周婉婷，楊 晨，彭翠甜，付新亮，鐘焯華，許丹寧，黃運茂，田允波，劉文俊*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院，廣州 510225； 2.廣東省水禽健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣州 510225；3.廣州市番禺區(qū)畜牧獸醫(yī)站，廣州 511495)

熱應激導致家禽生產(chǎn)性能、采食量和日增重下降，嚴重時可導致動物的死亡[1-3]。肝是重要的新陳代謝器官，調(diào)節(jié)脂質(zhì)和碳水化合物的代謝[4]。肝受外界壓力的影響會破壞整個系統(tǒng)的代謝穩(wěn)態(tài)[5]。研究證實，熱應激會加速脂肪生成并增加肝系統(tǒng)的負擔，顯著增加肝重量和甘油三酯含量[6-8]。研究表明，急性熱應激會導致肝抗氧化酶系統(tǒng)紊亂[3,9-11]，長期熱應激會降低抗氧化酶活性[12-13]。熱應激導致的細胞氧化應激在促進肝細胞凋亡和壞死中發(fā)揮著重要作用。提高肝抗氧化能力、減緩肝細胞的凋亡是緩解家禽養(yǎng)殖過程中熱應激問題的重要研究目標。

白藜蘆醇具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗癌等多種功能，受到廣泛關注[14-18]。在減抗、替抗的趨勢下，白藜蘆醇具有良好的應用前景。白藜蘆醇是一種天然的沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)信號通路激活劑[19]。SIRT1信號通路可直接或間接影響細胞的氧化還原功能，SIRT1的激活可以促使過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α (PGC-1α) 去乙?；痆20]。PGC-1α作為一種細胞內(nèi)重要的核受體轉(zhuǎn)錄輔激活因子，通過激活核呼吸因子1(Nrf1)和結合線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)啟動子，調(diào)節(jié)細胞線粒體生物合成及氧化代謝[21]。研究表明，飼糧中添加白藜蘆醇可以有效改善家禽日增重下降，提高肉品質(zhì)[22]。白藜蘆醇可使促凋亡基因表達量下降，抗凋亡基因表達量上升，繼而緩解細胞凋亡的發(fā)生，同時，白藜蘆醇具有緩解氧化損傷的作用，可提高機體抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的活性，保護腸道健康[22-23]。

本試驗研究了白藜蘆醇對急性熱應激蛋鴨肝中熱休克蛋白70(HSP70)和熱休克蛋白90(HSP90)表達的影響，并進一步檢測了SIRT1信號通路基因的表達水平、血清和肝的抗氧化酶活性及凋亡相關基因的表達水平。本研究結果有助于了解急性熱應激對肝的影響，明確飼糧中添加白藜蘆醇對山麻鴨的作用效果，為白藜蘆醇應用于緩解家禽熱應激問題提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與試驗分組

試驗動物購自廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所，飼養(yǎng)在仲愷教學科研基地。選擇120只健康的60日齡雌性山麻鴨，隨機分為2組，每組60只置于常溫((24±2) ℃)下飼養(yǎng)。對照組(C組)飼喂基礎飼糧，白藜蘆醇組(RES組)飼喂添加400 mg·kg-1白藜蘆醇的試驗飼糧。分開飼喂15 d后，測得C組體重平均值為(1.03±0.04) kg，RES組體重平均值為(1.13±0.04) kg，兩組鴨體重無明顯差異，隨后將兩組鴨隨機分為3組(每組20只)分別放置于39 ℃環(huán)控倉中0、30、60 min。熱應激處理后采集血清樣本，按試驗動物的原則處死后，屠宰，解剖后采集肝組織，-80 ℃保存，用于后續(xù)試驗。

1.2 試驗試劑與儀器

主要試劑：白藜蘆醇購自阿拉丁(R107315)；BCA蛋白濃度測定試劑盒、總抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS快速法)(T-AOC)、總SOD活性檢測試劑盒(WST-8法)(SOD)、過氧化氫酶檢測試劑盒(CAT)、脂質(zhì)氧化檢測試劑盒(MDA)、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(綠色熒光)均購自碧云天；谷胱甘肽過氧化物酶測試盒(GSH-Px)和羥自由基測定試劑盒(AIHR)均購自南京建成有限公司；RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) 均購自TaKaRa；2×RealStar Green Fast Mixture with ROX II購自GenStar；MinuteTM新鮮/冷凍組織胞質(zhì)胞核分離試劑盒、Bcl-2 Rabbit pAb、Caspase-3 Rabbit pAb、Nrf2 Rabbit pAb、Nrf2 Rabbit pAb、PCNA Rabbit pAb、Donkey Anti-Rabbit IgG(H+L)、Donkey Antin-Mouse IgG(H+L)均購自萊恩生物科技有限公司。Bax Rabbit pAb購自萬類生物科技有限公司。

主要儀器：Thermo ScientificTMMultiskanTMFC 酶標儀、QuantStudioTM7 Flex 實時熒光定量 PCR 系統(tǒng)、SorvallTMLegendTMMicro 21R 微量離心機、VeritiTM96 孔熱循環(huán)儀均購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 抗氧化能力和MDA水平檢測

使用血清樣品和肝組織勻漿上清液檢測抗氧化指標T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px、AIHR和MDA。檢測操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4 RNA提取和qRT-PCR分析

采用RNAiso Plus從肝提取總RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。所有引物由生工(北京)合成純化(表1)。反應體積為20 μL：10 μL 2×RealStar Green Fast Mixture with ROX II，上、下游引物各0.4 μL，1 μL的cDNA模板和8.2 μL的DEPC水。使用QuantStudioTM7 Flex 實時熒光定量 PCR 系統(tǒng)進行qRT-PCR檢測。使用β-actin作為內(nèi)參基因，通過2-ΔΔCT法比較組間mRNA相對表達水平。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.5 蛋白表達水平的檢測

提取肝組織的總蛋白，利用MinuteTM新鮮/冷凍組織胞質(zhì)胞核分離試劑盒提取肝組織核蛋白Nrf1及Nrf2，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，SDS變性后，將蛋白上樣于SDS-PAGE膠，進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、ECL試劑盒顯色，并在化學發(fā)光儀中進行曝光，拍照并保存，利用Image J軟件對蛋白條帶進行灰度值分析。

1.6 TUNEL染色觀察肝細胞凋亡

用碧云天生產(chǎn)的免疫染色固定液(P0098)或4%多聚甲醛固定細胞30～60 min；PBS洗滌2次，每次10 min；加入含碧云天生產(chǎn)的免疫染色強力通透液(P0097)，室溫孵育5 min；用PBS清洗后加入TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育60 min；PBS清洗3次，用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism 7.1 (GraphPad Software Inc.， USA)進行統(tǒng)計分析。采用雙因素方差分析。所有試驗數(shù)據(jù)均采用“平均值±標準差(S.E.M.)”進行分析。*表示P<0.05， **表示P<0.01， ***表示P<0.001，差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 白藜蘆醇對熱應激鴨肝HSP70和HSP90 mRNA表達的影響

熱休克蛋白是評價動物熱應激狀態(tài)的重要指標，為了驗證鴨急性熱應激模型的建立和白藜蘆醇在此過程中的作用，本研究用RT-qPCR檢測了肝中HSP70和HSP90 mRNA的表達。如圖1所示，急性熱應激刺激了肝組織中HSP70和HSP90 mRNA的表達。RES組中肝HSP70和HSP90 mRNA的表達水平相較于對照組均有所升高，且在熱應激60 min時，RES組中HSP70和HSP90 mRNA的表達水平相較于對照組具有極顯著的升高(P<0.001)。

A、B.白藜蘆醇對熱休克蛋白HSP70、HSP90基因表達的RT-qPCR結果。*. P<0.05，**. P<0.01，***. P<0.001, n=6，下同A, B. RT-qPCR results of resveratrol on the expression of HSP70 and HSP90 genes. *. P<0.05，**. P<0.01，***. P<0.001, n=6, the same as below圖1 白藜蘆醇對HSP70、HSP90 mRNA的影響Fig.1 Effect of resveratrol on HSP70 and HSP90 mRNA levels

2.2 白藜蘆醇對熱應激鴨肝SIRT1通路相關基因mRNA表達的影響

為明確添加白藜蘆醇是否能活化肝細胞SIRT1途徑，采用RT-qPCR方法檢測了肝中SIRT1通路相關基因mRNA的表達水平。研究發(fā)現(xiàn)，在熱處理時間相同的情況下，RES組的SIRT1、PGC-1α、Nrf1、TFAMmRNA的表達量均高于對照組。熱應激增強了SIRT1、PGC-1α、TFAMmRNA的表達。在熱應激30 min時，RES組中SIRT1 mRNA表達水平顯著高于對照組(P<0.05)，RES組中Nrf1 mRNA極顯著高于對照組(P<0.01)。但是，熒光定量結果顯示，Nrf2 mRNA變化無顯著性差異，在熱應激條件下，RES組較對照組的表達水平低(圖2)。

A、B、C、D、E. 白藜蘆醇對SIRT1、PGC-1α、Nrf1、TFAM、Nrf2基因表達的RT-qPCR結果A, B, C, D, E. RT-PCR results of resveratrol on SIRT1, PGC-1α, Nrf1, TFAM, Nrf2 genes expression圖2 白藜蘆醇對SIRT1通路相關基因mRNA的影響Fig.2 Effect of resveratrol on related genes mRNA in SIRT1 pathway

2.3 白藜蘆醇對Nrf1、Nrf2核蛋白表達的影響

Nrf1、Nrf2活化后，進入細胞核促進一系列基因的轉(zhuǎn)錄。為了進一步確認通路的活化，提取了核蛋白，并通過Western blot檢測了Nrf1、Nrf2的核蛋白水平。如圖3所示，以PCNA為內(nèi)參蛋白，在熱應激60 min條件下，RES組的Nrf1核蛋白水平顯著高于對照組，RES組的Nrf2核蛋白水平極顯著高于對照組。

A.白藜蘆醇對Nrf2、Nrf1蛋白表達的Western blot結果；B、C.白藜蘆醇對NRF2、NRF1蛋白表達影響的分析結果A．Western blot results of resveratrol on the Nrf2 and Nrf1 proteins expression；B, C. Effect of resveratrol on the expression of Nrf2 and Nrf1 proteins圖3 白藜蘆醇對Nrf1、Nrf2核蛋白表達的影響Fig.3 Effects of resveratrol on the expression of Nrf1 and Nrf2 nuclear proteins

2.4 白藜蘆醇對熱應激鴨血清抗氧化能力的影響

血清抗氧化酶活性是判斷白藜蘆醇對鴨抗氧化能力影響的重要指標，使用ELISA檢測了血清中抗氧化酶活性和MDA的含量。研究結果發(fā)現(xiàn)，熱應激增加了血清中T-AOC；同一熱應激條件下，RES組T-AOC、SOD酶活性、AIHR均高于對照組；熱應激60 min時，RES組SOD酶活性、CAT酶活性、AIHR顯著高于對照組；對照組和RES組的GSH-Px酶活性在熱應激條件下并無顯著變化；急性熱應激會造成對照組MDA含量增加，但同一熱應激條件下，RES組MDA含量比對照組低，特別是熱應激60 min RES組MDA含量顯著低于對照組(圖4)。

A.血清中的總抗氧化能力；B.血清中的超氧化物歧化酶活性；C.血清中過氧化氫酶活性；D.血清中谷胱氨肽過氧化物酶活性；E.血清中抑制羥自由基能力；F.血清中丙二醛含量A． The T-AOC level in serum；B. The SOD activity in serum；C. The CAT activity in serum；D. The GSH-Px activity in serum； E. The AIHR activity in serum；F. The MDA content in serum圖4 白藜蘆醇對不同時長急性熱應激血清氧化指標的影響Fig.4 Effect of resveratrol on serum oxidative indices under different duration of acute heat stress

2.5 白藜蘆醇對熱應激鴨肝抗氧化能力的影響

為了進一步探究白藜蘆醇對鴨肝抗氧化能力的影響，檢測了肝勻漿的抗氧化酶活性和MDA含量。結果如圖5所示，熱應激會降低對照組肝中T-AOC含量和CAT酶活性。SOD的活性在熱應激 30 min有所增加，但在熱應激 60 min時降低。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以提高肝GSH-Px酶活性。在熱應激30 min時，白藜蘆醇顯著提高了AIHR。此外，相比對照組，RES組T-AOC、CAT的水平在熱應激狀態(tài)下恢復更為迅速。急性熱應激條件下，白藜蘆醇降低了鴨肝中MDA的含量。

A.肝中的總抗氧化能力；B.肝中的超氧化物歧化酶活性；C.肝中過氧化氫酶活性；D.肝中谷胱氨肽過氧化物酶活性；E.肝中抑制羥自由基能力；F.肝中丙二醛含量A. The T-AOC level in the liver；B. The SOD activity in the liver；C. The CAT activity in the liver；D. The GSH-Px activity in the liver； E. The AIHR activity in the liver；F. The MDA content in the liver圖5 白藜蘆醇對急性熱應激肝氧化指標的影響Fig.5 Effect of resveratrol on liver oxidative indices under different duration of acute heat stress

2.6 白藜蘆醇對熱應激條件下蛋鴨肝細胞凋亡的影響

為了驗證白藜蘆醇在急性熱應激條件下緩解肝細胞凋亡的作用，采用TUNEL法檢測肝細胞凋亡的情況。如圖6所示，在對照組中，急性熱應激組較無熱應激組肝細胞凋亡數(shù)有極顯著增加；在急性熱應激條件下，與對照組相比，白藜蘆醇組的肝細胞凋亡數(shù)極顯著下降。

A.肝細胞TUNEL檢測結果(50 μm),綠色熒光表示細胞凋亡，藍色熒光表示正常細胞;B.TUNEL染色細胞與正常細胞比例A. Liver cell TUNEL assay results(50 μm), green fluorescence indicates cell apoptosis, blue fluorescence indicates normal cells; B. Proportion of TUNEL-stained cells to normal cells圖6 白藜蘆醇對熱應激誘導的肝細胞凋亡的影響Fig.6 Effect of resveratrol on hepatocyte apoptosis induced by heat stress

2.7 白藜蘆醇對蛋鴨肝細胞凋亡相關基因mRNA表達的影響

為進一步探究急性熱應激及白藜蘆醇對肝細胞凋亡的影響，采用RT-qPCR檢測了肝中Bcl-2、Bax、Caspase3、Bak1、Cytc、Bax/Bcl-2mRNA的表達。如圖7所示，熱應激促進了Caspase-3的mRNA的表達；在同一熱應激條件下，RES組的Bax、Bak1和Bax/Bcl-2的mRNA的表達量低于對照組；在急性熱應激條件下，RES組Bcl-2和Caspase3 mRNA的表達量高于對照組。

A、B、C、D、E. 白藜蘆醇對凋亡相關基因表達的RT-qPCR結果; F. 白藜蘆醇對Bax/Bcl-2基因表達的影響A, B, C, D, E. RT-qPCR results of resveratrol on the expression of apoptosis related genes; F. Effect of resveratrol on Bax/Bcl-2 gene expression圖7 白藜蘆醇對肝細胞凋亡相關基因mRNA表達的影響Fig.7 Effect of resveratrol on mRNA expression of apoptosis related genes in hepatocytes

2.8 白藜蘆醇對熱應激蛋鴨肝細胞凋亡相關蛋白表達的影響

本研究用Western blot檢測了肝組織細胞凋亡相關蛋白的表達量。如圖8所示，同一熱應激條件下，RES組Bax、Caspase3、Bax/Bcl-2的蛋白表達量均低于對照組；熱應激30及60 min條件下，RES組Bcl-2蛋白表達量高于對照組。

A. 白藜蘆醇對Bax、Bcl-2、caspase3 蛋白表達的Western blot 結果；B、C、D.白藜蘆醇對Bcl-2、Bax、caspase3蛋白表達的影響；E. 白藜蘆醇對Bax/Bcl-2 蛋白表達的影響A．Western blot results of resveratrol on the Bax, Bcl-2 and caspase3 proteins expression；B, C, D. Effect of resveratrol on the expression of Bcl-2, Bax and caspase3 proteins; E. Effect of resveratrol on Bax/bcl-2 protein expression圖8 白藜蘆醇對熱應激蛋鴨肝細胞凋亡相關蛋白表達的影響Fig.8 Effect of resveratrol on the expression of apoptosis related proteins in heat stressed duck hepatocytes

3 討 論

熱應激造成細胞氧化應激導致組織損傷，致使家禽生產(chǎn)性能下降[24-29]。白藜蘆醇具有極強的抗氧化和抗炎能力，是具有潛力的抗熱應激藥物。本試驗以雌性山麻鴨為研究對象，旨在揭示白藜蘆醇對鴨急性熱應激狀態(tài)下抗氧化能力及抗細胞凋亡的影響和調(diào)控機制，為白藜蘆醇緩解家禽熱應激的應用提供理論依據(jù)。

熱休克蛋白是熱應激的關鍵指標，并在緩解壓力中起重要作用[30]。HSP70和HSP90是重要的分子伴侶，前者在蛋白穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，后者參與促進幾種受體和激酶的成熟[31]。白藜蘆醇顯著增加了HSP70和HSP90 mRNA的表達[12]，這提示白藜蘆醇可能通過誘導HSPs的表達保護家禽因急性熱應激引起的肝損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇顯著升高了急性熱應激下肝中SIRT1、PGC-1α、Nrf1和TFAMmRNA的表達水平，也顯著升高了Nrf1、Nrf2的核蛋白水平。白藜蘆醇被認為是SIRT1的天然化學激活劑。有研究表明，白藜蘆醇可以提高家禽腎SIRT1、PGC-1α、Nrf1和TFAM的表達，調(diào)節(jié)和保護線粒體功能[32]。TFAM的表達可以增加在抗氧化機制中至關重要的mtDNA[33]。此外，SIRT1具有調(diào)控HSF1的作用，研究發(fā)現(xiàn)抑制SIRT1還可以降低HSP70和HSP90的表達[34]。這些結果說明，白藜蘆醇可以通過促使SIRT1通路活化增強肝抗氧化能力，緩解熱應激導致的氧化應激。

家禽暴露在高溫環(huán)境會導致線粒體損傷產(chǎn)生過量活性氧，引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA氧化損傷，導致氧化應激破壞細胞穩(wěn)態(tài)[9,35-36]。肝是家禽氧化代謝和脂肪合成的重要器官[1-8]。SOD、CAT和GSH-Px是重要的抗氧化系統(tǒng)，它們可以將自由基和過氧化氫最終分解為水和分子氧[37-38]。本研究發(fā)現(xiàn)，急性熱應激可以造成血清T-AOC、GSH-Px活性增加和和肝T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px活性降低。MDA含量在受到熱應激后均增加。這說明急性熱應激會破壞自由基和過氧化氫產(chǎn)生和清除間的平衡。有趣的是，白藜蘆醇可以有效改善熱應激導致的家禽氧化應激，提高T-AOC、GSH-Px、CAT和AIHR，并降低MDA[9,22-25,30-35,39]。有研究表明，白藜蘆醇可以上調(diào)HO-1表達，激活Nrf-2，從而減輕心肌缺血再灌注和缺氧缺血性腦損傷引起的氧化應激和炎癥[40]。因此，將白藜蘆醇作為飼料添加劑具有顯著的抗氧化效果。

內(nèi)源性細胞凋亡的過程是由Bax等線粒體蛋白介導的，有研究表明，Bax/Bcl-2兩蛋白的比例決定了細胞凋亡的強弱[39,41]，本研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加白藜蘆醇會使Bax/Bcl-2蛋白的表達量下降，同時也會使促凋亡蛋白Bak1、Cytc、Caspase3 mRNA的表達量有所減少，這表明白藜蘆醇對熱應激條件下的肝細胞具有一定的保護作用。

4 結 論

綜上所述，急性熱應激對山麻鴨肝的氧化-抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生負面影響，引起氧化應激。飼糧中添加400 mg·kg-1白藜蘆醇可以通過上調(diào)HSP70和HSP90 mRNA，激活SIRT1信號通路，減少促凋亡基因，增加抗凋亡基因表達，增強肝的抗氧化及抗細胞凋亡的能力。研究結果說明，白藜蘆醇可以提高鴨肝的抗氧化能力和抗細胞凋亡的能力，有效改善急性熱應激條件下鴨肝的氧化損傷。