感度更高.原油暴露會使鰓絲結構發(fā)生變形或引起鰓絲脫離等現(xiàn)象.研究表明,縊蟶鰓更適宜作為潮間帶原油暴露生物監(jiān)測與評價的器官.
原油;縊蟶;抗氧化酶;IBR;組織損傷
原油污染現(xiàn)已成為最為嚴重的海洋污染之一[1].石油類污染物進入海洋生態(tài)系統(tǒng),很容易被周圍水域的水生動物通過體表、鰓或飲食吸收,并在機體器官和組織內富集,對水生生物產(chǎn)生危害,產(chǎn)生急性和長期毒性作用[2-3].如雙齒圍沙蠶()會因海水中的原油產(chǎn)生彈跳、扭動等應激反應,隨著暴露時間的延長,則會出現(xiàn)死亡等毒性效應[4].當石油類污染物進入生物體內,會通過自身反應產(chǎn)生大量活性氧自由基(ROS),如H2O2、O- 2?.過量ROS將對生物體造成酶失活、脂質過氧化、DNA鏈斷裂等氧化損傷[5-6].為應對過量ROS對機體的損傷,生物體會利用抗氧化酶系統(tǒng)清除ROS,防止氧化損傷[7].丙二醛(MDA)是脂質過氧化產(chǎn)物中的一類,它可與DNA、膜蛋白和酶等發(fā)生交聯(lián)反應,因此MDA含量也可以作為生物標志物判斷生物受污染的程度[8].
生物體在受到污染脅迫時,體內酶活性既有誘導又有抑制,且存在響應時間偏差的情況,因此單一的生物標志物不能全面反映生物受石油污染后的毒害情況[9].綜合生物標志物響應 (IBR) 指標能夠將不同的生物標志物綜合起來進行定量分析.已有研究表明利用IBR能有效評價污染物對生物的毒性效應,根據(jù)其IBR 大小可知組織中氧化應激的能力水平[1].組織切片是一種組織損傷研究技術,能夠直接觀察生物組織結構受環(huán)境影響的情況,在生態(tài)毒理學研究中應用甚廣[10].目前國內外一些研究表明海洋生物受到重金屬、石油或其他有機物污染,會造成嚴重的組織損傷,出現(xiàn)了細胞壞死、空泡化等現(xiàn)象[11].目前,有關原油暴露對生物抗氧化酶影響和富集效應方面的研究較多,然而組織損傷的相關研究較少.
原油附著在細粒懸浮沉積物上或與潮灘沉積物直接接觸后仍能持續(xù)存在,受污染沉積物發(fā)生再懸浮事件后亦可產(chǎn)生毒性,加大了對底棲動物毒害的風險[12-13].目前,海洋環(huán)境污染監(jiān)測研究主要集中在海水中原油及其原油組分對海洋生物的影響,對生物體內生物標志物的變化方面也有研究,但關于潮間帶生態(tài)系統(tǒng)原油污染對底棲生物的毒性效應研究較為少見[14].縊蟶()是一種廣溫廣鹽性潮間帶貝類,常穴居于潮間帶軟泥內,具有極高的經(jīng)濟價值[15].其移動能力較弱,為濾食性生物,無固著的生活方式及對有機污染物的低酶降解率使它們能夠積累高水平的有機分子[16].有研究表明,雙殼類生物相較于魚類,對石油烴、重金屬等污染物具有較強的富集能力和耐受力[17-18],因此可作為本研究理想的實驗貝類.
本文通過研究原油暴露對縊蟶鰓和內臟團組織抗氧化酶(SOD、CAT、GPx、GST)活性和脂質過氧化(MDA)的影響,同時運用IBR定量分析原油暴露對縊蟶可能的毒性效應,利用組織切片技術探究原油暴露對縊蟶鰓組織損傷的影響,為原油污染潮間帶環(huán)境評價與保護提供基礎數(shù)據(jù).
表1 實驗原油組分及其含量
縊蟶()購自浙江舟山,選取平均體長(5.34±0.33) cm、平均體重(9.19±1.80) g的健康個體.沉積物取自浙江舟山長峙島潮間帶,經(jīng)風干后過篩,選取孔徑小于0.5mm的粉砂備用.經(jīng)測定,實驗所用沉積物中石油含量背景值為29.73mg/ kg,遠小于《海洋沉積物質量》(GB 18668-2002)中第一類海域的石油類含量標準,符合實驗所需要求[19].
主要儀器:紫外可見分光光度計(上海美譜達UV-1100B),恒溫水浴箱(上海一恒HWS-24),漩渦混勻器(常州越新XH-C),移液槍(Eppendorf),電子天平(上?;ǔ盪TP-313),石蠟切片機(德國徠卡BIOCUT),組織攤烤片機(上海卓的ZD-1145),Nikon顯微鏡(日本奧林巴斯).
主要試劑:正己烷、無水乙醇、冰醋酸均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司;用于測定抗氧化酶活性和MDA含量的試劑盒均購自南京建成生物工程研究所.
實驗于體積為50L的聚乙烯養(yǎng)殖箱中進行,以海水:沉積物=8:7.5的質量比模擬潮間帶淤泥質環(huán)境,總模擬環(huán)境占箱體1/3.按照《海洋沉積物質量》(GB 18668-2002)將原油污染濃度設為0,500,1000, 1500,10000和15000mg/kg,每個濃度設置3個平行[19].在處理過程中,按不同質量比先將原油與沉積物在箱體內充分混勻,再加入鹽度為24的天然海水,海水與含油沉積物混勻后靜置,水溫控制在20℃左右.
實驗開始時,在每個養(yǎng)殖箱中放入11只縊蟶成體,觀察其生存狀況并及時清除死貝(雙殼緊閉且觸碰無反應),實驗期間不喂食.在96h急性原油暴露過程中,各組均無縊蟶死亡記錄.在取樣前記錄縊蟶殼長、殼寬、殼高以及濕重(包括殼).分別于第3,6,12,24,48,96h時在每個養(yǎng)殖箱中隨機取1只縊蟶,并立即解剖出鰓和內臟團,用0.86%生理鹽水沖洗,吸干組織表面水分后用液氮速凍并放入-80℃冰箱保存至進一步分析.于實驗第48h時從每個養(yǎng)殖箱中隨機取縊蟶1只用于組織病理學觀察.實驗結束后,以隨機均勻的取樣原則,在每個養(yǎng)殖箱中各取3份上覆水和沉積物,用于測定暴露體系中上覆水和沉積物實際原油濃度.
組織樣品按其質量加入4倍生理鹽水,于冰浴條件下制備20%的組織勻漿,隨后將組織勻漿進行離心(2500r/min,4℃,10min),取上清液用于蛋白含量及其他酶活性測定.酶活性測定過程采用南京建成試劑盒說明書進行,蛋白含量采用考馬斯亮藍法; SOD采用羥胺法;CAT采用鉬酸銨法;GPx和GST采用分光光度法;MDA采用硫代巴比妥酸法.
解剖出的鰓組織立即用Bouin氏液固定,經(jīng)酒精梯度脫水、二甲苯與石蠟浸蠟、石蠟包埋后,使用切片機切片,切片厚度5 μm,經(jīng)烤片后用蘇木精-伊紅(H.E)染色,封片后使用Nikon顯微鏡觀察細胞結構.
依據(jù)《海洋監(jiān)測規(guī)范》(GB 17378-2007)[20]的第4部分海水分析和第5部分沉積物分析,采用紫外分光光度法測定各濃度組中上覆水和沉積物含油量.
用SPSS 25.0對所得數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗后,以單因素(ANOVA)方差分析或非參數(shù)檢驗(Kruskal-Wallis檢驗)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和組間差異顯著性分析.其中<0.05表示組間差異顯著,<0.01表示差異極顯著,<0.001表示差異極其顯著,并使用Origin 2018進行繪圖.
依據(jù)Beliaeff等[21]于2002年首次提出的理論,并參照Marigómez等[22]和Pan等[23]的修正方法計算IBR.
首先計算各生物標志物在不同取樣時間下測定結果的平均值()和所有時間點的總平均值()及標準差(),對標準化得到.
然后取標準化后各時間點的最小值(min)與相加得到得分B.
使用星狀圖來顯示各生物標志物的處理結果,B在星狀圖中表示為各生物標志物下輻射線的長度.IBR通過星狀圖的面積計算,即為相鄰生物標志物的輻射線圍成的三角形面積之和.
如表2,結果所示,除1000mg/kg濃度組外,其他各組沉積物油濃度實測值與理論配制值相比偏低,可能是由于實驗過程沉積物中部分原油受生物體活動影響會釋放至上覆水中,從而造成上覆水油濃度實測值升高及沉積物油濃度實測值偏低.而1000mg/kg濃度組沉積物油濃度實測值較理論配制值略有升高,可能是由于該濃度組生物擾動對沉積物原油釋放影響較小,且沉積物存在含油量本底值.綜上所述,各組上覆水和沉積物油濃度實測值均與暴露濃度成正比,與實驗設計理論值規(guī)律相同,符合實驗設計要求.
表2 各濃度組上覆水和沉積物原油含量理論值和實測值
以SOD、CAT、GPx、GST酶活性來反映縊蟶體內抗氧化酶活性的變化情況,活性高于對照組表示被誘導,低于對照組則表示活性受到抑制.
2.2.1 鰓 如圖1(a)所示,在12和96h時各濃度組SOD活性均高于對照組,表明在實驗期間SOD活性被誘導,其中12h的500,1000,1500和15000mg/kg濃度組被顯著誘導(<0.05).暴露6和24h,除10000mg/kg濃度組外,各濃度組SOD活性均受到抑制.各濃度組SOD活性隨濃度變化規(guī)律不明顯,無顯著濃度效應關系,但總體上呈現(xiàn)低濃度(<1000mg/kg)誘導、高濃度抑制.10000mg/kg濃度組在暴露期間SOD活性均高于對照組,表明在實驗期間SOD活性被誘導,于6h酶活性達到峰值122.136U/mgprot. SOD酶活性最大誘導值出現(xiàn)在48h 的1500mg/kg濃度組,此時酶活性被顯著誘導為131.767U/mgprot(<0.05).
如圖1(b)所示,隨時間的增加,500mg/kg濃度組CAT活性呈降低的趨勢,1000,10000和15000mg/kg濃度組CAT活性先降低后升高,1500mg/kg濃度組呈現(xiàn)升高-降低-升高的變化情況.相較于對照組,各濃度組隨時間變化規(guī)律差異較大,隨時間的增加500mg/kg濃度組從6h后受到誘導,CAT活性高于對照組,但在暴露48h后受到抑制低于對照組,其CAT活性最大抑制值為1.059U/mgprot.1000mg/kg濃度組從6h后受到誘導,CAT活性高于對照組.1500mg/ kg濃度組除暴露12和96h外,均受到抑制低于對照組.10000和15000mg/kg濃度組隨時間變化情況相同,除12和48h CAT活性低于對照組外,均高于對照組.相較于對照組,CAT活性隨濃度的增加變化規(guī)律不顯著,暴露96h,除500mg/kg濃度組受到抑制外,其他濃度組均受到誘導,其中1500和15000mg/kg濃度組顯著高于對照組(<0.05).
如圖1(c)所示,暴露前期3~6h內,除6h的500和15000mg/kg濃度組外,其他濃度組GPx活性均高于對照組,表明原油暴露前期GPx活性受到誘導.暴露3h,500,1500和15000mg/kg濃度組GPx活性顯著高于對照組(<0.05)并達到峰值,GPx活性分別為178.827,169.752和167.589U/mgprot.暴露12h,除500和1500mg/kg濃度組外,其余濃度組GPx活性開始受到抑制.暴露24h,各濃度組GPx活性均極顯著低于對照組(<0.01).暴露48h,各濃度組GPx活性開始升高,至96h時,除500和15000mg/kg濃度組外,各濃度組活性高于對照組.
如圖1(d)所示,各濃度組GST活性隨時間的變化總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢.暴露3h,所有濃度組GST活性均低于對照組,表明暴露前期GST活性被抑制.暴露6h,各濃度組GST活性開始升高,其中500和1000mg/kg濃度組GST活性受到誘導高于對照組,其余濃度組GST活性仍受到抑制.暴露12~48h,各濃度組GST活性均受到誘導高于對照組,其中48h的500,1500和10000mg/kg濃度組GST活性達到各濃度組峰值,分別為371.663,359.265和356.293U/mgprot,與對照組差異極其顯著(<0.001).暴露后期96h,各濃度組GST活性受到抑制均低于對照組,其中500,1000及1500mg/kg濃度組極顯著低于對照組(<0.01),達到各濃度組最小值,分別為124.854,101.17和140.135U/mgprot.
圖1 原油對縊蟶鰓SOD、CAT、GPx和GST活性的影響
*表示與對照組相比差異顯著<0.05,**表示與對照組相比差異極顯著<0.01,***表示與對照組相比差異極其顯著<0.001
2.2.2 內臟團 如圖2(a)所示,除500和1000mg/kg濃度組外,各濃度組內臟團SOD活性隨時間的變化呈降低-升高-降低的趨勢,內臟團SOD活性明顯低于鰓.內臟團SOD活性隨濃度變化波動較大.暴露3h,除1000mg/kg濃度組外,各濃度組SOD活性均高于對照組,表明此時內臟團SOD活性受到誘導.暴露6h,10000mg/kg濃度組SOD活性低于對照組,表明受到抑制,其他濃度組SOD活性受到誘導均高于對照組,500和1000mg/kg 濃度組SOD活性于6h達到峰值,其活性分別為37.736和34.54U/mgprot.暴露12h, 500,1000和1500mg/kg濃度組SOD活性明顯下降,10000和15000mg/kg濃度組SOD活性略有上升.暴露24h,除1000mg/kg濃度組外,其他濃度組SOD活性均有上升但仍低于對照組,1500和10000mg/kg濃度組SOD活性極顯著低于對照組(<0.01).暴露48h,各濃度組SOD活性開始上升并高于對照組, SOD酶活性最大誘導值出現(xiàn)在48h的1500mg/kg濃度組,此時酶活性被極顯著誘導為38.603U/mgprot (<0.01),與鰓中情況相同.至暴露96h,各濃度組SOD活性雖有降低但仍高于對照組.
如圖2(b)所示,暴露期間各濃度組主要呈現(xiàn)抑制效應.暴露3h,各濃度組CAT活性均低于對照組,其中1500和15000mg/kg濃度組CAT活性極其顯著低于對照組(<0.001),其活性分別為10.855和8.275U/ mgprot.暴露6h,除1500mg/kg濃度組外,各濃度組CAT活性均高于對照組.暴露12h,各濃度組CAT活性總體上雖有升高,但1500和10000mg/kg濃度組CAT活性低于對照組.暴露24h,各濃度組CAT活性持續(xù)升高,但CAT活性均低于對照組,表明CAT活性受到抑制.暴露48~96h,除48h的15000mg/kg和96h的1000mg/kg濃度組外,其他各濃度組CAT濃度仍受到抑制低于對照組. 15000mg/kg濃度組CAT活性隨暴露時間的增加而升高.
如圖2(c)所示,各濃度組GPx活性隨時間的增加總體上呈現(xiàn)先降低再升高的趨勢,與鰓中GPx活性變化趨勢相似.暴露3h,除1500mg/kg濃度組外,各濃度組GPx活性受到抑制低于對照組.暴露6h,除10000mg/kg濃度組外,各濃度組GPx活性受到誘導高于對照組,其中500mg/kg濃度組GPx活性極其顯著高于對照組(<0.001),1000mg/kg濃度組顯著高于對照組(<0.05).暴露12h,各濃度組GPx活性降低,1000和1500mg/kg濃度組GPx活性低于對照組.暴露24h,各濃度組內臟團GPx活性升高但均低于對照組.暴露48h,GPx活性持續(xù)升高并高于對照組,各濃度組GPx活性均極顯著高于對照組,除500mg/kg濃度組外,其余濃度組達到各組峰值,活性峰值范圍為201.392~240.490U/mgprot.暴露96h,除500mg/kg濃度組GPx活性升高,各濃度組GPx活性均有降低.
如圖2(d)所示,暴露3h,各濃度組GST活性受到抑制低于對照組.暴露6~12h,內臟團中GST活性受到誘導,開始高于對照組活性.暴露24~48h,除15000mg/kg濃度組GST活性高于對照組外,其余各濃度組GST活性均低于對照組.暴露96h,各濃度組GST活性均高于對照組.相較于對照組,GST活性隨濃度的增加變化規(guī)律不顯著.500,1000和10000mg/ kg濃度組隨時間的變化情況相似,呈升高-降低-升高的趨勢.1500mg/kg濃度組在暴露前期受到抑制低于對照組,于96h受到誘導高于對照組.15000mg/kg濃度組在暴露前期受到抑制低于對照組,于12h受到誘導高于對照組.
圖2 原油對縊蟶內臟團SOD、CAT、GPx和GST活性的影響
*表示與對照組相比差異顯著<0.05,**表示與對照組相比差異極顯著<0.01,***表示與對照組相比差異極其顯著<0.001
如圖3(a)所示,鰓中MDA含量隨時間變化總體呈現(xiàn)升高-降低-升高的趨勢,但各濃度組隨時間變化規(guī)律各有不同.暴露6h,各濃度組MDA含量相較于3h略有升高,表明鰓中為應對原油暴露存在脂質過氧化情況,1500mg/kg濃度組MDA含量達到峰值為5.030nmol/mgprot.暴露12h,各濃度組MDA含量與6h相比有所降低.暴露24h,除15000mg/kg濃度組MDA含量略低于對照組外,其余濃度組MDA含量均高于對照組,MDA含量隨濃度的增大而降低,其中500mg/kg濃度組極其顯著高于對照組(<0.001), 1000mg/kg濃度組極顯著高于對照組(<0.01), 1500mg/kg濃度組顯著高于對照組(<0.05).暴露48~96h,MDA含量降低并逐漸低于對照組,MDA含量最低是48h的500mg/kg濃度組,含量為1.294nmol/mgprot.
*表示與對照組相比差異顯著<0.05,**表示與對照組相比差異極顯著<0.01,***表示與對照組相比差異極其顯著<0.001
如圖3(b)所示,各濃度組MDA含量隨時間的變化規(guī)律不顯著.暴露3h,除1500mg/kg濃度組MDA含量低于對照組外,其余濃度組MDA含量均高于對照組,其中500mg/kg濃度組極其顯著高于對照組(<0.001).暴露6h,除15000mg/kg濃度組MDA含量低于對照組外,其余濃度組MDA含量均高于對照組,其中500和1000mg/kg濃度組均極其顯著高于對照組(<0.001),500mg/kg濃度組MDA含量達到峰值為10.705nmol/mgprot.暴露12h,MDA含量與暴露濃度呈現(xiàn)低濃度(<1000mg/kg)誘導、高濃度抑制的效應關系.暴露24h,除15000mg/kg濃度組MDA含量高于對照組外,其余濃度組MDA含量均低于對照組.暴露48h,各濃度組MDA含量升高,至暴露96h又降低.500mg/kg濃度組在暴露3~12h內MDA含量高于對照組,暴露24~96h內MDA含量低于對照組.1000mg/kg濃度組除暴露24h,其余暴露期MDA含量均高于對照組.1500mg/kg濃度組除暴露6和48h,其余暴露期均低于對照組.10000mg/kg濃度組在暴露期間MDA含量變化不大.15000mg/kg濃度組于48h達到該濃度峰值,極其顯著高于對照組(<0.001),于96h達到最小值為4.191nmol/mgprot (<0.01).
本文共選取SOD、CAT、GPx、GST和MDA 5種生物標志物,利用IBR進行綜合分析,以不同時間段為范圍,繪制IBR星狀圖.不同濃度原油暴露96h對縊蟶鰓和內臟團的星狀圖如圖4~5所示,IBR隨時間的變化如圖6所示.
2.4.1 鰓 由圖4可知,除暴露12h外各時間點下,各濃度組鰓中不同生物標志物Bi值分布情況相似.暴露3h,SOD、CAT和GPx的Bi值較高,表明暴露前期SOD、CAT和GPx酶活性響應較快.暴露6h, CAT的Bi值略有下降,MDA的Bi值升高.暴露12~ 24h,GST的Bi值升高,表明GST酶開始發(fā)揮作用導致活性升高.暴露48h,SOD的Bi值升高,但MDA的Bi值降低.暴露96h,SOD和GST的Bi值降低,而MDA的Bi值升高.
由圖6(a)可知,各濃度組鰓中IBR值隨暴露時間的增加主要呈現(xiàn)升高-降低-升高的趨勢,暴露前期IBR值明顯大于暴露后期.暴露3~24h,除3h的1500mg/kg、6和24h的15000mg/kg濃度組外,其余濃度組IBR值均高于對照組.暴露48~96h,除48h的1000和1500mg/kg及96h的10000mg/kg濃度組外,各濃度組IBR值均低于對照組.原油暴露濃度為500mg/kg時,各時間點IBR累積值最大,為58.084.總體來看,低濃度組(£1500mg/kg)IBR值存在高于高濃度組(310000mg/kg)現(xiàn)象.
2.4.2 內臟團 由圖5可知,相同時間點下,各濃度組中內臟團不同生物標志物的Bi值分布情況相似.暴露3h,SOD、CAT和GST的Bi值較高.暴露6~12h,除6h的500和1000mg/kg濃度組外,其余濃度組SOD和CAT的Bi值下降.暴露24h,SOD、CAT和GPx的Bi值升高.暴露48h,SOD和MDA的Bi值升高,但CAT的Bi值降低.暴露96h,SOD和MDA的Bi值降低,但GST和CAT的Bi值升高.
由圖6(b)可知,暴露3~12h,6h的500和1000mg/kg濃度組IBR值明顯高于對照組,3h的500和10000mg/kg、6h的1500mg/kg以及12h的500和1000mg/kg濃度組IBR稍高于對照組,其余濃度組IBR值均低于對照組,呈現(xiàn)低濃度組IBR值高于高濃度現(xiàn)象,與鰓中情況相似.暴露24h,各濃度組IBR值均低于對照組.暴露48~96h,除500mg/ kg濃度組外,各濃度組IBR值均高于對照組.除500和1000mg/kg外,其他濃度組暴露前期IBR值小于暴露后期.暴露濃度為500mg/kg時,各時間點IBR累積值達到峰值為61.925,與鰓中情況類似.
圖6 不同濃度原油暴露下鰓和內臟團組織IBR隨時間的變化
縊蟶的鰓組織由位于外套膜兩側的鰓瓣組成,鰓瓣均由與身體縱軸相垂直的鰓絲組成,鰓絲中主要包含扁平細胞、柱狀細胞以及少量粘液細胞等[24-25].不同濃度原油暴露48h對縊蟶鰓組織的影響如圖7所示,對照組(圖7a)鰓絲結構完整,纖毛無損傷,鰓絲與鰓絲之間排列緊密.原油暴露48h后,各濃度組出現(xiàn)鰓絲與軟組織脫離的現(xiàn)象(圖7b-f),伴隨暴露濃度的增大該現(xiàn)象愈加明顯.500mg/kg濃度組對縊蟶鰓組織影響較小,雖有輕微鰓絲脫離現(xiàn)象,但無明顯結構變化(圖7b).在1000 和10000mg/kg濃度組中,縊蟶鰓內腔出現(xiàn)明顯變小、變窄,鰓絲變形嚴重(圖7c、e).在1000和1500mg/kg濃度組中,鰓纖毛出現(xiàn)脫落現(xiàn)象(圖7c、d).在15000mg/kg濃度組中,出現(xiàn)色素細胞大量增多的現(xiàn)象(圖7f).
圖7 不同濃度原油暴露48h對縊蟶鰓顯微結構的影響
a:對照組(400×); b:500mg/kg暴露組(400×); c:1000mg/kg暴露組(400×); d:1500mg/kg暴露組(400×); e:10000mg/kg暴露組(400×); f:15000mg/kg
暴露組(400×)(BJ:鰓絲; BJS:鰓絲與軟組織脫離; BM:基膜; Ci:纖毛; PC:色素細胞; WT:水管腔)
原油是一種具有“致癌、致畸、致突變”效應的化學混合物[26],原油泄漏發(fā)生時,會對周圍生物及環(huán)境產(chǎn)生危害[27].抗氧化酶在細胞穩(wěn)態(tài)和生理過程中發(fā)揮重要作用,當生物受到原油脅迫時,生物體會產(chǎn)生大量ROS并對機體造成損傷,抗氧化酶系統(tǒng)通過誘導或抑制效應來發(fā)揮作用,以清除過量自由基[28-29].
SOD、CAT和GPx具有協(xié)同作用[30].SOD是唯一能使自由基O- 2?發(fā)生歧化反應生成O2或H2O2的抗氧化酶,H2O2可被CAT和GPx降解生成H2O和氧氣O2,從而起到保護機體的作用[10,31-32].SOD和CAT是最早參與自由基清除的酶,SOD活性誘導通常和CAT活性抑制現(xiàn)象一起出現(xiàn)[3,33].本研究中,鰓中SOD活性在暴露初期受到誘導,增強了機體內清除自由基的能力,導致H2O2急劇增加.過量H2O2會抑制CAT活性,使其活性降低.暴露6h時SOD活性開始降低,受到抑制,CAT活性降低但高于對照組;暴露48h,SOD活性開始升高并高于對照組,此時CAT活性受到顯著抑制;當暴露時間過長時,機體會因細胞損傷出現(xiàn)SOD活性降低,CAT活性升高的現(xiàn)象.GPx與CAT具有相似的作用能促進H2O2的分解,因此鰓中GPx與CAT變化規(guī)律相似[34].內臟團中GPx活性在暴露初期主要受到抑制,在暴露后期受到顯著誘導,隨濃度總體呈現(xiàn)低濃度誘導、高濃度抑制效應.生物體內抗氧化酶活性被顯著誘導或時而被顯著抑制,這可能是由于縊蟶受原油暴露后,機體內抗氧化酶系統(tǒng)失衡,這與張林寶等[35]柴油水溶性成分對菲律賓蛤仔的研究結果一致.
GST同樣參與自由基的清除,促進對自由基的防御機制,可催化谷胱甘肽等生物內源性的水溶性分子與Ⅰ相代謝產(chǎn)物結合,形成更為親水的物質排出體外,尤其是對于石油烴的解毒環(huán)節(jié)有重要作用[32,36-37].本研究中,鰓中GST活性在暴露3h受到抑制,6~48h內各濃度組活性高于對照組,表明其受到誘導對污染物進行解毒,96h時GST活性降低表明受到抑制.內臟團中GST活性隨時間的變化與鰓中相似,出現(xiàn)了先誘導后抑制的現(xiàn)象,但兩個組織中GST活性抑制響應時間存在偏差.任加云等[38]利用櫛孔扇貝研究發(fā)現(xiàn)石油烴脅迫下鰓絲中同樣呈現(xiàn)GST活性先誘導后抑制的情況.上述現(xiàn)象可能是由于生物體在暴露前期受到污染脅迫GST活性表現(xiàn)出誘導性,暴露后期解毒代謝過程不斷進行導致谷胱甘肽(GSH)被大量消耗,從而使GST活性下降.
縊蟶受到原油污染時所產(chǎn)生的ROS會導致機體脂質過氧化,氧化降解的過程中會產(chǎn)生脂過氧化自由基(LOO-)、MDA以及丙醛等多種自由基[10].本研究中,暴露前期(6h)各處理組鰓和內臟團中MDA含量均顯著增加,可能此時縊蟶處于氧化應激狀態(tài),細胞無法應對過量的自由基,導致細胞膜發(fā)生脂質過氧化反應,MDA水平升高;隨時間的增加,MDA含量逐漸平穩(wěn)降低或低于對照組,這可能是由于抗氧化酶清除了過氧化自由基,使MDA的積累減少[39].
不同生物標志物在生物體內存在效應不同,因此本文將SOD、CAT、GPx、GST及MDA進行綜合分析.研究表明,IBR可以作為確定污染物對海洋生物群有害影響的有效工具[40],現(xiàn)已被廣泛應用于原油、重金屬或其他污染物對生物的毒害評價[39,41].本研究中,鰓和內臟團中IBR均出現(xiàn)低濃度組高于對照組,高濃度組低于對照組現(xiàn)象,且鰓中表現(xiàn)更明顯,這與縊蟶體內SOD、GPx受原油暴露后呈現(xiàn)的低濃度誘導、高濃度抑制效應有關,IBR值所反應的結果與酶活性差異一致,與Pan等[23]研究結果相似.從時間上來看,鰓中IBR值暴露前期較高,而在內臟團中IBR值暴露后期較高.這可能是由于組織之間存在一種補償機制,以保護細胞免受促氧化條件的影響[42].鰓是最先接觸到原油的器官,因此其對原油暴露響應較高[10],隨著暴露時間的增加,內臟團中消化腺開始發(fā)揮解毒作用,酶活性開始響應并逐漸升高,以更好的保護機體.對比圖6中IBR變化趨勢,鰓對原油污染敏感性和差異性更顯著,更適合作為污染監(jiān)測的研究器官.
濾食性貝類鰓的主要功能是呼吸和運送食物,亦是整個機體中最先與污染物接觸的器官,對污染物反應敏感[43].原油中的碳氫化合物會加大鰓中呼吸上皮細胞的損傷,Agamy[44]研究表明原油會導致網(wǎng)紋石斑魚()發(fā)生水腫、上皮細胞壞死等病變.而鰓絲中異常細胞增加、纖毛腫脹、細胞壞死和其他病理形態(tài)學改變也常作為雙殼貝類受到外源性污染物損傷的標志.本研究中,低濃度原油暴露對縊蟶鰓造成了輕微結構損傷,隨著原油暴露濃度的增加,出現(xiàn)了明顯的鰓絲與軟組織脫離、鰓絲變形和纖毛脫落等病理變化.薛秀玲等[45]通過研究有機磷農(nóng)藥對縊蟶鰓的影響也發(fā)現(xiàn)了相似的結果,有機磷農(nóng)藥會導致鰓出現(xiàn)纖毛脫落、鰓絲間隔與結締組織增生等病理學變化.其他外源性污染物對雙殼貝類也存在相似的影響.陳彩芳等[46]以Pb2+對泥蚶()進行暴露實驗,結果顯示Pb2+同樣會造成泥蚶鰓絲脫離軟骨組織的現(xiàn)象,高濃度暴露還會導致鰓絲呼吸上皮細胞脫落.生物體發(fā)生水腫、鰓絲脫離和壞死等病理學變化往往與外源性污染物脅迫所帶來的脂質過氧化有關[47].抗氧化酶系統(tǒng)能夠使自由基的產(chǎn)生與消除處于平衡狀態(tài),而重金屬、原油類等外源性污染物能引發(fā)生物體的氧化應激效應,當抗氧化酶系統(tǒng)的防御作用小于外源性污染物的損傷作用時,過量的自由基累積會導致機體引發(fā)脂質過氧化和組織損傷[48-49].
綜上,生物體是一個有機整體,原油暴露造成氧化脅迫,引起抗氧化酶活性的變化和脂質過氧化,從而會引起組織損傷,而IBR可以綜合反映各生物標志物的變化情況,可作為環(huán)境污染生物監(jiān)測的評價指標.
4.1 縊蟶在原油污染暴露下,鰓和內臟團組織中抗氧化酶活性和MDA含量均受到不同程度的誘導或抑制,用于清除機體內的ROS.SOD活性總體表現(xiàn)為低濃度誘導、高濃度抑制效應;SOD誘導與CAT抑制同時出現(xiàn),規(guī)律大致相反; MDA與SOD在鰓中變化規(guī)律相反;而內臟團中GPx與SOD變化規(guī)律相似,總體呈低濃度誘導、高濃度抑制效應.在時間-效應上,SOD活性呈升高-降低-升高的趨勢,鰓中酶活性最高為131.767U/mgprot,內臟團中酶活性被極顯著誘導至38.603U/mgprot;CAT與GPx活性變化規(guī)律相似,呈先降低后升高的趨勢; GST在鰓中呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,最高為371.663U/mgprot,內臟團中GST隨時間變化不明顯.原油暴露前期縊蟶鰓和內臟團中MDA含量顯著增加, 2種組織最高值分別為5.030和10.705nmol/mgprot,后期逐漸恢復至平穩(wěn)狀態(tài).
4.2 數(shù)據(jù)標準化后得到的星狀圖及IBR值,和酶活性差異結果一致,可作為生物毒性評價的有效補充指標.IBR評價發(fā)現(xiàn)SOD和CAT是最早參與自由基清除的酶.縊蟶的鰓組織對原油暴露的影響高于內臟團,更適合作為原油污染生物監(jiān)測的器官.
4.3 組織切片結果顯示原油暴露會導致鰓結構變形及鰓絲與軟骨組織脫離等現(xiàn)象,且隨暴露濃度的增加而愈加嚴重.
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Oxidative stress and IBR evaluation ofon intertidal oil pollution.
XU Qing-xia1, PAN Yu-ying1,2*, YANG Ting-ting1, YANG Jin-sheng3, ZHANG Meng1, CHEN Fan1, WANG Ying-ying1, TANG Zhong-wei1
(1.College of Fisheries of Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China;2.Key Laboratory of Marine Fishery Equipment and Technology of Zhejiang, Zhoushan 316022, China;3.College of Petrochemical Engineering & Environment, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China)., 2023,43(1):328~340
To discuss the toxic effect which induced by intertidal crude oil pollution to organisms, antioxidant enzyme activities and lipid peroxidation in gills and visceral mass, the changes of gills structure as well as Integrated Biomarker Response (IBR) ofexposed to different oil concentration were studied. The results showed that superoxide dismutase (SOD) activities in gills and visceral mass as well as glutathione peroxidase (GPx) activities in visceral mass appeared low concentration induction and high concentration inhibition effect in terms of dose-response. SOD induction and catalase (CAT) inhibition appeared at the same time while the rules were roughly opposite. In the time-effect, the SOD activities showed an increase-decrease-increase trend, while CAT and GPx activities showed the decrease-increase trend. The Glutathione S-transferase (GST) activities in gills showed an increase-decrease trend, the maximum value was 371.663U/mgprot. The malondialdehyde (MDA) content in the two tissues ofincreased significantly in the early stage of exposure (6h), the highest MDA content in gills and visceral mass were 5.030 and 10.705 nmol/mgprot, respectively, then gradually stabilized in the later stage. IBR results showed that biomarkers in gills were more sensitive to crude oil contamination. The crude oil exposure can deform the gills filament structure or cause their detachment. The results showed that gills ofwere more suitable as the organ for biological monitoring and evaluation of oil exposure in intertidal zone.
crude oil;;antioxidant enzyme activity;IBR;tissue damage
A
1000-6923(2023)01-0328-13
徐青霞(1998-),女,浙江紹興人,浙江海洋大學碩士研究生,主要研究方向為沉積物石油污染生物毒性效應.
2022-06-02
浙江省自然科學基金資助項目(LY19D060003);浙江省大學生科技創(chuàng)新活動計劃(新苗人才計劃)項目(2021R411006);國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(202110340052);浙江省屬高校基本科研業(yè)務費項目(2019J00023)
* 責任作者, 副教授, panyuying@zjou.edu.cn