陳 敏，劉明星，張鵬云，藺輝星，范紅結(jié)

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物細(xì)菌學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095)

副豬格拉瑟菌(Glaesserellaparasuis，GPS)是革蘭陰性細(xì)菌，分布于世界各地，包含15種血清型，其中血清4型和血清5型在世界流行最為廣泛[1-2]。臨床上以體溫升高、關(guān)節(jié)腫脹、呼吸困難、多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和高死亡率為特征，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。在環(huán)境應(yīng)激、機(jī)體免疫力下降以及其他病原共感染時(shí)，該菌可突破呼吸道屏障，經(jīng)血液循環(huán)引起豬系統(tǒng)性感染，其中肺組織損傷最為嚴(yán)重[5]。黏膜屏障是宿主抵御呼吸道病原菌的第一道防線，其中黏膜上皮細(xì)胞間形成的頂部連接復(fù)合體(apical junctional complexes, AJC)可作為物理屏障阻擋病原菌。AJC包括緊密連接(tight junction, TJ)、黏附連接(adherens junction，AJ)和橋粒(desmosome)[6]。TJ位于極化上皮的頂端部分，調(diào)節(jié)單層上皮細(xì)胞的細(xì)胞旁通透性[7]。

細(xì)胞致死性膨脹毒素(cytolethal distending toxin, CDT)是一種由革蘭陰性細(xì)菌所產(chǎn)生的AB2型毒素，被編碼在具有3種蛋白質(zhì)CdtA、CdtB和CdtC的單個(gè)操縱子中[8]。其中CdtB是活性毒性單位，對宿主細(xì)胞的損傷起主要作用，兩個(gè)亞基CdtA和CdtC構(gòu)成CDT與靶細(xì)胞結(jié)合以及將CdtB遞送到細(xì)胞內(nèi)部所需的“B2”單位[9]。在目前所知的GPS的15個(gè)血清型參考株中，均能表達(dá)CdtB[10]。細(xì)菌的外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs)是細(xì)菌特有的一種生理結(jié)構(gòu)，可通過與質(zhì)膜融合或通過內(nèi)吞途徑攝取而將其內(nèi)容物遞送至宿主細(xì)胞，在細(xì)菌與宿主的相互作用、免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能[11]。另外，Zhang等[12]對GPS H45菌株的外膜囊泡做了蛋白組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其表面存在許多GPS毒力因子，如CdtA、CdtB、CdtC、vtaA9、tbpA、manB、ompP5和Tbp。然而，CDT在GPS5-SQ菌株中是否以O(shè)MVs的形式存在未見報(bào)道。另外，目前對GPS OMVs的研究僅局限于OMVs蛋白組學(xué)分析，至于OMVs在GPS致病機(jī)制中的作用亦鮮有報(bào)道。

細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，它可以引起DNA損傷反應(yīng)，導(dǎo)致特征性的G2/M細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞腫脹和細(xì)胞核增大[13]。據(jù)報(bào)道，GPS的CDT蛋白全毒素會(huì)導(dǎo)致新生仔豬氣管上皮細(xì)胞(newborn piglet tracheal cell, NPTr)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞膨脹和細(xì)胞凋亡[14]。在細(xì)胞凋亡過程中，Caspase可以裂解細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，包括緊密連接成分和黏附連接成分[15]。并且在誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡之后，跨上皮電阻值顯著降低，最終導(dǎo)致通透性的增加[16]。然而，副豬格拉瑟菌是否可以通過OMVs轉(zhuǎn)運(yùn)CdtB蛋白引起豬呼吸道上皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而破壞呼吸道上皮屏障未見報(bào)道。

本研究以豬呼吸道上皮細(xì)胞(swine tracheal epithelial cells, STEC)為細(xì)胞模型，通過檢測OMVs和CdtB蛋白處理STEC后凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3的表達(dá)水平、緊密連接蛋白TJ的表達(dá)水平和細(xì)胞旁通透性，研究GPS通過OMVs傳遞CdtB蛋白引起STEC的細(xì)胞凋亡，進(jìn)而突破細(xì)胞屏障的機(jī)制，其研究結(jié)果有助于進(jìn)一步闡明GPS感染的致病機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體及細(xì)胞 豬氣管上皮細(xì)胞(swine tracheal epithelial cells, STEC)采用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。副豬格拉瑟菌5型GPS5-SQ菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存。pET-28a載體、pET-32a載體、大腸桿菌DH5α菌株、大腸桿菌BL21(DE3)菌株均由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌Rosetta gami(DE3)plysS感受態(tài)細(xì)胞購自上海生工公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只體重20～25 g的6周齡SPF級(jí)雌性ICR小鼠購自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.3 主要試劑 副豬格拉瑟菌適用培養(yǎng)基為胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(Tryptic Soy Broth，TSB)，購自美國BD公司；NAD(輔酶I)和瓊脂Agar購自德國BioFROXX生物試劑公司；T4 DNA連接酶和快切酶均購自大連TaKaRa生物工程公司；HRP-山羊抗小鼠IgG H&L和HRP-山羊抗兔IgG H&L二抗購自美國Invitrogen公司；Cleaved Caspase3單抗、ZO-1單抗、claudin-1單抗和occludin單抗購自美國CST公司；DiO染料購自MCE生物科技有限公司；TRITC Phalloidin 羅丹明鬼筆環(huán)肽和DAPI溶液購自北京索萊寶科技有限公司；2-嗎啉乙磺酸(MES)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHC)購自上海吉至生化科技有限公司；磁性聚合物納米微球購自上海奧潤微納新材料科技有限公司；Annexin-V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以GPS5-SQ基因組為模板，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增hbpA、ompP2、cdtA、cdtB和cdtC基因的引物(見表1)，設(shè)計(jì)好的引物由南京金斯瑞生物公司進(jìn)行合成。PCR反應(yīng)體系為：DNA模板1 μL，上、下游引物各2 μL，2×PrimeStar Max 25 μL，ddH2O 25 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃2 min；變性98 ℃ 10 s、退火55 ℃ 15 s、延伸72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，終延伸72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后回收。載體和PCR產(chǎn)物經(jīng)內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)結(jié)束后回收酶切產(chǎn)物，經(jīng)T4 DNA連接酶連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于卡那或氨芐抗性的LB平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜，挑取單克隆菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定并送于南京擎科生物技術(shù)有限公司測序。

表1 本試驗(yàn)所用PCR引物Table 1 PCR primers used in this experiment

1.2.2 重組蛋白的表達(dá)及純化 提取的重組質(zhì)粒經(jīng)測序后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)和Rosetta gami(DE3)plysS感受態(tài)細(xì)胞中，并在含有100 μg·mL-1氨芐抗生素的LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)。待OD600 nm為0.6時(shí)加入終濃度1 mmol·L-1的IPTG，然后放入16 ℃搖床中繼續(xù)過夜誘導(dǎo)12 h，次日超速破碎菌體并收集上清和沉淀，經(jīng)SDS-PAGE及考馬斯亮藍(lán)染色。利用His標(biāo)簽蛋白瓊脂糖純化樹脂對重組蛋白進(jìn)行純化。

1.2.3 多克隆抗體的制備 30只體重20～25 g的6周齡SPF級(jí)雌性ICR小鼠購自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)分為6組，每組5只，分別為Omp2組、HbpA組、CdtA組、CdtB組、CdtC組及PBS組。將純化后的重組蛋白與弗氏佐劑以體積比1∶1混勻后進(jìn)行乳化。采用小鼠背部多點(diǎn)皮下注射的方式免疫小鼠3次。各免疫組小鼠的注射劑量為每只50 μg，首次免疫14 d后進(jìn)行第二次免疫，首次免疫28 d后進(jìn)行第三次免疫，分別在二免與三免后第7天收集小鼠血清保存于-80 ℃。另外，通過Mab Traap Kit抗體純化試劑盒對CdtB組多克隆抗體進(jìn)行純化。

1.2.4 生長曲線測定 將凍存的GPS5-SQ菌液于TSA平板上復(fù)蘇，待平板長出單菌落后，挑取單菌落于2 mL TSB培養(yǎng)基(0.03 g·mL-1的TSB, 10%的FBS, 終濃度為0.1 mg·mL-1的NAD)中37 ℃，180 r·min-1過夜培養(yǎng)。將菌液按照1∶100轉(zhuǎn)接到新的20 mL的TSB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃，180 r·min-1的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)14 h，每隔2 h取樣測定其在600 nm處的吸光值OD600 nm。

1.2.5 外膜囊泡的分離和標(biāo)記 按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法，經(jīng)過密度梯度離心的方法提取外膜囊泡[17]。即將2 000 mL的GPS5-SQ菌液37 ℃、180 r·min-1的恒溫?fù)u床中生長至對數(shù)生長期的后期(OD600 nm=1.2～1.4)，在4 ℃下以8 000×g離心15 min去除細(xì)菌細(xì)胞。通過0.22 μm過濾器過濾滅菌后，使用100 ku超濾管通過超濾濃縮上清液，最后通過在4 ℃下以150 000×g超速離心3 h(轉(zhuǎn)子類型50.2 Ti，Beckman-Coulter)收集OMVs。在用無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)懸浮顆粒狀OMVs后，通過密度梯度離心用20%、25%、30%、35%和40%的OptiPrep [60%碘克沙醇(w/v)]進(jìn)行純化。

將純化的OMVs進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色觀察OMVs中蛋白質(zhì)的大小。透射電子顯微鏡(TEM，負(fù)染)和納米粒子直徑(NTA)分析OMVs粒子形態(tài)和數(shù)目，并測定蛋白濃度。用制備的多克隆抗體進(jìn)行Western blot驗(yàn)證，確定GPS OMVs中是否含有CDT蛋白。最后將純化的CdtB蛋白以及OMVs分別在SDS-PAGE中進(jìn)行電泳分離，用CdtB多克隆抗體進(jìn)行Western blot驗(yàn)證，以便對OMVs進(jìn)行定量。

將純化的OMVs與蛋白酶K一起孵育，驗(yàn)證OMVs結(jié)構(gòu)保護(hù)蛋白質(zhì)免受蛋白酶降解的能力。對于標(biāo)記，將OMVs與5 μg·mL-1的DiO孵育30 min，使用100 ku超濾管去除未摻入的染料，將40 μg·mL-1DiO標(biāo)記的外膜囊泡在37 ℃下與STEC共孵育5 h。隨后用PBS洗滌，用4%多聚甲醛固定并依次用100 nmol·L-1的TRITC Phalloidin和100 nmol·L-1的DAPI避光孵育20 min，通過熒光顯微鏡對細(xì)胞進(jìn)行成像。

1.2.6 細(xì)胞凋亡檢測 將STEC接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至90%時(shí)，用不同濃度CdtB(50、100、500 ng·mL-1)和OMVs(20 μg·mL-1)分別與細(xì)胞共孵育36 h，陰性對照組加入無血清DMEM，陽性對照組加入1 μmol·L-1Staurosporine。待細(xì)胞處理36 h后，收集細(xì)胞并用500 μL的Annexin-V結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL異硫氰酸熒光素(FITC)和PI避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞百分比。

將細(xì)胞與CdtB(500 ng·mL-1)和OMVs(20 μg·mL-1)分別孵育36 h，裂解細(xì)胞收集細(xì)胞總蛋白。定量后將pNA(10 mmol·L-1)用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋后用酶標(biāo)儀檢測405 nm處的吸光度，制作pNA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。取50 μL待檢樣品的細(xì)胞裂解上清液加入40 μL檢測緩沖液和10 μL的Ac-DEVD-pNA，37 ℃下避光反應(yīng)l h。Caspase3的相對活性以凋亡誘導(dǎo)細(xì)胞與空白對照細(xì)胞的吸光度值(A405 nm)的比值表示(Staurosporine作為陽性對照，1 μmol·L-1，溶于DMSO)。

1.2.7 細(xì)胞毒性檢測 細(xì)胞凋亡后，細(xì)胞漿內(nèi)酶活性較為穩(wěn)定的乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)會(huì)釋放到培養(yǎng)液中，通過檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH的釋放量從而對細(xì)胞毒性進(jìn)行分析[18]。將STEC以每孔103個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞板，每孔200 μL，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。試驗(yàn)設(shè)置空白對照組與實(shí)驗(yàn)組，分別于6、12、24、36和48 h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，LDH法測定細(xì)胞存活率，每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，試驗(yàn)共進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)。

1.2.8 上皮屏障完整性的測定 為了在體外建立STEC單層模型，將250 μL的細(xì)胞懸液接種在Transwell的上室中[19]。用移液管將600 μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基加入下室，置于37 ℃，5% CO2條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。每天更換培養(yǎng)基提供營養(yǎng)；并用細(xì)胞電阻儀檢測電阻值，實(shí)時(shí)記錄，待數(shù)值穩(wěn)定后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

為評(píng)價(jià)CdtB蛋白和OMVs介導(dǎo)的屏障完整性調(diào)節(jié)的意義，單獨(dú)用CdtB和OMVs處理STEC，分別于處理0、6、12、24和36 h后測定細(xì)胞的電阻值。

同上處理細(xì)胞36 h后將上室的培養(yǎng)基換成FD4溶液(1 mg·mL-1，用HBSS緩沖液稀釋)，下室換成HBSS緩沖液，未處理的細(xì)胞單層用作對照。并于0和4 h取下室100 μL液體用熒光酶標(biāo)儀中在490 nm的激發(fā)波長和520 nm的發(fā)射波長下測定基底外側(cè)小室的熒光強(qiáng)度；FD-4通量值(FI)的計(jì)算：每個(gè)樣本的熒光強(qiáng)度減去0 h測得的熒光強(qiáng)度，數(shù)據(jù)表示為與未感染對照細(xì)胞相比的倍數(shù)變化。

1.2.9 免疫磁珠分離 通過先前報(bào)道的方法進(jìn)行免疫磁性分離，并進(jìn)行了一些改動(dòng)[20]：用N3-dimethylpropane-1,3-diamine和N-hydroxysuccinimide活化磁珠，將純化后的500 μg CdtB多克隆抗體與2 mg磁珠偶聯(lián)。取5 mg超速破碎后的OMVs加入到偶聯(lián)后的磁珠中，37 ℃孵育30 min，置磁力架上2～3 min，待磁珠充分被吸附，分別收集上清(IMC-CdtB)和其余液體(OMVs-ΔCdtB)。

1.2.10 蛋白免疫印跡 將STEC接種于12孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至90%時(shí)用CdtB蛋白、OMVs、OMVs-ΔCdtB等處理細(xì)胞36 h。然后用RIPA細(xì)胞裂解液在冰上裂解細(xì)胞以提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)而在SDS-PAGE中進(jìn)行電泳分離(每孔10 μg)。然后通過半干轉(zhuǎn)的方法將蛋白轉(zhuǎn)印至0.22 μm的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉，2 h后加入用封閉液稀釋的特定的一抗并以45 r·min-1轉(zhuǎn)速在4 ℃搖床孵育過夜。次日將膜與HRP-山羊抗小鼠IgG H&L或HRP-山羊抗兔IgG H&L在室溫下孵育1 h，經(jīng)TBST洗膜用ECL發(fā)光液曝光、顯影，并用Image Lab軟件分析結(jié)果。

1.2.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理 使用ImageJ軟件對Western blot結(jié)果進(jìn)行灰度分析，并利用GraphPad Prism 8.4.3軟件ANOVA檢驗(yàn)比較各組數(shù)據(jù)的差異性。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定

使用限制性內(nèi)切酶BamH I與SalI對pET-28a、pET-28a-hbpA和pET-28a-ompP2載體進(jìn)行雙酶切，使用限制性內(nèi)切酶BamH I與EcoR I對pET-32a、pET-32a-cdtA、pET-32a-cdtB和pET-32a-cdtC載體進(jìn)行雙酶切。酶切鑒定結(jié)果如圖1所示：表明成功構(gòu)建hbpA-pET28a載體、ompP2-pET28a載體、cdtA-pET32a載體、cdtB-pET32a載體和cdtC-pET32a載體。

M.DL5000相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET-28a載體；2.pET-28a-hbpA載體；3.pET-28a-ompP2載體；4.pET-32a載體；5.pET-32a-cdtA載體；6.pET-32a-cdtB載體；7.pET-32a-cdtC載體M.DL5000 DNA Marker; 1. pET-28a plasmid; 2.pET-28a-hbpA plasmid; 3.pET-28a-ompP2 plasmid; 4.pET-32a plasmid; 5.pET-32a-cdtA plasmid; 6. pET-32a-cdtB plasmid; 7. pET-32a-cdtC plasmid圖1 質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.1 Enzymatic digestion of plasmid

2.2 重組蛋白的純化

利用His鎳柱純化5種蛋白，rHbpA、rOmpP2、rCdtA、rCdtB和rCdtC重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定后，分別在60、40、40、47和21 ku附近出現(xiàn)蛋白條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。BCA測定5種重組蛋白的濃度分別為0.32、2.12、0.85、1.21 和0.94 mg·mL-1(圖2A)。將純化后的5種蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，一抗為鼠源抗His單克隆抗體，鑒定結(jié)果如圖2B，進(jìn)一步證明5種蛋白成功表達(dá)并純化。

A. SDS-PAGE鑒定重組蛋白；B. Western blot鑒定純化的重組蛋白；M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～5.純化的HbpA、OmpP2、CdtA、CdtB和CdtC蛋白A. Identification of recombinant protein by SDS-PAGE; B. Identification of purified recombinant protein by Western blot; M.Protein molecular weight standard; 1-5. Purified HbpA, OmpP2, CdtA, CdtB, CdtC proteins圖2 純化的重組蛋白 SDS-PAGE 檢測及 Western blot 鑒定Fig.2 The purified recombinant protein analyzed by SDS-PAGE and Western blot

2.3 多克隆抗體的Western blot分析

將純化后的5種蛋白以及GPS5-SQ菌體沉淀煮樣后進(jìn)行Western blot鑒定，一抗為制備的多克隆抗體(均1∶5 000稀釋)。結(jié)果顯示，本研究制備的5種鼠抗HbpA、OmpP2、CdtA、CdtB和CdtC多克隆抗體具有良好的特異性(圖3A)。

A.多克隆抗體的Western blot分析。B. SDS-PAGE鑒定CdtB抗體的純度；M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～6.純化的CdtB多克隆抗體A. Western blot analysis of polyclonal antibody. B. Identification of the purity of CdtB antibody by SDS-PAGE; M.Protein molecular weight standard; 1-6.Purified CdtB polyclonal antibody圖3 多克隆抗體的Western blot分析Fig.3 Western blot analysis of polyclonal antibody

用抗體純化試劑盒對CdtB多克隆抗體進(jìn)行純化，純化后的抗體濃度為0.8 mg·mL-1。SDS-PAGE結(jié)果顯示純化后的抗體在55和25 ku左右出現(xiàn)兩條特異性條帶，與免疫球蛋白分子的重鏈和輕鏈大小一致(圖3B)。

2.4 副豬格拉瑟菌分泌的 OMVs 中可檢測到CdtB

根據(jù)生長曲線，GPS5-SQ菌株在2 h后開始進(jìn)入對數(shù)期，8 h后進(jìn)入平臺(tái)期，對數(shù)生長后期的OD600=1.2～1.4(圖4A)。在細(xì)菌生長的對數(shù)后期離心集菌，經(jīng)透射電子顯微鏡(TEM)觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌周圍存在一些類似囊泡的結(jié)構(gòu)(圖4B)。經(jīng)密度梯度離心獲得純化后的OMVs，SDS-PAGE觀察到蛋白質(zhì)主要集中在第4和第5泳道，即含有35%和40%碘克沙醇的密度層，OMVs的蛋白質(zhì)大小集中在55 ～100 ku(圖4C)。將樣品進(jìn)行TEM觀察，發(fā)現(xiàn)OMVs的粒徑在100～200 nm(圖4D)。納米粒子直徑分析(NTA)結(jié)果顯示，樣品在100～200 nm處的粒子數(shù)目最多(圖4E)。用制備的HbpA、OmpP2、CdtA、CdtB和CdtC多克隆抗體對外膜囊泡及不含外膜囊泡的細(xì)菌上清進(jìn)行Western blot驗(yàn)證，HbpA及OmpP2結(jié)果證明所提取的樣品為外膜囊泡；CDT結(jié)果證明CdtA、CdtB和CdtC在GPS中主要以外膜囊泡的形式存在(圖4F)。經(jīng)Western blot驗(yàn)證，100 μg的OMVs中含有2.5 μg的CdtB(圖4G)。

A. GPS5-SQ生長曲線；B. GPS5-SQ細(xì)胞外的OMVs(箭頭處)的透射電子顯微鏡圖片；C. SDS-PAGE分析OMVs各個(gè)密度梯度的蛋白大小。M. Maker；1～5分別為密度梯度20%、25%、30%、35%和40%的樣品；6. 超速離心后的細(xì)菌上清；7. 超濾濃縮后的細(xì)菌上清(<100 ku)；D. 透射電子顯微鏡觀察OMVs的大小, 箭頭指向OMVs；E. 納米粒子直徑分析粒子數(shù)目；F. 通過蛋白免疫印跡證明CdtB存在于OMVs中而非不含OMVs的上清中；1. 碘克沙醇濃度為35%的OMVs；2. 為碘克沙醇濃度為40%的OMVs；3. 為超速離心后的細(xì)菌上清(濃縮500倍)；4. 超濾濃縮后的上清(<100 ku，濃縮500倍)；G. 蛋白免疫印跡表明100 μg的OMVs中約含有2.5 μg的CdtBA. Growth curve of GPS5-SQ; B. Transmission electron micrographs (ultra-thin slices) image of OMVs (arrow) located at extracellular of GPS5-SQ; C. The protein size of each density gradient of OMVs was analyzed by SDS-PAGE. M. Marker; 1-5.OMVs samples with density gradients of 20%, 25%, 30%, 35% and 40% OptiPrep; 6. Bacterial supernatant after ultracentrifugation. 7.Bacterial supernatant after concentration by ultrafiltration (<100 ku); D. Transmission electron microscope observation of the size of OMVs (arrow); E. Nanoparticle diameter analysis of the number of particles; F. Distribution of CDT in OMVs and OMVs-free supernatants determined by Western blot with antibodies against Omp2 (an OMVs marker), HbpA, and CDT. 1. OMVs with iodixanol concentration of 35%; 2. OMVs with iodixanol concentration of 40%; 3. Bacterial supernatant after ultracentrifugation (concentrated 500 times); 4. Bacterial supernatant after ultrafiltration (concentrated 500 times). G. Western blot showed that 100 μg of OMVs contained approximately 2.5 μg of CdtB圖4 GPS5-SQ分泌的OMVs可檢測到CdtBFig.4 OMVs secreted by GPS5-SQ can carry CdtB

2.5 OMVs 可被STEC吸收

將純化的OMVs與STEC共孵育5 h，由熒光顯微鏡觀察可知，OMVs 可被STEC吸收至細(xì)胞核附近(圖5A)。另外，將純化的OMVs與蛋白酶K一起孵育，驗(yàn)證OMVs 結(jié)構(gòu)保護(hù)蛋白質(zhì)免受蛋白酶降解的能力(圖5B)，結(jié)果顯示向囊泡中加入0.02% SDS對總蛋白質(zhì)含量沒有影響(泳道2)，OMVs單獨(dú)與蛋白酶K(200 μg·mL-1)孵育顯示一些蛋白質(zhì)降解(泳道3)，當(dāng)樣品在SDS存在下與蛋白酶K一起孵育時(shí)，可以觀察到幾乎所有蛋白質(zhì)的降解(泳道4)。

2.6 OMVs和CdtB可誘導(dǎo)STEC凋亡并增加氣管上皮屏障的通透性

單層細(xì)胞跨膜電阻值(TEER值)是評(píng)估細(xì)胞屏障完整性的指標(biāo)[21]。體外構(gòu)建STEC呼吸道上皮屏障模型，待TEER 值趨于穩(wěn)定時(shí)構(gòu)建成功(圖6A)。與對照組相比，CdtB(500 ng·mL-1)與OMVs(20 μg·mL-1)處理細(xì)胞36 h后電阻值顯著降低(圖6B)。

A.體外氣管上皮屏障模型的構(gòu)建；B.CdtB和OMVs在與STEC共孵育36 h時(shí)降低了上皮屏障的 TEER；C.流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡數(shù)目；D.細(xì)胞旁通透性的檢測，其中，“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01，“***”表示P<0.001。下同A. Construction of tracheal epithelial barrier model in vitro; B. CdtB and OMVs reduced the TEER of the epithelial barrier when co-incubated with STEC for 36 h; C. Flow cytometry analysis of the number of apoptotic cells; D. The detect of paracellular permeability, in which * means P<0.05, ** means P<0.01, *** means P<0.001. The same as below圖6 OMVs和CdtB可誘導(dǎo)STEC凋亡并增加氣管上皮屏障的通透性Fig.6 OMVs and CdtB induce STEC apoptosis and increase the permeability of the tracheal epithelial barrier

由流式結(jié)果分析可知(圖6C)，Staurosporine、不同濃度CdtB(50、100、500 ng·mL-1)和20 μg·mL-1OMVs組處理STEC 36 h后細(xì)胞凋亡比例分別為27.36%、9.03%、11.17%、15.69%和13.2%；未處理單獨(dú)細(xì)胞凋亡比例為7.57%。

此外，通過檢測Transwell小室下層的FITC結(jié)合的葡聚糖來分析上皮屏障的完整性。相對于對照組，CdtB與OMVs處理36 h后下室的FD-4量顯著升高(圖6D)。上述結(jié)果表明OMVs和CdtB可誘導(dǎo)STEC凋亡并增加氣管上皮屏障的通透性。

2.7 OMVs和CdtB可誘導(dǎo)STEC凋亡并破壞STEC中的緊密連接

蛋白免疫印跡分析顯示，CdtB和OMVs處理STEC 36 h后cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平顯著增加；TJ ZO-1和Occludin的表達(dá)水平降低，而claudin-1的表達(dá)水平與對照組相比無差異(圖7A、7B)。Caspase3活性檢測結(jié)果表明，與對照組相比，CdtB和OMVs組Caspase3活性均顯著增加，這與LDH測定結(jié)果相符(圖7C、7D)。以上結(jié)果表明，OMVs和CdtB可誘導(dǎo)STEC發(fā)生細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞間ZO-1和Occludin的蛋白表達(dá)水平下降，最終增加氣管上皮屏障的通透性。

A.通過蛋白免疫印跡分析ZO-1、Occludin、claudin-1和cleaved-caspase3的蛋白質(zhì)水平；CT.陰性對照；Sta.陽性對照(Staurosporine, 1 μmol·L-1)；B.蛋白質(zhì)條帶強(qiáng)度由ImageJ軟件量化；C.用Caspase3活性檢測試劑盒檢測凋亡相關(guān)蛋白的活性；D.OMVs或CdtB與STEC孵育6、12、24、36、48 h，通過LDH檢測試劑盒評(píng)估STEC的細(xì)胞毒性。ns代表組間無差異。下同A. The protein levels of ZO-1, occludin, claudin-1 and cleaved caspase3 were analyzed by Western blot; B.The intensity of the protein bands was quantified by ImageJ software. The p values were calculated with one-way ANOVA; C.The activity of apoptosis-related proteins was detected by a Caspase3 activity detection kit; D. OMVs or CdB were incubated with STEC for 6, 12, 24, 36, and 48 hours, and the cytotoxicity of STEC was evaluated by LDH detection kit. ns indicates no significant difference between groups. The same as below圖7 OMVs和CdtB可誘導(dǎo)STEC凋亡并破壞STEC中的緊密連接Fig.7 OMVs and CdtB cause apoptosis and TJ disruption in STEC

2.8 OMVs和CdtB誘導(dǎo)STEC發(fā)生p53依賴的細(xì)胞凋亡

用Pifithrin-α(PFT-α，凋亡p53通路抑制劑，使用濃度為20 μmol·L-1)預(yù)處理后，Pifithrin-α+CdtB組、Pifithrin-α+OMVs組cleaved-caspase3蛋白的表達(dá)水平明顯低于CdtB與OMVs單獨(dú)處理組，與對照組相比，Pifithrin-α+CdtB組與Pifithrin-α+OMVs組ZO-1和Occludin的蛋白表達(dá)水平無差異(圖8)。上述結(jié)果表明，OMVs和CdtB誘導(dǎo)STEC發(fā)生p53依賴的細(xì)胞凋亡，進(jìn)而破壞STEC中的緊密連接。

A.蛋白質(zhì)印跡分析ZO-1、Occludin和cleaved-caspase3的蛋白表達(dá)水平；B.蛋白質(zhì)條帶強(qiáng)度由 ImageJ 軟件量化A. The protein expression levels of ZO-1, Occludin and cleaved-caspase3 were analyzed by Western blot; B.Protein band intensities were quantified by ImageJ software圖8 OMVs和CdtB誘導(dǎo)STEC發(fā)生p53依賴的細(xì)胞凋亡Fig.8 OMVs and CdtB induce p53-dependent apoptosis in STEC

2.9 OMVs通過轉(zhuǎn)運(yùn)CdtB破壞STEC中的緊密連接

用先前制備的CdtB多克隆抗體檢測OMVs(超聲破碎后的)、OMVs-ΔCdtB和IMC-CdtB，Western blot結(jié)果顯示成功從OMVs中分離出CdtB，并獲得OMVs-ΔCdtB和IMC-CdtB(圖9A)。用CdtB、OMVs(超聲破碎后的)和OMVs-ΔCdtB與STEC共孵育36 h，未處理的細(xì)胞作為陰性對照。結(jié)果顯示，與對照組相比，CdtB和OMVs組cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平顯著增加，ZO-1和Occludin的表達(dá)水平降低；而OMVs-ΔCdtB組cleaved-caspase3、ZO-1和Occludin的蛋白表達(dá)水平無差異(圖9B、9C)。以上所有研究結(jié)果表明，OMVs通過轉(zhuǎn)運(yùn)CdtB誘導(dǎo)STEC發(fā)生p53依賴的細(xì)胞凋亡，并破壞STEC中的緊密連接，最終增加氣管上皮屏障的通透性。

A.蛋白免疫印跡分析OMVs、OMVs-ΔCdtB和IMC-CdtB中是否含有CdtA、CdtB和CdtC蛋白；B.蛋白免疫印跡分析cleaved-caspase3、ZO-1和Occludin的蛋白表達(dá)水平；C.蛋白質(zhì)條帶強(qiáng)度由ImageJ軟件量化A.OMVs, OMVs-ΔCdtB and IMC-CdtB were analyzed for the presence of CdtA, CdtB and CdtC proteins by Western blot; B.The protein expression levels of cleaved-caspase3, ZO-1 and occludin were analyzed by Western blot; C.Protein band intensities were quantified by ImageJ software圖9 OMVs通過轉(zhuǎn)運(yùn)CdtB破壞STEC中的緊密連接Fig.9 OMVs cause TJ disruption in STEC by transporting CdtB

3 討 論

副豬格拉瑟菌(Glaesserellaparasuis，GPS)是近年來嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要細(xì)菌性病原，可引起豬的格拉澤氏病[22]。作為一種呼吸道機(jī)會(huì)致病菌，副豬嗜血桿菌必須突破呼吸道上皮屏障進(jìn)入血液才能誘發(fā)系統(tǒng)性感染。細(xì)菌穿透細(xì)胞屏障的3種方式包括直接穿透細(xì)胞、細(xì)胞旁途徑和“特洛伊木馬”形式。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，GPS菌株感染STEC，其侵襲能力較弱，并且可以下調(diào)TJ ZO-1、occludin和claudin-1的表達(dá)水平[23]。因此猜測，GPS菌株是通過細(xì)胞旁途徑破壞STEC中的緊密連接的。

有研究報(bào)道，GPS的CDT蛋白全毒素會(huì)導(dǎo)致豬腎上皮細(xì)胞(porcine kidney cells, PK-15)和豬肺泡巨噬細(xì)胞(pulmonary alveolar macrophage cells, PAMs)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞膨脹和細(xì)胞凋亡，其中細(xì)胞G2阻滯和p53依賴性細(xì)胞凋亡主要是由CdtB引起的[24]，因此本研究從CdtA、CdtB和CdtC中選擇CdtB處理STEC，檢測細(xì)胞凋亡和屏障通透性之間的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，副豬格拉瑟菌分泌的CDT蛋白在GPS培養(yǎng)物中以O(shè)MVs的形式存在，在細(xì)胞上清中未檢出游離的毒素，類似現(xiàn)象在腸致病性大腸桿菌EHEC O157中有相關(guān)報(bào)道，并且EHEC O157 OMVs通過將CdtB毒素依次轉(zhuǎn)運(yùn)至腸上皮細(xì)胞的高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，而后易位至細(xì)胞核，細(xì)胞DNA損傷，引起細(xì)胞周期停滯，最終通過Caspase9途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[25]。

細(xì)胞凋亡主要由3種途徑引起：外源性或死亡受體途徑、內(nèi)源性或線粒體途徑以及顆粒酶依賴性途徑[26]。研究報(bào)道，細(xì)菌分泌的OMVs均通過線粒體途徑引起宿主細(xì)胞凋亡。例如，淋病奈瑟氏菌、幽門螺桿菌、銅綠假單胞菌和尿道致病性大腸桿菌可通過分泌OMVs，通過線粒體途徑引起巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)，GPS OMVs可通過將CdtB毒素轉(zhuǎn)運(yùn)至STEC中引起細(xì)胞發(fā)生p53依賴的細(xì)胞凋亡。p53是一種腫瘤抑制基因，可通過上調(diào)Bax的表達(dá)水平，以及下調(diào)Bcl-2的表達(dá)共同完成促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用[14]。其中Bax可與線粒體上的電壓依賴性離子通道相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞色素c的釋放，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而Bcl-2可阻止細(xì)胞色素c的釋放，具有抗凋亡作用。此外，p53還可通過死亡信號(hào)受體蛋白途徑誘導(dǎo)凋亡。但由于本研究發(fā)現(xiàn)CdtB引起的細(xì)胞凋亡是由OMVs轉(zhuǎn)運(yùn)所引起的，故CdtB可引起線粒體依賴性的細(xì)胞凋亡。

氣管上皮細(xì)胞和細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)是機(jī)體抵抗微生物入侵的重要物理屏障，其中緊密連接(TJs)對于構(gòu)建上皮屏障和維持上皮極性至關(guān)重要[29]。例如豬鏈球菌2型(SS2)與豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)混合感染STEC 48 h，TJ ZO-1蛋白表達(dá)水平顯著降低[30]；研究報(bào)道，牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis)產(chǎn)生的OMVs可以降低人肺上皮細(xì)胞A549的細(xì)胞活力，同時(shí)誘導(dǎo)Caspase3活化和聚ADP-核糖聚合酶(PARP)的切割，引起細(xì)胞凋亡，進(jìn)而破壞緊密連接蛋白claudin-1和occludin完整分布[31]。本研究發(fā)現(xiàn)OMVs及CdtB誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生p53依賴的細(xì)胞凋亡，上皮細(xì)胞凋亡之后，跨上皮阻力顯著降低，構(gòu)成上皮屏障的TJs ZO-1和occludin表達(dá)水平降低，最終導(dǎo)致通透性的增加和上皮屏障的破壞。

4 結(jié) 論

本研究建立了GPS5-SQ的體外感染模型，通過提取GPS OMVs，發(fā)現(xiàn)OMVs與STEC共孵育5 h后可被STEC膜融合內(nèi)化至細(xì)胞核附近。另外，OMVs可以通過轉(zhuǎn)運(yùn)CdtB誘導(dǎo)STEC發(fā)生p53依賴的細(xì)胞凋亡，并下調(diào)STEC中ZO-1、occludin的表達(dá)水平，最終增加氣管上皮屏障的通透性。研究結(jié)果有助于進(jìn)一步闡明副豬格拉瑟菌的致病機(jī)制，可為相關(guān)疫苗的研發(fā)及新型藥物靶標(biāo)的發(fā)掘提供理論依據(jù)，并對研究同類呼吸道病原菌突破氣管上皮屏障的機(jī)制提供參考價(jià)值。