崔恩慧，薛玉環(huán)，李辭霞，王 帥，朱曉巖，柴學軍，趙善廷*

(1.西北農林科技大學動物醫(yī)學院，楊凌 712100； 2.西安醫(yī)學院基礎醫(yī)學部，西安 710021)

以往在畜牧業(yè)生產中，抗生素被廣泛添加于動物飼料中，一方面防治疫病，另一方面作為生長促進劑以提高飼料轉化效率和家畜生長性能，然而動物產品中的抗生素殘留對人類健康構成了潛在威脅。加之目前國家飼料禁抗政策的實施，有必要開發(fā)既安全又高效的新型飼料添加劑替代品，取代抗生素來改善家畜健康和產品質量。

中藥被公認為是提高動物生產性能和免疫力的良好飼料添加劑。杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)是中國傳統(tǒng)中藥，資源豐富，應用廣泛，其樹皮、樹葉、種子和花均可作為生產生物活性物質的原料[1]，是我國農業(yè)農村部批準使用的飼料添加劑之一。近年來大量研究表明，杜仲葉也富含多種天然活性成分，如苯丙烷類、多糖、黃酮、環(huán)烯醚萜和木脂素[2-3]，其化學成分與杜仲皮相似[4-6]，二者藥用功能基本一致，均具有補肝腎、強筋骨的功效，可用于治療肝腎不足、腰膝酸痛等[7-9]，在降血脂、降糖、抗菌消炎等方面杜仲葉或可代替杜仲皮使用[10]。同時，杜仲葉因其產量豐富、易得、易收集、生長周期快等特點而受到廣泛關注。自2005年起，杜仲葉已正式載入《中國藥典》，2018年被中華人民共和國國家衛(wèi)生委員會列為藥食同源物質試點名單，突出了其在食品和制藥行業(yè)的開發(fā)潛力。一直以來，杜仲綜合利用率很低，僅杜仲皮化學成分和藥理研究較為廣泛。因此，基于杜仲葉的優(yōu)勢，它在藥理研究和飼料添加劑方面具有廣闊的應用前景。雖然杜仲葉作為飼料添加劑的研究已經屢見不鮮，但是杜仲葉免疫調節(jié)的作用機制尚不清楚。本研究采用網絡藥理學和試驗驗證相結合的研究策略，探究杜仲葉的生物活性成分及其免疫調節(jié)作用機制，為其在飼料添加劑生產實踐中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 數據庫及分析軟件

中藥系統(tǒng)藥理學數據庫及分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP, https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php),Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/), 人類孟德爾遺傳綜合數據庫OMIM(https://www. omim.org/), GeneCards綜合數據庫(https://www.genecards.org/), Swiss Target Prediction數據庫 (http://www.swi sstargetprediction.ch/), String11.5(https://cn.string-db.org/), Cytoscape軟件(3.8.2)。

1.2 藥物活性成分的篩選

通過TCMSP數據庫檢索并結合文獻收集，以口服生物利用度(OB≥30%)、類藥性(DL≥0.18)為限定條件篩選杜仲葉有效化學成分，并根據已發(fā)表的文獻報道補充未預測到的活性化合物的已知靶點，剔除沒有靶基因的活性成分，然后通過Uniprot 數據庫和Swiss Target Prediction數據庫獲得基因名。

1.3 疾病靶點篩選

在GeneCards和OMIM 數據庫搜索框中輸入“immune dysregulation”，收集與免疫失調相關的靶點基因，將挖掘得到的免疫失調相關基因與杜仲葉靶點基因篩選出交集基因并以維恩圖形式表示，得到杜仲葉免疫調節(jié)的作用靶點。

1.4 蛋白質-蛋白質互作網絡構建

通過String平臺構建上述交集基因的PPI，將蛋白種類設置為“Homosapiens”，最低相互作用閾值設為“medium”(0.400)，其它保持默認數值。將Tsv文件導入Cytoscape3.8.2軟件繪制蛋白相互作用網絡，利用插件CytoNCA進行網絡拓撲學分析，計算每個節(jié)點的打分，篩選打分較高的節(jié)點再次構建網絡，從而得出杜仲葉免疫調節(jié)PPI 網絡中的核心靶點。使用R (3.6.3版本)進行GO功能富集分析和KEGG富集分析。

1.5 細胞體外試驗驗證

1.5.1 主要儀器與試劑 細胞培養(yǎng)箱(SANYO，MCO-18AIC)，低溫離心機(Sigma，1-14K)，多功能酶標儀(Thermo，Varioskan LUX)，DMEM(Gibco，10313021)，胎牛血清(Gibco，10091148)，青鏈霉素混合液(Solarbio，P1400)，二甲基亞砜(DMSO)、中性紅分析純(天津市科密歐化學試劑有限公司)；環(huán)磷酰胺(Solarbio, SC5540)，杜仲葉提取物(陜西瑞林帕尼爾生物科技有限公司提供)。

1.5.2 腹腔巨噬細胞的制備 小鼠處死后，腹腔注射10 mL PBS收集巨噬細胞，加入高糖DMEM培養(yǎng)液(含10%熱滅活胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素)適量，調整細胞密度為2×106個·mL-1的單細胞懸液后加入96孔板，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5.3 巨噬細胞的增殖能力 將巨噬細胞(2×106細胞·mL-1) 加入96孔板，100 μL·孔-1，試驗分組為空白對照組(巨噬細胞+培養(yǎng)液)、各濃度藥物組(1 000、2 000、3 000、4 000、5 000、6 000、7 000、8 000、9 000、10 000 μg·mL-1杜仲葉提取物+巨噬細胞)，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)40 h，然后每孔加入20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后再加入100 μL DMSO，用酶標儀在570 nm處測定各孔吸光度。

1.5.4 巨噬細胞的吞噬能力 每孔加入各濃度(1 000、2 000、3 000、4 000、5 000、6 000、7 000、8 000、9 000、10 000 μg·mL-1)杜仲葉提取物100 μL，每個藥物濃度重復5孔，另設 LPS 對照組(LPS+巨噬細胞+培養(yǎng)基)和空白對照組(巨噬細胞+培養(yǎng)液)。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，0.09%中性紅染色4 h，然后用PBS溶液洗滌3次，去除多余的中性紅，每孔加入100 μL DMSO 靜置過夜，在酶標儀570 nm處讀取吸光度。

1.6 體內試驗

1.6.1 試驗材料 杜仲葉水提物：由陜西瑞林帕尼爾生物科技有限公司生產提供，生產批號RP20210723；環(huán)磷酰胺：購自北京索萊寶。

SPF級雄性ICR小鼠60只，6～8周齡，購于西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心[SCXK(陜)2018-001]。小鼠飼養(yǎng)于西北農林科技大學神經生物學實驗室，溫度控制在(23±1)℃，相對濕度為50%～60%，試驗期間動物自由進食和飲水。

1.6.2 動物分組 小鼠自由進食和飲水適應一周后，用苦味酸標記，隨機分為：正常組、模型組、杜仲葉治療組，每組8只。模型組和杜仲葉治療組連續(xù)7 d腹腔注射70 mg·kg-1環(huán)磷酰胺，建立免疫抑制模型，正常組注射生理鹽水。然后分別灌胃21 d不同物質：正常組和模型組灌胃生理鹽水，杜仲葉治療組灌胃1.6 g·kg-1杜仲葉提取物。

1.6.3 測量胸腺和脾臟指數 小鼠處死后，將免疫器官胸腺和脾通過手術分離并稱重，用生理鹽水溫和漂洗干凈，再用濾紙吸取表面水分后稱重，并以小鼠處死前體重為基準計算相應的脾臟和胸腺指數。免疫器官指數以免疫器官重量(mg)/體重(g)表示。

1.6.4 外周血白細胞和淋巴細胞的檢測 小鼠眼球采血，注入無菌的EDTA抗凝管中，采用邁瑞獸用全自動血液細胞分析儀進行計數。每組檢測8個重復樣本。

1.6.5 杜仲葉提取物對小鼠碳廓清能力的影響 小鼠經尾靜脈注射稀釋4倍的印度墨水100 μL。在2 min (tA)和10 min (tB)時間點，取眶后靜脈血樣，20 μL樣品與2 mL 0.1% Na2CO3混合。測量每個樣品在600 nm處的吸光度(tA為ODA, tB為ODB)。吞噬指數(α)計算如下:

廓清指數K=(lgODA-lgODB)/(tA-tB)

吞噬指數α=K(1/3)×WB/(WL+WS)

其中WB、WS、WL分別為體重、肝重、脾重。

1.6.6 杜仲葉提取物對小鼠遲發(fā)型超敏反應(DTH)的影響 DTH是評價細胞免疫功能的一種方法。第1天腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX)后，小鼠腹部剃毛3 cm×3 cm，涂抹5%DNCB的丙酮-麻油溶液20 μL·只-1致敏。5 d后將5%二硝基氟苯10 μL均勻涂于小鼠右耳兩側進行第二次致敏。24 h后處死小鼠，取下8 mm耳片稱重，通過左右耳重量的變化來評價DTH的程度。

2 結 果

2.1 杜仲葉活性成分和靶基因的篩選

以OB≥30%，DL≥0.18作為篩選條件，通過TCMSP數據庫并結合已發(fā)表文獻，補充不符合篩選條件，但為藥物主要功效成分的化合物綠原酸，作為最終活性化合物，包括山奈酚、兒茶素、槲皮素、綠原酸，排除無對應靶點的活性成分兒茶素(MOL000492)，共得到3種潛在活性成分。同時通過Uniprot 數據庫和Swiss Target Prediction數據庫共篩選出306個靶點基因，見圖1和表1。

圖1 杜仲葉化學成分-靶點網絡圖Fig.1 Compound-target network of Eucommia ulmoides leaf

表1 杜仲葉的活性成分及參數Table 1 Active ingredients and parameters of Eucommia ulmoides leaf

2.2 杜仲葉和免疫調節(jié)交集基因的篩選

利用GeneCards和OMIM 數據庫獲得免疫調節(jié)相關靶點1 107個，建立了疾病靶點數據集。通過R軟件取杜仲葉靶點和免疫調節(jié)靶點交集，共得到105個既與杜仲葉潛在活性化合物相關又與免疫調節(jié)相關的基因，見圖2。

圖2 藥物與疾病的交集基因Fig.2 Intersection of drug genes and disease targets

2.3 杜仲葉和免疫調節(jié)核心蛋白相互作用網絡

將105個交集基因經STRING進行分析，構建蛋白互作網絡，見圖3。通過網絡拓撲分析進一步篩選核心靶點，篩選條件為連接度(Degree)、介度(Betweenness)、緊密度(Closeness)，最終獲得21個核心靶點，見圖4。

圖3 杜仲葉-免疫調節(jié)靶點PPI網絡Fig.3 PPI network of targets related to the treatment of immune dysregulation with ELE

圖4 PPI網絡拓撲分析核心靶點Fig.4 Key target of PPI network topology analysis

2.4 杜仲葉和免疫調節(jié)GO功能富集分析和KEGG富集分析

對核心靶點進行GO富集分析，確定GO條目共2 342 個，包括2 218條生物學過程(biological process, BP)，主要涉及脂多糖反應、細菌源性分子反應、氧化應激反應、平滑肌細胞增殖調控、細胞對氧化應激的調控、神經炎癥反應等；13條細胞成分(cell component，CC)，與RNA聚合酶II轉錄因子復合物、核轉錄因子、膜筏、膜微區(qū)、轉錄因子復合物、血小板α顆粒腔等相關；111條分子功能(molecular function，MF)，包括細胞因子受體結合、細胞因子活性、受體配體活性、生長因子受體結合、泛素蛋白連接酶結合等，見圖5。KEGG富集到135條通路，主要涉及IL-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、人巨細胞病毒感染、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、耶爾森菌感染、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、乙型肝炎、MAPK信號通路等，見圖6。

圖5 交集靶點GO 富集分析Fig.5 GO enrichment analysis of key targets

圖6 核心靶點KEGG通路富集分析Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis of key targets

2.5 腹腔巨噬細胞試驗驗證

2.5.1 杜仲葉提取物對巨噬細胞增殖的影響 按照不同濃度杜仲葉提取物處理巨噬細胞后，發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比，10 000 μg·mL-1濃度的OD值顯著降低(P<0.05)，說明此濃度抑制細胞生長，對細胞有毒性；6 000～9 000 μg·mL-1濃度處理的巨噬細胞與空白對照組相比差異不顯著(P>0.05)，說明這幾個藥物濃度對細胞沒有毒性作用，對細胞活力無顯著影響；2 000～5 000 μg·mL-1濃度處理的巨噬細胞與空白對照組相比OD值顯著性升高(P<0.01)，說明這幾個濃度均能促進細胞生長，且隨著濃度增加細胞增殖越明顯，具有一定劑量依賴性(圖7)。

與空白對照組比較，**P<0.01, *P<0.05Compared with the blank control group, **P<0.01, *P<0.05圖7 杜仲葉對小鼠巨噬細胞增殖的影響Fig.7 The influence of Eucommia ulmoides leaf in macrophage proliferation of mice

2.5.2 杜仲葉提取物對巨噬細胞吞噬功能的影響 LPS組OD值大于空白對照組，差異極顯著(P<0.01)，說明LPS能促進巨噬細胞吞噬作用。3 000、4 000、5 000 μg·mL-1濃度的杜仲葉與LPS相比差異極顯著(P<0.01)，2 000 μg·mL-1濃度的杜仲葉與LPS相比差異顯著(P<0.05)，說明這4個濃度促進巨噬細胞吞噬能力大于LPS，1 000 μg·mL-1濃度的杜仲葉與LPS相比差異不顯著(P>0.05)，但是1 000～5 000 μg·mL-1濃度的杜仲葉與空白對照組相比差異都是極顯著(P<0.01)，說明這5個濃度均能顯著促進巨噬細胞吞噬能力(圖8)。

與空白對照比較，##P<0.01;與LPS組比較*P<0.05,**P<0.01Compared with blank control group, ##P<0.01; Compared with LPS group, *P<0.05,**P<0.01圖8 杜仲葉對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響Fig.8 The influence of Eucommia ulmoides leaf in macrophage phagocytosis of mice

2.6 體內試驗

2.6.1 小鼠體重的變化 腹腔注射環(huán)磷酰胺造模后小鼠精神不佳，食欲下降，毛色暗，說明造模成功。各組小鼠體重變化見表2。在注射環(huán)磷酰胺之前，各組小鼠體重無差異(P>0.05)，第1～7天連續(xù)注射環(huán)磷酰胺7 d構建免疫抑制模型，模型組和杜仲葉組體重顯著下降(P<0.05)。第8天治療組開始灌胃杜仲葉提取物，試驗結束后，模型組和杜仲葉治療組之間無顯著差異，但是有升高趨勢，說明杜仲葉對小鼠體重有積極作用。

表2 小鼠體重變化Table 2 Change in mice body weight g

2.6.2 杜仲葉提取物對免疫器官的影響 如圖9所示，模型組小鼠脾臟指數、胸腺指數均較正常對照組顯著降低(P<0.05)。同時，與模型組相比，杜仲葉治療組小鼠脾臟指數顯著增加(P<0.05)，胸腺指數也有增加。這表明，杜仲葉可以一定程度上抵抗環(huán)磷酰胺誘導的免疫抑制。

NC. 正常對照組；MC. 模型組；ELE. 杜仲葉提取物組。與正常對照比較，#P<0.05， ##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05。下同NC. Normal control group; MC. Model control group; ELE. Eucommia ulmoides leaf extract group. Compared with blank control group, #P<0.05, ##P<0.01; *Compared with MC group, *P<0.05, **P<0.01. The same as below圖9 小鼠免疫器官指數Fig.9 Immune organ indexes of mice

2.6.3 杜仲葉提取物對血常規(guī)的影響 如表3所示，與正常對照組相比，模型組小鼠外周血白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)、和血紅蛋白(HGB)均顯著下降(P<0.05)。杜仲葉治療組小鼠血液中WBC含量顯著高于模型組(P<0.05)，RBC、HGB含量高于模型組但差異不顯著，說明杜仲葉可促進小鼠白細胞、紅細胞的生成。

表3 對小鼠血液指標的影響Table 3 Effects on blood routine index in mice

2.6.4 杜仲葉提取物對小鼠碳廓清能力的影響 單核細胞的吞噬作用可以通過碳廓清試驗來評估見圖10。與正常對照組相比，模型組小鼠吞噬指數(α)顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，杜仲葉治療組能顯著提高小鼠的吞噬指數(α)(P<0.05)。結果表明，杜仲葉能提高免疫抑制小鼠的碳清除能力。

圖10 小鼠吞噬指數αFig.10 Phagocytic index α of mice

2.6.5 杜仲葉提取物對小鼠DTH超敏反應的影響 耳廓腫脹表明DTH反應的強度，這是由參與細胞免疫的T細胞介導的。如圖11所示，與正常組比較，模型組耳廓腫脹明顯減輕(P<0.01)，說明DNFB誘導的DTH模型建立成功。與模型組比較，杜仲葉能有效增加小鼠耳廓腫脹(P<0.01)，說明杜仲葉能增強環(huán)磷酰胺處理小鼠的DTH反應。結果表明，杜仲葉的免疫調節(jié)活性可能與細胞免疫有關。

圖11 小鼠DTH耳腫脹度Fig.11 Ear swelling in DTH of mice

3 討 論

杜仲葉提取物和活性成分可以增強動物的機體免疫力。杜仲葉乙醇提取物能顯著增強小鼠免疫力[11]，綠原酸是杜仲葉中主要有效成分之一，具有提高犬抗氧化能力和體液免疫的功能[12]。杜仲葉及其提取物如綠原酸、黃酮等對養(yǎng)殖動物的生長性能、免疫、肉質及抗氧化能力等方面也具有促進作用[13-16]。

本研究基于網絡藥理學方法分析了杜仲葉在免疫失調中起調節(jié)作用的活性成分、藥物靶點和關鍵途徑。結果顯示，杜仲葉免疫調節(jié)的主要化合物為山奈酚、槲皮素、綠原酸，這些有效成分主要作用于TNF、IL-6、VEGFA、IL-1β等關鍵靶點，然后通過IL-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、MAPK信號通路等發(fā)揮免疫調節(jié)作用。

隨后，本研究對杜仲葉免疫調節(jié)作用進行了體內、體外試驗驗證。體外試驗研究了杜仲葉水提物對小鼠腹腔巨噬細胞增殖及對巨噬細胞吞噬功能的影響，發(fā)現(xiàn)杜仲葉提取物在1 000～5 000 μg·mL-1劑量范圍內能夠促進小鼠腹腔巨噬細胞增殖和細胞吞噬作用。

體內試驗通過環(huán)磷酰胺誘導的免疫抑制模型研究了杜仲葉對免疫抑制的影響。環(huán)磷酰胺作為一種有效的免疫抑制劑，可影響機體的免疫系統(tǒng)并誘導免疫功能失衡，表現(xiàn)為體重、免疫器官指標和免疫球蛋白的下降[17-19]。本研究中，與正常對照組相比，模型組小鼠的脾臟指數、胸腺指數、巨噬細胞吞噬活性均顯著降低，WBC、RBC和HGB也明顯下降。以上結果表明，試驗小鼠處于免疫抑制狀態(tài)，說明免疫抑制小鼠模型是成功的。

體重是小鼠生長狀況的指標，可以反映環(huán)磷酰胺誘導小鼠的免疫狀態(tài)[20-21]。本試驗中，杜仲葉可以改善環(huán)磷酰胺引起的機體損傷并一定程度恢復小鼠體重。免疫系統(tǒng)由免疫分子、免疫細胞和免疫器官組成。胸腺和脾是免疫系統(tǒng)的重要器官，它們的器官指數可以反映免疫功能和預后。與模型組相比，杜仲葉治療組小鼠的胸腺和脾臟指數顯著增加，減輕了環(huán)磷酰胺誘導的免疫抑制。

WBC、RBC和HGB等臨床血液參數是監(jiān)測化療不良反應的常規(guī)標志物[22]。WBC由粒細胞(中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞)、單核細胞和淋巴細胞組成。WBC計數是免疫激活和可能感染的生物標志物[23]。RBC在支持組織代謝方面發(fā)揮重要作用。高效的紅細胞是維持組織氧合和酸堿平衡所必需的[24]。紅細胞能夠與內皮細胞、血小板和巨噬細胞相互作用，參與維持血栓形成和止血，在免疫反應中發(fā)揮重要作用[25]。紅細胞中的HGB負責人體內氧氣的運輸。環(huán)磷酰胺可以影響骨髓的造血功能，導致外周血WBC、RBC、HGB等減少[26]。杜仲葉可以恢復外周血WBC、RBC和HGB的計數。說明杜仲葉能促進環(huán)磷酰胺誘導的免疫抑制小鼠造血功能恢復，這可能與促進骨髓造血功能有關。

巨噬細胞可以通過先天免疫作用進行吞噬[27]。杜仲葉治療組吞噬指數(α)增加表明，杜仲葉可以增強巨噬細胞的吞噬能力。DNFB誘導的DTH是一種由T淋巴細胞介導的細胞免疫，其特點是非特異性炎癥細胞的高度聚集[28]。本研究中，杜仲葉提取物可以通過增加小鼠耳部腫脹來增強 DTH。該結果表明杜仲葉可能在細胞免疫反應中發(fā)揮作用。

4 結 論

本研究通過網絡藥理學預測杜仲葉免疫調節(jié)的作用機制，并結合體外、體內試驗驗證了杜仲葉的免疫調節(jié)作用，對其免疫調節(jié)的機制做了初步探討，為杜仲葉作為飼料添加劑的開發(fā)提供理論依據。