姜 輝，楊 慧，方紹明，高 軍，陳從英

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)省部共建豬遺傳改良與養(yǎng)殖技術(shù)國家重點實驗室，南昌 330045)

采食是機(jī)體獲取營養(yǎng)物質(zhì)的重要行為模式[1]，而饑餓與飽腹感的交替支配則是調(diào)控動物采食行為的內(nèi)在機(jī)制[2]。采食行為主要包括兩個階段：食欲階段(如覓食等)和反射行為完成階段(如吞咽等)[3]。食欲控制可分為兩種模式：一種與宿主能量穩(wěn)態(tài)有關(guān)；另一種模式是基于細(xì)菌與宿主的交流。腸道微生物不僅可以通過調(diào)控宿主能量平衡來調(diào)節(jié)自身生長并維持其在腸道內(nèi)的種群數(shù)量[2]，還可以通過“腦-腸軸”對宿主行為進(jìn)行干預(yù)。腸道微生物通過降解膳食纖維等難以被宿主消化吸收的物質(zhì)，釋放信號肽等代謝產(chǎn)物并作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而實現(xiàn)對宿主食欲的調(diào)節(jié)[4]。因此，腸道微生物在大腦與腸道之間的雙向交流中發(fā)揮重要作用[2, 4-5]，影響宿主的采食行為。隨著相關(guān)研究的不斷深入，將為通過腸道微生物調(diào)控宿主能量攝入與平衡提供新策略。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物在宿主采食行為的調(diào)節(jié)中起重要作用。Li等[6]通過比較不同分組的奶牛群體腸道微生物組成，發(fā)現(xiàn)高采食組的擬桿菌門(Bacteroidetes)與厚壁菌門(Firmicutes)的比例顯著低于中低采食組。當(dāng)腸道微生物代謝途徑發(fā)生改變，代謝產(chǎn)物(信號分子)直接或間接(前體物質(zhì))介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)而改變宿主食欲[7-10]。Breton等[11]發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)誘導(dǎo)后產(chǎn)生的細(xì)菌蛋白質(zhì)可通過激活大腦的飽腹感影響宿主食欲。Yang等[12]研究表明，以普氏菌屬(Prevotella)為腸型的杜洛克豬平均日采食量(average daily feed intake, ADFI)要高于密螺旋體(Treponema)腸型。研究發(fā)現(xiàn)，腸道部分微生物產(chǎn)生的短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs)不僅能為腸上皮細(xì)胞提供能量，維持穩(wěn)態(tài)[13]，而且可以刺激腸道內(nèi)分泌L細(xì)胞釋放飽感激素(如PYY、GLP-1等)[14]，最終降低宿主食欲。此外，革蘭陰性菌和革蘭陽性菌都可以產(chǎn)生大量的細(xì)胞間信號分子——吲哚[15]，吲哚可以通過調(diào)節(jié)胃腸道激素的分泌而影響宿主食欲和代謝過程[16]。然而，豬腸道中哪些微生物種類能調(diào)節(jié)宿主采食行為目前還知之甚少，有待深入研究。

1 材料與方法

1.1 試驗豬飼養(yǎng)與表型測定

本研究選取210頭未經(jīng)藥物治療的健康商業(yè)杜洛克豬作為研究材料，其中包含72頭母豬和138頭公豬。試驗豬群體采用相同的飼養(yǎng)和管理方式并在28日齡斷奶。當(dāng)仔豬體重達(dá)到30 kg后轉(zhuǎn)移到配備奧斯本自動投喂器(美國)的育肥舍進(jìn)行飼養(yǎng)并飼喂相同的商業(yè)配方飼料。飼料以玉米、豆粕、大豆油、賴氨酸和磷酸氫鈣為主，其中營養(yǎng)水平為：粗蛋白15%、粗脂肪1.5%、粗纖維5%、粗灰分6%、賴氨酸0.8%、鈣0.9%、磷0.5%、鹽0.3%。飼料和水可自由獲取。使用奧斯本自動投喂器記錄測定期間試驗豬(30～100 kg(90～170日齡))的日采食量、日增重、日采食時間、日采食次數(shù)等表型，并進(jìn)一步計算平均日采食時間(average daily eating time，ADET)、平均日采食次數(shù)(average daily eating visits，ADEV)、平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)，剩余采食量(residual feed intake，RFI)[17]，平均日增重(average daily gain，ADG)等表型值。采用B超儀測定試驗豬的背膘厚(backfat，BF)。

1.2 糞便樣品的采集與16S rRNA基因測序

分兩個批次(2017年3月20日與4月20日)采集140日齡左右試驗豬糞便樣本。從肛門處采集新鮮糞便樣品放入1.5 mL無菌離心管中，隨后迅速浸入液氮并于-80 ℃冰箱保存。使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit(Qiagen, Germany)進(jìn)行糞便DNA提取[18]。用Nanodrop 1000超微量分光光度計測定DNA樣品的濃度和純度，并使用0.8%瓊脂凝膠電泳進(jìn)行DNA質(zhì)量檢測。按照1∶10的比例將DNA樣品進(jìn)行稀釋，取1 μL稀釋后的DNA樣品用于PCR擴(kuò)增。本研究選用細(xì)菌通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對16S rRNA基因的V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增[19-20]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化操作流程利用純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建雙端測序文庫，使用MiSeq測序平臺(Illumina，USA)進(jìn)行測序。

1.3 16S rRNA基因測序數(shù)據(jù)處理

使用Trimmomatic(V.0.39)軟件對原始測序數(shù)據(jù)中的引物和標(biāo)簽序列進(jìn)行過濾[21]，采用FLASH(v.1.2.11)合并雙端配對的clean reads得到tags[22]，利用USEARCH(v.7.0.1090)軟件去除嵌合序列[23]。為消除不同測序深度對分析結(jié)果的影響，將每個樣本得到的拼接序列抽平至16 000個tags。用VSEARCH軟件(v.2.8.1)依據(jù)97%的序列相似度將獲得的tags聚類成可操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)[24]。利用RDP classifer(v2.2)對每條基因序列進(jìn)行物種注釋[25]，并使用MOTHUR(v1.31.2)軟件計算腸道微生物的alpha多樣性[26]。基于16S rRNA基因測序數(shù)據(jù)，通過PICRUSt(v1.0.0)軟件對腸道微生物潛在功能進(jìn)行預(yù)測，并依據(jù)16S rRNA基因序列，計算Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路的相對豐度[27]。

1.4 OTU共豐度組(co-abundance groups，CAGs)分析

將相對豐度高于1×10-4，至少在20%個體中出現(xiàn)的共計748個OTUs用于后續(xù)分析。首先，基于SparCC算法[28]計算OTU之間的相關(guān)性并將其轉(zhuǎn)換為相關(guān)性距離矩陣。利用R包中hclust功能(ward.D2算法)[29]將距離矩陣進(jìn)行聚類，采用多因素方差分析(PerMANOVA)對CAGs彼此間的差異性 (P<0.05) 進(jìn)行置換檢驗[30]。最后，使用Cytoscape(version 3.7.1)對權(quán)重值大于0.5的OTUs進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化展示[31]。使用R包中的corr.test函數(shù)計算每個CAG與表型ADFI值之間的Spearman相關(guān)性系數(shù)[17]。

1.5 使用Two-part模型分析腸道菌群與采食行為表型值的相關(guān)性

使用R(4.0.0)軟件psych包中的corr.test函數(shù)基于Spearman相關(guān)性檢驗分析表型之間的相關(guān)性[32]。為探索腸道微生物與宿主采食行為之間的相關(guān)性，采用Two-part模型對過濾后的OTUs與各表型值進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析[33]。該模型的優(yōu)勢在于同時考慮了二元模型與數(shù)量模型，克服了微生物數(shù)據(jù)非正態(tài)分布的難題。二元模型用于檢測腸道微生物存在與否對表型值的影響，表達(dá)公式為：y=β1b+e，y為經(jīng)過相應(yīng)性別、批次校正后的表型值，β1表示二元模型的估計效應(yīng)，b代表二元特征(0/1)，e是殘差；數(shù)量模型則解釋了微生物的豐度對表型值的影響，表達(dá)公式為y=β2q+e，y為經(jīng)過相應(yīng)性別、批次校正后的表型值，β2表示數(shù)量模型的估計效應(yīng)，q代表數(shù)量特征(相對豐度)，e是殘差。隨后使用未加權(quán)Z方法整合二元模型與數(shù)量模型結(jié)果執(zhí)行薈萃分析并獲得metaP值。最終P值為二元分析、數(shù)量分析以及薈萃分析所得P值的最小值，Z值是基于Z分布計算而來。該模型還采用了1 000次排列檢驗的方法將錯誤值(false discovery rate，F(xiàn)DR)控制在0.05水平。

1.6 采用LEfSe方法鑒定采食行為表型極端個體間的差異OTU

分別挑選ADFI值最高和最低各10個個體，使用在線(https://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)線性判別分析效應(yīng)大小(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)軟件分析兩組極端個體間差異的OTU，將linear discriminant analysis(LDA)差異顯著性閾值設(shè)定為2.5。

1.7 豬采食行為相關(guān)的潛在腸道菌群功能通路與表型值顯著關(guān)聯(lián)的OTUs之間的相關(guān)性分析

采用Spearman相關(guān)性分析鑒定與ADFI表型值顯著相關(guān)的KEGG代謝通路，并將顯著關(guān)聯(lián)的功能通路與上述Two-part模型分析發(fā)現(xiàn)的與ADFI表型值顯著相關(guān)的25個OTUs進(jìn)行Spearman關(guān)聯(lián)分析。使用R包pheatmap(version 1.0.12)繪制相關(guān)性熱圖[34]。

2 結(jié) 果

2.1 試驗豬群體采食行為各表型間相關(guān)性

2.1.1 試驗豬群體采食行為表型值分布概況 本研究以210頭商業(yè)杜洛克豬為對象測定的ADET值(min·d-1)和ADFI值(kg·d-1)均符合正態(tài)分布，平均值用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，分別為3 891.87±566.79和2.22±0.20(圖1A、1C)，而ADEV值(次·d-1)不符合正態(tài)分布，平均值為6.22±2.16(圖1B)。

A. ADET表型分布；B. ADEV表型分布；C. ADFI表型分布；D. 縱坐標(biāo)表示表型間的相關(guān)性系數(shù)，紅色為正相關(guān)，藍(lán)色為負(fù)相關(guān)A. Phenotype distribution of ADET; B. Phenotype distribution of ADEV; C. Phenotype distribution of ADFI; D. The Y-axis represents the correlation coefficients between phenotypes. Red is positive correlation, blue is negative correlation圖1 210頭試驗豬采食行為相關(guān)表型值的分布及表型間的Spearman相關(guān)性分析Fig.1 Distribution of phenotypic values related to feeding behaviors in 210 experimental pigs and the correlation between phenotypes by spearman correlation analysis

2.1.2 采食行為各表型間及其與平均日增重、剩余采食量、背膘厚間的相關(guān)性分析結(jié)果 試驗豬群體各采食行為表型間(ADET、ADEV、ADFI)及其與ADG、RFI、BF之間的斯皮爾曼相關(guān)性分析結(jié)果(圖1D)表明，ADET分別與ADEV(r=0.41，P<0.05)、RFI(r=0.32，P<0.05)呈顯著正相關(guān)，ADFI分別與ADG(r=0.63，P<0.05)、RFI(r=0.56，P<0.05)呈顯著正相關(guān)，另外，RFI與BF顯著正相關(guān)(r=0.16，P<0.05)，然而ADFI與ADET、ADEV以及BF之間無顯著相關(guān)性。

2.2 不同分類水平上試驗豬的腸道微生物組成概況

2.2.1 16S rRNA基因測序結(jié)果 將收集到的210份試驗豬糞便微生物DNA樣品全部進(jìn)行16S rRNA基因測序。獲得的原始測序數(shù)據(jù)上傳至中國國家基因庫(China National Gene Bank)，序列號為CNP0000828。質(zhì)控后，每個樣品平均可得到34 411個高質(zhì)量tags，按照97%的序列相似性聚類后，平均每個樣本可以獲得874個OTUs。OTU注釋結(jié)果顯示，檢測到的腸道微生物共涉及19個門、70個科和94個屬。α多樣性結(jié)果如圖2所示(數(shù)據(jù)表示為“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”)，Ace指數(shù)為986.393±84.212，Chao指數(shù)為1002.035±85.918，Shannon指數(shù)為5.131±0.289，Simpson指數(shù)為0.017±0.009(表1)。

圖2 試驗豬群體腸道微生物α多樣性Fig.2 Alpha-diversity of gut microbiota in experimental pig population

表1 試驗豬群體腸道微生物α-多樣性指數(shù)Table1 Alpha-diversity index of gut microbiota in experimental pig population

2.2.2 不同分類水平下腸道微生物組成概況 試驗豬腸道微生物中豐度最高的門依次是厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)。在科水平上，豐度最高的科分別是瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)和毛螺菌科(Lachnospiraceae)。而在屬水平上，豐度最高的是普氏菌屬(Prevotella)、顫螺旋菌屬(Oscillospira)和乳酸桿菌屬(Lactobacillus)(圖3)。

圖3 基于16S rRNA測序的門水平(A)、科水平(B)和屬水平(C)上腸道微生物的組成Fig.3 The composition of gut microbiota at phylum level(A), family level(B) and genus level(C) base on 16S rRNA gene sequencing

2.3 CAGs分析結(jié)果

基于SparCC方法將過濾后的748個OTUs聚類成9個CAGs(圖4A)。每個CAG內(nèi)的OTU彼此之間均為正相關(guān)，而不同的CAG中的OTU彼此之間則呈負(fù)相關(guān)。在9個CAG中，發(fā)現(xiàn)CAG2、CAG9與采食行為表型中的ADFI顯著相關(guān)(P<0.05)。

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果表明CAG2與ADFI值呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05，圖4B)，該CAG中包含118個OTUs，這些OTUs主要注釋到擬桿菌目(Bacteroidales)、瘤胃球菌科和顫螺菌屬等(圖4A)。CAG9與表型呈顯著正相關(guān)(P<0.05，圖4B)，該CAG中包含70個OTUs，其中有5個OTUs可以注釋到物種水平，分別是柔嫩梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii)、兩形真桿菌(Eubacteriumbiforme)和Asteroleplasmaanaerobium(圖4A)。然而并未發(fā)現(xiàn)與其他采食行為表型相關(guān)的CAG。

圖4 CAGs分析結(jié)果可視化展示(權(quán)重值>0.5)Fig.4 Visual display of CAGs analysis results (weight>0.5)

2.4 與豬采食行為相關(guān)的腸道微生物種類

2.4.1 協(xié)變量對表型值的影響 Wilcoxon秩檢驗分析結(jié)果表明，在本研究群體中，性別、批次對ADET值均具有顯著影響(P<0.05)，只有批次會對ADEV值產(chǎn)生顯著性影響(P<0.05)，而性別、批次對ADFI值均無顯著性影響(P>0.05)，無需進(jìn)行任何校正(圖5)。針對ADET值，將性別、批次作為因子變量納入線性混合模型后，經(jīng)過999次置換檢驗，發(fā)現(xiàn)兩者均會對表型產(chǎn)生顯著性影響(P值分別為0.013和0.018)。同樣地，對于ADEV值，只有批次會對表型值產(chǎn)生顯著性影響(P=0.001)，而性別則無顯著性影響(P=0.069)。而對于ADFI值，性別、批次均不會對表型值產(chǎn)生顯著性影響(P值分別為0.337和0.768)。與Wilcoxon秩檢驗分析結(jié)果相一致，驗證了數(shù)據(jù)分析的可靠性。

**、****表示差異顯著(P<0.05)；ns表示差異不顯著**，**** mean significant different (P<0.05); ns means not significant different圖5 基于Wilcoxon秩檢驗分析性別、批次對表型值的影響Fig.5 Effects of sex and batch on phenotypic values based on Wilcoxon rank test

2.4.2 與ADET相關(guān)的腸道菌群種類 采用Two-Part模型分析試驗豬各表型值與腸道微生物種類的相關(guān)性，F(xiàn)DR<0.05時，未鑒定到任何與采食行為顯著相關(guān)的OTU，但在P<0.01時，一共有14個OTUs與ADET呈現(xiàn)相關(guān)性，其中有7個OTUs與ADET呈正相關(guān)，剩余的7個OTUs則與ADET呈負(fù)相關(guān)(P<0.01，圖6A、表2)。這14個OTUs中注釋到門水平1個，目水平有3個，科水平有8個，屬水平有2個。

表2 與ADET表型值關(guān)聯(lián)的OTUs(P<0.01)Table 2 OTUs associated with the phenotypic values of ADET (P<0.01)

2.4.3 與ADEV相關(guān)的腸道菌群種類 從OTU與ADEV相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：一共有21個OTUs與ADEV呈現(xiàn)出相關(guān)性趨勢，其中有13個OTUs與ADEV正相關(guān)，另8個OTUs與ADEV呈負(fù)相關(guān)(P<0.01，圖6B，表3)。在這21個OTUs中可以注釋到目水平的有6個，科水平的有9個，屬水平的有5個，剩下的1個OTU被注釋為生黃瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)。

表3 與ADEV表型值關(guān)聯(lián)的OTUs(P<0.01)Table 3 OTUs associated with the phenotypic values of ADEV (P<0.01)

扇形面積表示Z值絕對值，紅色為正值，藍(lán)色為負(fù)值The sector area represents the absolute value of the Z-score, with positive values in red and negative values in blue圖6 與采食行為具有相關(guān)性趨勢的OTUsFig.6 OTUs showed trends of correlation with feeding behaviors

2.4.4 與ADFI相關(guān)的腸道菌群種類 共檢測到25個OTUs與ADFI具有相關(guān)性趨勢，其中21個OTUs與ADFI正相關(guān)，剩下的4個OTUs與ADFI呈負(fù)相關(guān)(P<0.01，圖6C，表4)。在這21個OTUs中，有5個被注釋到瘤胃菌科，有3個注釋到梭菌目(Clostridiales)，有2個注釋到RFP12， 2個注釋到普氏菌屬，其余9個分別被注釋到布氏瘤胃球菌(Ruminococcusbromii)、Prevotellacopri、Mucispirillumschaedleri、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、顫螺菌屬、厭氧支原體屬(Anaeroplasma)、RF32、毛螺菌科和韋榮球菌科(Erysipelotrichaceae)。與ADFI呈負(fù)相關(guān)的4個OTUs分別注釋到毛螺菌科、伯克氏菌目(Burkholderiales)、瘤胃菌科和YRC22。

表4 與ADFI表型值相關(guān)的OTUs(P<0.01)Table 4 OTUs associated with the phenotypic values of ADFI (P<0.01)

2.5 ADFI表型極端個體間顯著差異的OTUs

選擇ADFI表型極端個體，采用LEfSe方法鑒定High_ADFI與Low_ADFI組間具有顯著差異的OTUs。將LDA顯著性閾值設(shè)定為2.5時，High_ADFI組共富集10個OTUs，其中2個注釋到普氏菌屬，2個注釋到瘤胃球菌科，2個注釋到擬桿菌目，其余4個分別被注釋到毛螺菌科、梭菌目、CF231和S24-7。Low_ADFI組共富集14個OTUs，3個被注釋到克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)，其余11個OTUs分別注釋到Mogibacteriaceae、伯克氏菌目、R4-45B、普氏菌屬、YRC22、擬桿菌目、RFN20、密螺旋體科、Sphaerochaeta、瘤胃球菌屬和瘤胃球菌科(圖7)。

圖7 高低ADFI極端個體中顯著差異的OTUs(LDA>2.5)Fig.7 OTUs showing significantly different abundances between high and low ADFI pigs (LDA score>2.5)

2.6 與采食行為相關(guān)的腸道微生物功能

2.6.1 與ADFI值顯著關(guān)聯(lián)的腸道微生物功能通路 通過Spearman相關(guān)性分析，當(dāng)P<0.05時，鑒定到鞘脂代謝(Sphingolipid metabolism)，糖胺聚糖降解(Glycosaminoglycan degradation)，其他聚糖降解(Other glycan degradation)等6個功能通路與ADFI表型值呈顯著負(fù)相關(guān)。而胰島素信號通路(Insulin signaling pathway)和脂質(zhì)代謝(Lipid metabolism)等14個功能通路則與ADFI值呈顯著正相關(guān)(表5)。

表5 ADFI表型值與微生物功能通路之間的相關(guān)性分析結(jié)果Table 5 The correlation between ADFI phenotypic values and predicted function pathways

2.6.2 ADFI相關(guān)的微生物功能通路與ADFI相關(guān)的OTUs之間的關(guān)聯(lián)性 如圖8所示，與試驗豬ADFI呈負(fù)相關(guān)的4個OTUs(毛螺菌科、伯克氏菌目、瘤胃菌科和YRC22)(圖6C)與溶酶體(Lysosome)和/或鞘脂代謝功能通路顯著正相關(guān)(P<0.05)，而這些功能通路均與ADFI值負(fù)相關(guān)(P<0.05，表5)。其余21個與ADFI值正相關(guān)的OTUs(圖6C)，與胰島素信號通路等促進(jìn)試驗豬ADFI的功能通路整體呈顯著正相關(guān)(P<0.05，表5)，而與那些抑制豬ADFI的功能通路呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05，表5)。

*、**、***表示顯著相關(guān)(P<0.05)*,**,*** mean significantly correlated (P<0.05)圖8 與ADFI值相關(guān)的代謝通路和OTUs之間的相關(guān)性分析Fig.8 The correlations between ADFI-associated predicted functional pathways and ADFI-associated OTUs

3 討 論

本研究相關(guān)性分析表明，ADFI分別與ADG、RFI存在顯著的正相關(guān)性，表明豬采食量的增加可以促進(jìn)其生長發(fā)育，但是有降低飼料效率的風(fēng)險。ADET和ADEV之間也呈顯著正相關(guān)關(guān)系，但二者均與ADFI之間不存在顯著關(guān)聯(lián)，這種情況最合理的解釋可能是豬活動過程中誤觸了自動飼喂器但并沒有真正進(jìn)食，使得豬真正的采食時間和采食次數(shù)記錄不夠準(zhǔn)確。

本試驗中，豬的腸道微生物主要是由厚壁菌門、擬桿菌門和變形桿菌門等構(gòu)成，與之前的研究結(jié)果類似[35-36]。Spring等[37]研究結(jié)果表明，瘤胃球菌科、普雷沃氏菌科和毛螺菌科是各飼糧組豬糞便中的優(yōu)勢菌群。多項研究發(fā)現(xiàn)，普氏菌屬、顫螺菌屬以及乳酸桿菌屬通常是豬的核心菌屬[38-39]，說明了本研究中16S rRNA測序結(jié)果的可靠性。

CAGs分析中，鑒定到與ADFI負(fù)相關(guān)的微生物主要是瘤胃球菌科、擬桿菌目以及顫螺菌屬。多項研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌目具有碳水化合物降解活性，能夠發(fā)酵多種植物多糖，從而產(chǎn)生乙酸等SCFAs[40-41]。同樣地，難以被內(nèi)源性酶消化的纖維素等物質(zhì)被部分瘤胃球菌科細(xì)菌酵解時可產(chǎn)生SCFAs，而SCFAs不僅有助于機(jī)體維持穩(wěn)態(tài)[42]，還能夠刺激腸內(nèi)分泌L細(xì)胞釋放飽感激素PYY(peptide YY)和GLP-1(glucagon-like peptide 1)[14]，從而抑制宿主采食。另外，一些顫螺菌屬可能是丁酸產(chǎn)生菌[43-44]，能夠在抑制食欲方面發(fā)揮重要作用[45]。分析發(fā)現(xiàn)，與ADFI正相關(guān)的CAG9中有4個OTUs可以注釋到物種水平，除之前研究發(fā)現(xiàn)的柔嫩梭菌外[12]，本研究還鑒定到韋榮球菌科中的兩形真桿菌和Asteroleplasmaanaerobium具有增加宿主采食量的潛能。韋榮球菌科往往與肥胖相關(guān)[46]，有趣的是，表型相關(guān)性分析結(jié)果表明ADFI與BF具有正相關(guān)趨勢(r=0.1,P=0.19)，說明韋榮球菌科在增加采食量的同時會導(dǎo)致脂肪沉積，與本文相關(guān)研究結(jié)果相吻合。

Two-part模型與CAGs分析結(jié)果基本一致，說明本研究分析結(jié)果的可靠性。除之前發(fā)現(xiàn)的YRC22具有抑制宿主食欲的潛能外[12]，本研究還發(fā)現(xiàn),伯克氏菌目可通過產(chǎn)SCFAs[47]參與神經(jīng)體液調(diào)節(jié)通路，最終抑制宿主進(jìn)食。與此高度吻合的是，本試驗在挑選ADFI極端值而進(jìn)行的LEfSe差異分析中同樣鑒定到這兩種腸道微生物在Low_ADFI組顯著富集。而毛螺菌科除產(chǎn)生丁酸外還可以產(chǎn)生乳酸[48]，本研究也發(fā)現(xiàn)乳酸菌與ADEV呈負(fù)相關(guān)，且乳酸菌一直以來通過產(chǎn)生乳酸而促進(jìn)腸道發(fā)育和代謝并充當(dāng)益生菌的角色[49]。有研究表明，宿主體內(nèi)乳酸的產(chǎn)生能夠激活其飽腹感通路從而宿主減少對食物的攝入[50]。而與食欲呈正相關(guān)趨勢的OTUs主要注釋為普氏菌屬(尤其是Prevotellacopri)、厭氧支原體屬、韋榮球菌科以及部分瘤胃菌科和毛螺菌科。另外，Myer等[51]研究發(fā)現(xiàn)，厭氧支原體屬和糞桿菌屬(Faecalibacterium)在ADGHigh-ADFIHigh類群中數(shù)量最多，在本研究中亦有相似發(fā)現(xiàn)，且ADFI與ADG顯著正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，普氏菌與富含絲氨酸、半胱氨酸等生物合成的KOs呈正相關(guān)，且在高ADFI組具有更高的豐度[12]，不僅如此，普氏菌屬與一種開胃激素相關(guān)聯(lián)，與其在促進(jìn)宿主食欲方面的功能至關(guān)重要[52]。值得一提的是，本研究中LEfSe組間差異分析結(jié)果顯示，Low_ADFI組顯著富集的14個OTUs中有3個被注釋為克里斯滕森菌科。研究表明，克里斯滕森菌科屬于革蘭陽性菌，能夠產(chǎn)生SCFAs[53]。不僅如此，Goodrich等[54]研究發(fā)現(xiàn)，克里斯滕森菌科在低身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)個體中富集。這些研究結(jié)果剛好與本研究中ADFI與ADG顯著正相關(guān)的發(fā)現(xiàn)相一致。

最后，本研究通過對腸道微生物進(jìn)行功能預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，胰島素信號通路與ADFI值顯著正相關(guān)。之前的研究表明，胰島素水平的提高會增加饑餓感，增強(qiáng)機(jī)體對甜味的感知，增加食物的攝入量[55]。瘦素是一種主要由脂肪細(xì)胞合成和分泌的蛋白質(zhì)，可以調(diào)節(jié)食欲，并在脂肪酸氧化等脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮重要作用[56]。這在一定程度上可以解釋本研究中脂質(zhì)代謝與ADFI值之間的顯著生物學(xué)相關(guān)性(P<0.05)。一磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)是鞘脂代謝(Sphingolipid metabolism)中間產(chǎn)物，S1P能夠作用于后腸特異性神經(jīng)肽樣受體dNepYr的上游，并通過dNepYr信號通路抑制食欲[57]。有趣的是，本研究中同樣發(fā)現(xiàn)鞘脂代謝與ADFI值顯著負(fù)相關(guān)。不僅如此，本研究還發(fā)現(xiàn)分別與ADFI值關(guān)聯(lián)的代謝功能和腸道微生物之間也呈現(xiàn)顯著相關(guān)性，即與ADFI值相關(guān)性方向一致的代謝功能和OTU之間呈顯著正相關(guān)，否則呈顯著負(fù)相關(guān)。這說明腸道微生物對宿主表型的影響與其功能相適應(yīng)。

4 結(jié) 論

本研究表明，一些細(xì)菌(如伯克氏菌目、瘤胃球菌科、克里斯滕森菌科、毛螺菌科等)因產(chǎn)生SCFAs或乳酸可能在抑制豬采食量方面發(fā)揮重要作用，而柔嫩梭菌、Asteroleplasmaanaerobium和普氏菌屬(尤其是Prevotellacopri)則可以增加宿主采食量，可能是控制宿主食欲的關(guān)鍵微生物。但是本研究存在一定的局限性，受限于16S rRNA測序的分類水平，很多OTUs只能注釋到屬水平甚至科水平，因此無法明確微生物物種對采食行為的影響及其作用機(jī)制，今后仍需結(jié)合宏基因組和代謝組進(jìn)一步深入地研究并驗證潛在的機(jī)制假說。