王雅涵，鄭宇婧，鐘 沛，李曉丹,2，王 鋒,2*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南京 210095； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 江蘇省家畜胚胎工程實(shí)驗(yàn)室，南京 210095)

湖羊是我國浙江嘉興和太湖流域一帶的優(yōu)良綿羊品種，是我國一級(jí)保護(hù)地方畜禽品種，具有性成熟早、多胎高產(chǎn)、生長發(fā)育快、肉質(zhì)鮮嫩等優(yōu)良特性[1]，受到畜牧工作者的廣泛重視。隨著養(yǎng)羊業(yè)被重視程度的提高，開展良種繁育，尤其是提高雌性綿羊繁殖力已成為養(yǎng)羊業(yè)持續(xù)發(fā)展的一個(gè)重要決定因素。決定母羊繁殖力的兩個(gè)重要因素是排卵率和子宮容受性。子宮是胚胎著床和發(fā)育的場所，直接決定著胚胎的命運(yùn)，因此子宮的發(fā)育情況與繁殖力的提升直接相關(guān)。已有研究表明，Hippo通路參與卵泡發(fā)育，但是其在子宮容受性中的作用尚未見報(bào)道。

Hippo通路的核心是一個(gè)激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，即Mst1/2激酶和SAV1形成復(fù)合體發(fā)生磷酸化，進(jìn)而激活LATS1/2，LATS1/2和MOB1形成復(fù)合體發(fā)生磷酸化并使YAP1發(fā)生磷酸化[2]，研究發(fā)現(xiàn)Hippo信號(hào)通路參與調(diào)控雌性動(dòng)物的生殖系統(tǒng)發(fā)育[3-4]。Hippo通路可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡及干細(xì)胞自我更新來控制器官大小[5-7]。磷酸化的YAP1與細(xì)胞質(zhì)中的蛋白結(jié)合并滯留在細(xì)胞質(zhì)中，隨后被泛素化降解，由此抑制YAP1的促生長、抗凋亡等功能。有研究表明，YAP1的激活能夠誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，并建立一個(gè)免疫抑制的局部環(huán)境，允許胎兒著床到子宮上皮，保證牛早期妊娠的正常進(jìn)行[8]。建立良好的子宮容受性有利于早期妊娠的正常進(jìn)行。但是，YAP1對(duì)于湖羊子宮容受性建立的影響未見報(bào)道。

子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞是子宮組織中含量最多的一種細(xì)胞，其分布于子宮腺之間，主要參與蛻膜化過程[9]。子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化是一個(gè)受多基因調(diào)控的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖與分化過程，對(duì)胚胎著床、胎盤功能的維持及胎兒的生長發(fā)育具有重要作用[10]。線粒體作為細(xì)胞內(nèi)能量供應(yīng)的重要細(xì)胞器，在細(xì)胞分化、增殖和凋亡等過程中起著重要作用。但是，YAP1基因?qū)ψ訉m內(nèi)膜細(xì)胞增殖和線粒體功能的影響尚不清楚。

綜上所述，YAP1參與調(diào)控機(jī)體內(nèi)多種生理過程的研究已廣泛開展，其能夠參與機(jī)體內(nèi)多項(xiàng)生物學(xué)活動(dòng)，但國內(nèi)外卻鮮有YAP1對(duì)于家畜生殖器官發(fā)育影響的研究。因此，本試驗(yàn)以高、低繁殖力湖羊?yàn)檠芯繉?duì)象，研究Hippo通路核心因子在不同繁殖力湖羊子宮中的表達(dá)差異以及效應(yīng)基因YAP1對(duì)子宮容受性的影響及可能存在的調(diào)控機(jī)制，闡明Hippo通路在不同繁殖力湖羊子宮中的表達(dá)模式及YAP1調(diào)控子宮容受性可能存在的分子機(jī)制，為高繁殖力母羊的分子培育提供新的思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及采樣

本試驗(yàn)所用湖羊來源于江蘇省泰州市海倫羊業(yè)有限公司。根據(jù)系譜檔案在體況相近、健康的經(jīng)產(chǎn)母羊中篩選出高繁湖羊群體(連續(xù)3胎產(chǎn)3羔)和低繁湖羊群體(連續(xù)3胎產(chǎn)1羔)。依據(jù)BMPR-1B基因多態(tài)性分析將候選湖羊分為3組：FecBBB基因型的高繁和低繁湖羊組(HBB/LBB,n=3)，F(xiàn)ecBB+基因型低繁湖羊組(LB+，n=3)。3組湖羊采取單欄飼養(yǎng)，所有動(dòng)物都被安置在相同的條件下，自由獲得飼料和水。陰道內(nèi)海綿同步發(fā)情周期11 d。利用試情公羊檢測發(fā)情行為并記錄，在第二次自然發(fā)情時(shí)屠宰，并收集子宮內(nèi)膜、下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管、松果體、心、肝、脾、肺、腎、肌肉等12個(gè)組織，在液氮中迅速冷凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱凍存。

1.2 YAP1基因的氨基酸和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用NCBI網(wǎng)站獲取并下載山羊、牛、豬、人、雞、大鼠和小鼠的YAP1氨基酸序列，利用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，用MEGA 7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

本試驗(yàn)中子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的分離及鑒定參照文獻(xiàn)[11]。在添加15% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)ESC。用1 mL 0.25%胰蛋白酶消化1 min后制成細(xì)胞懸液接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在光學(xué)顯微鏡下觀察到細(xì)胞密度達(dá)到70%左右時(shí)，按照Lipofectamine?3000試劑盒說明書將si-NC、si-YAP1轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)。si-NC和si-YAP1序列由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)與合成，其具體序列見表1。所有細(xì)胞均置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測。

表1 YAP1基因干擾序列Table 1 Sequences of YAP1 gene interference

1.4 RNA提取和熒光定量PCR

用Trizol試劑盒(Invitrogen)提取子宮組織及轉(zhuǎn)染si-NC和si-YAP1的ESC內(nèi)總RNA，分光光度計(jì)檢測其純度和濃度(1.8

表2 基因引物序列Table 2 Primer sequences of genes

1.5 Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，向6孔板中加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)的裂解液，冰上裂解30 min。用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，12 000 r·min-1離心15 min，收集上清液，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白變性后取10 μg蛋白采用SDS-PAGE電泳分離處理，結(jié)束后用半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印硝酸纖維膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加一抗(YAP1抗體，1∶1 000稀釋；Bax抗體，1∶5 000稀釋；Bcl-2抗體，1∶1 000稀釋；ACTB抗體，1∶5 000稀釋)，4 ℃過夜孵育。次日加入二抗(HRP標(biāo)記的山羊抗兔/鼠IgG，1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h，用化學(xué)發(fā)光法顯色，用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。以ACTB作為內(nèi)參，分析目的蛋白的表達(dá)。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測

利用Annexin-V FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡，即細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，棄培養(yǎng)液，DPBS洗3次，用細(xì)胞消化液處理并收集細(xì)胞；收集到的細(xì)胞再用PBS洗兩次，隨后加入500 μL的Binding Buffer重懸浮細(xì)胞，之后加入Annexin V-FITC與PI染液，室溫避光反應(yīng)5～15 min；最后，用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究所涉及試驗(yàn)均重復(fù)至少3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)”表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)先用Excel 2019處理，用GraphPad Prism 8.0軟件分析數(shù)據(jù)并作圖，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，3組及以上比較采用單因素方差分析，并且選擇LSD法進(jìn)行多重比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 高繁(HBB)和低繁(LBB/LB+)湖羊組織中Hippo通路核心基因表達(dá)差異

如圖1所示，Hippo通路中的LATS1和MST1基因在高繁湖羊(HBB)子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)量顯著低于低繁(LBB/LB+)湖羊(P<0.05)。MST2基因表達(dá)量在高繁(HBB)湖羊和低繁(LBB/LB+)湖羊組織差異不顯著。只有YAP1基因在高繁湖羊(HBB)組織中的表達(dá)量顯著高于低繁(LBB/LB+)湖羊(P<0.05)。因此，接下來YAP1基因?qū)⒆鳛槟康幕蜻M(jìn)行進(jìn)一步的探究。

圖中數(shù)據(jù)為3次生物學(xué)重復(fù)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。柱上不同小寫字母表示基因表達(dá)量在不同繁殖力湖羊間差異顯著(P<0.05，單因素方差分析)Data in the figure are “means±SD” of three biological replicates. Different small letters above bars indicate that the gene expression levels were significantly different in Hu sheep with different fertility (P<0.05, one-way ANOVA)圖1 高繁(HBB)和低繁(LBB/LB+)湖羊子宮組織中Hippo通路核心基因表達(dá)量Fig.1 Relative expression levels of genes in Hippo pathway in uterus of Hu sheep with high or low fertility

2.2 YAP1序列及特征分析

氨基酸序列同源性分析結(jié)果(圖2A)顯示，YAP1氨基酸序列與山羊和牛的同源性最高，分別為95.94%和95.04%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果(圖2B)表明，綿羊YAP1蛋白與山羊和牛聚為一組，親緣關(guān)系最近。

A. DNAMAN軟件分析綿羊、山羊、牛、豬、人、雞、大鼠和小鼠YAP1的氨基酸序列相似性；B. 綿羊、山羊、牛、豬、人、雞、大鼠和小鼠YAP1的蛋白同源性分析A. The similarity of YAP1 amino acid sequences of sheep, goat, cattle, pig, human, chicken, rat and mouse was analyzed using DNAMAN software; B. Homology analysis of YAP1 protein in sheep, goat, cattle, pig, human, chicken, rat and mouse圖2 湖羊與其他物種YAP1氨基酸序列比較Fig.2 Comparison of amino acid sequences of YAP1 in different species

2.3 湖羊YAP1基因的組織表達(dá)譜分析

通過RT-qPCR檢測了YAP1基因在湖羊子宮、心、肝、腎、下丘腦、肌肉等12種組織中的表達(dá)情況(圖3)：YAP1基因在被檢測的12種組織中均有表達(dá)，在肌肉中表達(dá)量最高，在心中表達(dá)量最低。在下丘腦-垂體-生殖軸中，YAP1在子宮中表達(dá)僅次于松果體和輸卵管。

圖中數(shù)據(jù)為3次生物學(xué)重復(fù)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。柱上不同小寫字母表示基因表達(dá)量在不同組織間差異顯著(P<0.05，單因素方差分析)Data in the figure are “means±SD” of three biological replicates. Different small letters above bars indicate that the gene expression levels were significantly different in different tissues (P<0.05, one-way ANOVA)圖3 湖羊YAP1基因組織表達(dá)分析Fig.3 Expression analysis of YAP1 gene in various tissues of Hu sheep

2.4 si-YAP1干擾效率檢測

RT-qPCR結(jié)果(圖4A)顯示，較si-NC組，si-YAP1組中YAP1 mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。Western blot檢測結(jié)果(圖4B)顯示，轉(zhuǎn)染si-YAP1后，YAP1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。以上結(jié)果顯示si-YAP1能夠有效地抑制YAP1的表達(dá)，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖中數(shù)據(jù)為3次生物學(xué)重復(fù)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。柱上不同小寫字母表示基因及蛋白表達(dá)量在試驗(yàn)組和對(duì)照組間差異顯著(P<0.05，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn))。下同Data in the figure are “means±SD” of three biological replicates. Different small letters above bars indicate that the gene and protein expression levels were significantly different between test group and control group (P<0.05, independent-samples t test). The same as below圖4 YAP1基因的siRNA干擾效率檢測Fig.4 Detection of siRNA interference efficiency of YAP1 gene

2.5 YAP1對(duì)子宮容受性相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖5所示，干擾YAP1基因能夠顯著下調(diào)FOXO1、PRL、VEGF和OPNmRNA的表達(dá)水平(P<0.05)，顯著上調(diào)COX-2 mRNA的表達(dá)水平(P<0.05)。

圖5 干擾YAP1對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞容受性相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.5 Effects of YAP1 interference on receptivity related genes expression in endometrial stromal cells

2.6 YAP1對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響

如圖6所示，干擾YAP1后，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的凋亡率顯著上升(圖6A)。RT-qPCR結(jié)果(圖6B)顯示，干擾YAP1顯著上調(diào)了子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中Bax、BIM、p53、caspase3、caspase8、caspase9的mRNA表達(dá)水平(P<0.05)，顯著降低了Bcl-2的mRNA表達(dá)水平(P<0.05)，且Bax/Bcl-2的比值顯著升高。Western blot結(jié)果(圖6C)顯示，干擾YAP1后Bax的蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，Bcl-2的蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，Bax/Bcl-2的比值也顯著升高(P<0.05)。

A.流式細(xì)胞術(shù)分析干擾YAP1對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響；B.干擾YAP1對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響；C.干擾YAP1后Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)情況變化。數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示且以si-NC為對(duì)照A. Endometrial stromal cell apoptosis was detected after interfering YAP1 gene by flow cytometer; B. Effects of YAP1 interference on mRNA relative expression of apoptosis-related genes in endometrial stromal cells; C. Effects of YAP1 interference on Bax and Bcl-2 proteins expression in endometrial stromal cells. The results are expressed relative to the si-NC group as “mean±SD”圖6 干擾YAP1對(duì)湖羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Effects of YAP1 interference on the apoptosis of Hu sheep endometrial stromal cells

2.7 干擾YAP1對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞線粒體功能相關(guān)基因的影響

如圖7所示，干擾YAP1后FIS1、DNM1L的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，MFN2、PPARGC1A、OPA1的mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，MFN1的mRNA表達(dá)水平無顯著變化。

圖7 干擾YAP1對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞線粒體功能相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.7 Effects of YAP1 interference on mRNA relative expression of mitochondrial function related genes in endometrial stromal cells

3 討 論

近年來，YAP1參與調(diào)控機(jī)體內(nèi)多種生理過程的研究已廣泛開展，但YAP1在子宮容受性中的研究尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)首先通過對(duì)不同繁殖力湖羊子宮組織中Hippo通路的關(guān)鍵基因進(jìn)行定量，篩選出在高繁殖力湖羊子宮組織中顯著高表達(dá)的效應(yīng)基因YAP1；接下來對(duì)YAP1的序列特征進(jìn)行分析；最后通過功能缺失試驗(yàn)探究YAP1基因影響子宮容受性潛在的分子機(jī)制。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，YAP1能夠抑制子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的凋亡從而有利于子宮容受性的建立。

Hippo通路是一個(gè)高度保守的信號(hào)傳導(dǎo)通路，能夠調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和死亡，進(jìn)而調(diào)控器官的發(fā)育。有研究表明，Hippo通路與子宮內(nèi)膜重構(gòu)和子宮內(nèi)膜微環(huán)境調(diào)節(jié)等有關(guān)，YAP1的活化提供早期妊娠所需環(huán)境，對(duì)雌性動(dòng)物生殖力的維持至關(guān)重要；且對(duì)于奶牛子宮損傷后修復(fù)有重要作用[12]。在本試驗(yàn)中，檢測Hippo通路核心因子MST1、MST2、LATS1及主要效應(yīng)因子YAP1在高繁和低繁湖羊組織中的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)僅有YAP1的表達(dá)量在高繁湖羊中高于低繁湖羊，因此推測，在Hippo通路中，YAP1是影響湖羊子宮發(fā)育及容受性，進(jìn)而導(dǎo)致繁殖力差異的主要因子。

子宮內(nèi)膜容受性是指子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎的接受能力，是完成妊娠的必要條件之一[13]。胚胎植入過程中最顯著的現(xiàn)象是胚泡植入部位血管通透性顯著增加，一般認(rèn)為，這是胚胎植入早期必備條件之一[14]。而新血管的形成是成功維持妊娠的基礎(chǔ)[15]，VEGF作為一種有效的血管生成因子發(fā)揮著核心作用，通過調(diào)控血管生成促進(jìn)胚胎的成功植入。已證實(shí)，F(xiàn)OXO1通過MST1-FOXO1級(jí)聯(lián)建立內(nèi)皮細(xì)胞極性，在血管生成中起關(guān)鍵作用[16]。FOXO1作為血管生成的重要調(diào)節(jié)因子，可直接調(diào)節(jié)其他組織中VEGF的表達(dá)[17]。近期有研究表明，YAP已經(jīng)被確定為將VEGF/VEGFR2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到特定轉(zhuǎn)錄程序中的主要調(diào)節(jié)劑，這對(duì)血管形成至關(guān)重要[18]。在VEGF誘導(dǎo)的血管生成中，VEGFR-2可以與整合素αvβ3相互作用[19]。整合素αvβ3是胚胎植入過程中的重要黏附分子，糖蛋白骨橋蛋白(OPN)是其配體糖蛋白，胚胎整合素αvβ3與子宮內(nèi)膜OPN的相互作用被認(rèn)為參與了胚胎與子宮內(nèi)膜腔上皮的黏附[20]。COX-2是胚囊著床時(shí)唯一可以在子宮內(nèi)膜上皮和基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的環(huán)氧化酶，其可以促進(jìn)著床部位的內(nèi)膜血管再生以及血管通透性增加，有利于胚胎植入與妊娠的建立[21]。此外，在小鼠中，敲除COX-2后，野生型囊胚未能植入，且正常的蛻膜化反應(yīng)受損，這表明COX-2在植入過程中發(fā)揮了重要作用[22]。在妊娠各期，前列腺素都可以促進(jìn)子宮平滑肌收縮，COX-2的過度表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致前列腺素表達(dá)上升，降低子宮內(nèi)膜容受性。分泌性子宮內(nèi)膜通過黃體酮的直接作用合成PRL，在黃體晚期達(dá)到最大產(chǎn)量，誘導(dǎo)孕酮介導(dǎo)的基質(zhì)細(xì)胞蛻膜。同時(shí)，在蛻膜過程中，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的PRL對(duì)造血細(xì)胞有顯著的促增殖和抗凋亡作用[23]。本研究中，沉默YAP1后FOXO1、VEGF、PRL和OPNmRNA水平明顯降低，而COX-2 mRNA水平明顯升高，說明YAP1可能有增加子宮內(nèi)膜血管通透性、增加子宮與胚胎黏附性，減少前列腺素分泌，抑制子宮收縮，促進(jìn)PRL分泌，促進(jìn)子宮蛻膜化，從而維持妊娠的作用。

細(xì)胞的凋亡受到細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白的調(diào)控，是一個(gè)極其復(fù)雜的生理過程。caspase是一組促使細(xì)胞凋亡的蛋白酶，在細(xì)胞凋亡機(jī)制網(wǎng)絡(luò)中處于核心地位。caspase3是caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游中的一個(gè)關(guān)鍵凋亡蛋白酶，可被caspase8、caspase9等活化，能夠激活外源性細(xì)胞凋亡途徑和由線粒體調(diào)節(jié)的內(nèi)源性凋亡途徑[24]。在細(xì)胞凋亡進(jìn)程中，Bcl-2家族也發(fā)揮重要作用，有研究者提出Bax/Bcl-2可以體現(xiàn)細(xì)胞在受凋亡刺激后的存活比例[25]，比值降低，能減少細(xì)胞凋亡數(shù)量，相反則增加細(xì)胞凋亡數(shù)量。BIM是Bcl-2家族中的促凋亡蛋白成員之一[26]，能結(jié)合并轉(zhuǎn)位凋亡蛋白Bax到線粒體上，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。p53也是重要的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27]。Bax蛋白是組成線粒體膜上離子通道的部分，能夠幫助細(xì)胞色素C穿過線粒體膜，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而Bcl-2作為凋亡抑制基因，能夠阻止上述過程，抑制細(xì)胞凋亡[28-29]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制YAP1能夠加快人宮頸癌Hela細(xì)胞的凋亡，這可能與激活p53及Fra-1基因相關(guān)[30]。通過靶向抑制劑CA3抑制肝癌HepG2細(xì)胞中YAP1的轉(zhuǎn)錄活性后發(fā)現(xiàn)，Bcl-2表達(dá)降低，Bax、caspase3表達(dá)升高，HepG2細(xì)胞增殖受到抑制、凋亡率增加[31]。本試驗(yàn)中，干擾YAP1基因后細(xì)胞凋亡率明顯升高，RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)p53、caspase3、caspase8、Bax的mRNA表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2 的mRNA水平明顯降低，Bax/Bcl-2比值明顯上升。以上結(jié)果與前人在其他不同細(xì)胞類型上的研究結(jié)果相似，說明YAP1的表達(dá)會(huì)對(duì)細(xì)胞凋亡過程產(chǎn)生抑制作用。干擾YAP1后線粒體的融合可能受到阻礙，從而導(dǎo)致線粒體紊亂，觸發(fā)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。細(xì)胞凋亡的兩種主要途徑是內(nèi)在的線粒體途徑和外在的死亡受體途徑，內(nèi)在和外在途徑都會(huì)受到p53的調(diào)控且這兩種途徑最終都會(huì)導(dǎo)致caspase蛋白酶家族的激活，YAP1的表達(dá)可在一定程度上抑制這兩種途徑的激活。

線粒體是細(xì)胞的“能量工廠”，通過不斷分裂和融合，能夠調(diào)節(jié)膜電位，間接決定著組織細(xì)胞的功能甚至存亡[32]。其中，F(xiàn)IS1是線粒體分裂的重要調(diào)節(jié)因子，介導(dǎo)線粒體分裂復(fù)合物的組裝，參與線粒體分裂，是線粒體融合分裂過程中重要的蛋白質(zhì)。DNM1L也是線粒體分裂體系的重要組成成分，其可與不同物種的多種分子之間相互作用組裝成高級(jí)結(jié)構(gòu)，并定位于線粒體中，引起線粒體膜的融合和分裂[33]。線粒體融合過程包括外膜融合和內(nèi)膜融合兩步，外膜融合主要依靠線粒體外膜中的GTPase蛋白MFN1和MFN2來完成，內(nèi)膜融合則是由OPA1來完成[34]。研究表明，YAP1通過過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(PPARGC1A)調(diào)節(jié)小鼠血管生成[35]，PPARGC1A是介導(dǎo)線粒體功能的主要參與者，在線粒體增殖和呼吸等生化途徑中起著十分重要的作用[36]。本研究中，MFN2、OPA1和PPARGC1A mRNA水平明顯下調(diào)，DNM1L和FIS1 mRNA水平明顯上調(diào)，表明YAP1可能通過提高子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)線粒體的活性調(diào)節(jié)線粒體的生物合成，進(jìn)而促進(jìn)子宮的生長發(fā)育和容受性。

本研究發(fā)現(xiàn)，YAP1基因在高繁湖羊組織中的表達(dá)量顯著高于低繁湖羊。在下丘腦-垂體-生殖軸中，YAP1在子宮中的表達(dá)僅次于松果體和輸卵管。干擾YAP1基因能夠顯著下調(diào)FOXO1、PRL、VEGF、OPN、Bcl-2、MFN2、PPARGC1A、OPA1 mRNA的表達(dá)水平，顯著上調(diào)COX-2、Bax、BIM、p53、caspase3、caspase8、caspase9、FIS1、DNM1L mRNA的表達(dá)水平。所以，沉默YAP1基因后細(xì)胞凋亡率升高，促凋亡基因和蛋白的表達(dá)增加，抗凋亡基因和蛋白的表達(dá)降低。同時(shí)，促線粒體融合基因表達(dá)降低，促線粒體分裂基因表達(dá)升高，不利于線粒體正常功能的發(fā)揮。因此，干擾YAP1可能會(huì)對(duì)胚胎著床和妊娠維持產(chǎn)生不利影響。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，沉默YAP1基因后細(xì)胞凋亡率升高，增加了促凋亡基因和蛋白的表達(dá)，降低了抗凋亡基因和蛋白的表達(dá)。同時(shí)，促線粒體融合基因表達(dá)降低，促線粒體分裂基因表達(dá)升高，不利于線粒體正常功能的發(fā)揮。因此，干擾YAP1可能會(huì)對(duì)胚胎著床和妊娠維持產(chǎn)生不利影響，提示YAP1可以從影響子宮內(nèi)膜血管生成及通透性、細(xì)胞凋亡和線粒體融合這3個(gè)途徑調(diào)控湖羊子宮的發(fā)育及容受性。抑制Hippo通路，提高YAP1基因表達(dá)量可能提高子宮容受性，有利于子宮發(fā)育，從而有利于湖羊高繁殖性能的發(fā)揮。