牛銳利，宋哈楠，吳 月，王育南，高也凡，關(guān)偉軍，宗憲春

(1.牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，牡丹江 157011；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

1960年西門塔爾牛(Simmental)由前蘇聯(lián)引進中國，至今已成為中國牛肉產(chǎn)區(qū)的主要品種之一[1]。2020年Meng等[2]分析了西門塔爾牛的轉(zhuǎn)錄組學(xué)，成功建立了西門塔爾牛轉(zhuǎn)錄組遺傳資源，同時分析了與其肉質(zhì)相關(guān)的差異表達(dá)基因，推動了西門塔爾牛遺傳資源的研究，為西門塔爾牛遺傳育種的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。但目前西門塔爾牛干細(xì)胞遺傳資源的建立及保存仍存在缺失。表皮干細(xì)胞(EpSCs)作為干細(xì)胞，是西門塔爾牛一種重要的遺傳種質(zhì)資源。干細(xì)胞具有多向分化潛能[3]，是自我更新能力很強的細(xì)胞。EpSCs存在于人和動物最大器官——皮膚中，在皮膚的更新、損傷修復(fù)與再生過程中起著重要的作用，在干細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)中具有重要的研究意義[4]。EpSCs來源于胚胎時期的外胚層[5]。在胚胎發(fā)育早期，外胚層細(xì)胞對稱分裂增殖產(chǎn)生大量基底細(xì)胞附著于基底膜并形成皮膚基板[6]。隨著胚胎的發(fā)育，基板中基底細(xì)胞經(jīng)不對稱分裂形成一部分子細(xì)胞向外遷移發(fā)育出一層扁平細(xì)胞，這層細(xì)胞暴露于羊水中形成周皮，另一部分繼續(xù)留在基板。表皮的增厚及皮膚附屬物的發(fā)育與基底層細(xì)胞的不斷分裂相關(guān)[7]，這些細(xì)胞具有潛在的多能性。2006年Moore和Lemischka[8]將基板中具有多向分化潛能的基底細(xì)胞定義為表皮干細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，除基底層基底細(xì)胞外，表皮干細(xì)胞還包含毛囊干細(xì)胞(hair stem cells，HSCs)[9]，濾泡間表皮干細(xì)胞(interfollicular epidermal stem cells，IESCs)[10]和汗腺干細(xì)胞(sweat gland stem cell，SGSCs)[11]等。在基底層、毛囊和濾泡間表皮存在的ESCs均特異性表達(dá)特定基因[12]，主要包含KRT15、KRT19[13]、KRT10[14]和KRT9等。細(xì)胞整合素對于表皮的擴增和維持表皮穩(wěn)定具有重要作用，細(xì)胞整合素β1(integrin β1，ITG β1)通過信號調(diào)節(jié)調(diào)控凋亡蛋白在EpSCs中的水平控制細(xì)胞的凋亡[15]，細(xì)胞整合素α6(integrin α6，ITG α6)可調(diào)節(jié)EpSCs的高增殖和克隆能力[16]。EpSCs在體內(nèi)被證實具有向表皮、毛囊等皮膚附件分化的潛能[17]。P63是一種與腫瘤抑制基因p53相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，可以維持基底細(xì)胞的再生能力，并在調(diào)節(jié)外胚層間質(zhì)的相互作用中發(fā)揮功能[18]。P63磷酸化水平的調(diào)控與EpSCs分化為角質(zhì)形成細(xì)胞密切相關(guān)，其主要出現(xiàn)在基底EpSCs[19]。胚胎時期，存在于基底層的EpSCs可增殖遷移到毛發(fā)胚芽的EpSCs形成毛囊干細(xì)胞，進一步分化為毛囊細(xì)胞[20]。存在于汗腺中的EpSCs具有分化為汗腺細(xì)胞的潛能[21]。甲基質(zhì)中EpSCs可分化為甲板細(xì)胞[22]，并參與指甲的再生。EpSCs在體外特定條件下也可誘導(dǎo)分化為汗腺[23]、神經(jīng)[24]、內(nèi)皮[25]等不同胚層的細(xì)胞。本研究以西門塔爾牛背部表皮為試驗材料獲得EpSCs，對其進行鑒定并探討其體外誘導(dǎo)分化潛能。通過EpSCs的分離以期建立生長狀態(tài)良好的西門塔爾牛EpSCs系，為建立西門塔爾牛種質(zhì)資源庫提供細(xì)胞遺傳資源，同時為干細(xì)胞治療研究提供種子細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 3月齡西門塔爾牛由河北省廊坊市萬福肉類有限公司提供。

1.1.2 主要試劑 L-DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Trypsin1:250)、Ⅱ型中性蛋白酶(Dispase Ⅱ)胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)均為Gbico公司產(chǎn)品；堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)均為Peprotech公司產(chǎn)品；Ⅳ型膠原(TypeⅣ)為HZbscience公司產(chǎn)品；胰島素(insulin，INS)、吲哚美辛為Aladdin公司產(chǎn)品；地塞米松(Dexamethasone，DXMS)為麥克林公司產(chǎn)品；β-甘油磷酸、β-琉基乙醇、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-Isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)、乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、二甲基亞砜(DMSO)、抗壞血酸鹽(Vc)均為Sigma公司產(chǎn)品；FITC標(biāo)記兔抗鼠二抗、鼠多克隆抗體、細(xì)胞整合素β1(Integrin β1，ITG β1)、P63和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Transferrin receptor，TFRC/CD71)均為Abcam公司產(chǎn)品；Trizol為Invitrogen產(chǎn)品；RT-PCR試劑盒、DL1 000 DNA Marker為TaKaRa產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基配制 完全培養(yǎng)基：L-DMEM+10% FBS+10 ng·mL-1EGF+10 ng·mL-1bFGF+2 mmol·L-1M谷氨酰胺；脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)液：L-DMEM培養(yǎng)基+12% FBS+1%青、鏈霉素+0.5 mmol·L-1IBMX+10 mg·L-1INS+1 umol·L-1DXMS+200 μmol·L-1吲哚美辛；軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液：L-DMEM培養(yǎng)基+2.5% FBS+1% ITS+50 μg·mL-1L-脯氨酸+0.1 μm地塞米松+0.9 mmol·L-1丙酮鈉+50 μg·mL-1L-抗壞血酸+10 ng·mL-1TGF-β3；成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液：L-DMEM培養(yǎng)基+10% FBS+10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉+0.1 mmol·L-1抗壞血酸+ 10 mmol·L-1地塞米松+10 ng·mL-1 TGF-β3；細(xì)胞凍存液：40% L-DMEM+50% FBS+10% DMSO。

1.2 方法

1.2.1 西門塔爾牛表皮干細(xì)胞分離培養(yǎng) 準(zhǔn)備1 mL TypeⅣ，將其均勻鋪在60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于CO2培養(yǎng)箱中2 h待其凝固。取3月齡西門塔爾牛胎牛背部表皮并浸泡于75%酒精中5 min進行消毒，在超凈臺取出表皮，在PBS中清洗3次，用眼科鑷子和剪刀輕輕將表皮層和真皮層分離，PBS再次清洗3次，將表皮剪至2～3 mm3。酶消法：剪好的組織置于Dispase Ⅱ中37 ℃消化30 min，在顯微鏡下觀察有大量分散圓形的細(xì)胞時用含有FBS的L-DMEM終止消化，用500目細(xì)胞篩過濾，1 200 r·min-1離心5 min。將細(xì)胞重懸并接種于鋪有TypeⅣ的細(xì)胞培養(yǎng)皿，在37 ℃，50 mL·L-1CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后半量換液。貼壁法：用眼科鑷子直接將2～3 mm3大小的組織貼于鋪好TypeⅣ的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿倒置放于培養(yǎng)箱約20 min，待組織塊貼緊皿底后加入完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

1.2.2 西門塔爾牛表皮干細(xì)胞傳代與凍存 西門塔爾牛EpSCs匯集度達(dá)到80%可進行傳代。棄去培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，用PBS清洗后加入0.25%胰酶置于37 ℃消化3 min，待細(xì)胞變圓用含F(xiàn)BS的L-DMEM終止消化。接種于2個培養(yǎng)皿中，置于37 ℃，50 mL·L-1CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。EpSCs匯集度達(dá)到80%可進行凍存。將細(xì)胞用胰酶消化并收集至離心管中，1 200 r·min-1離心5 min，棄上清，約每106個細(xì)胞加入1 mL細(xì)胞凍存液重懸，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中進行冷凍保存。

1.2.3 西門塔爾牛表皮干細(xì)胞生長曲線測定 取P3代、P10代和P15代EpSCs分別制成細(xì)胞懸液進行細(xì)胞計數(shù)，按照104個細(xì)胞每孔接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每天對3個孔進行計數(shù)取平均值，連續(xù)計數(shù)7 d。繪制生長曲線，并計算細(xì)胞群體倍增時間(population doubling time, PDT)。PDT的計算公式：PDT=(t-t0) lg2/ (lgNt-lgN0)，其中t表示EpSCs對數(shù)生長期結(jié)束的時間，t0表示EpSCs對數(shù)生長期開始的時間，Nt表示EpSCs對數(shù)生長期結(jié)束時的細(xì)胞數(shù)量，N0表示EpSCs對數(shù)生長期開始時的細(xì)胞數(shù)量。

1.2.4 西門塔爾牛表皮干細(xì)胞RT-PCR檢測 取匯合度達(dá)90%的P6代西門塔爾牛EpSCs，PBS清洗2次，加入1 mL TRIzol將細(xì)胞吹打至脫離培養(yǎng)皿并收集于1.5 mL EP管中靜置5～10 min進行細(xì)胞裂解；加入氯仿輕微震蕩15 s,室溫靜置10 min，4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min；棄上清，加入等體積的異丙醇震蕩15 s,室溫靜置15 min，4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min；75% 乙醇(DEPC水配制)清洗2次，4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min，棄上清晾干；用DEPC水溶解RNA，測RNA 260/280比值，260/230比值及RNA濃度。RNA OD260 nm/OD280 nm比值理想值應(yīng)在1.8～2.0；RNA OD260 nm/OD230 nm比值理想值應(yīng)在1.8～2.2；調(diào)整RNA濃度，使RNA濃度保持在1 000 μg·mL-1左右。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)NCBI設(shè)計引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×Taq PCR Mixture 12 μL，cDNA 1 μL，Primer 1、2(Primer 1為稀釋10倍后的上游引物，Primer 2為稀釋10倍后的下游引物。引物設(shè)計信息見表1)各1 μL，ddH2O 10 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，退火(退火溫度見表1)30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃總延伸5 min。用2.0%瓊脂糖對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并成像拍照。

1.2.5 西門塔爾牛表皮干細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測 取P6代EpSCs消化收集并接種于6孔板中。待細(xì)胞匯合度達(dá)到60%，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗3次；4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗3次；加入0.25% Triton X-100進行通透10 min，PBS清洗3次；加入山羊血清靜置30 min封閉EpSCs表面非特異性標(biāo)記，PBS清洗3次；分別在每孔加入鼠多克隆抗體：ITG β1、P63和CD71(1∶300)室溫孵育1 h，PBS清洗3次；加入兔抗鼠二抗(1∶100)避光室溫孵育30 min，PBS清洗3次；加入DAPI室溫避光孵育30 min，PBS清洗3次；用共聚焦顯微鏡(TE-2000-E，Nikon)進行觀察并拍照，并通過總細(xì)胞和免疫熒光細(xì)胞計數(shù)比計算陽性細(xì)胞率。

1.2.6 脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化及鑒定 取P7代EpSCs細(xì)胞隨機分為對照組和脂肪誘導(dǎo)組，待其匯合度達(dá)到70%時，將脂肪誘導(dǎo)組培養(yǎng)基更換成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d更換1次脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)液；對照組加入完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，每3 d更換1次完全培養(yǎng)基。成脂誘導(dǎo)在培養(yǎng)16～18 d，鏡下觀察產(chǎn)生大量脂滴后利用油紅O對脂滴進行染色，并提取RNA利用RT-PCR對成骨特異性基因過氧化物酶體增殖因子活化受體γ(PPAR-γ)和脂蛋白酶(LPL)表達(dá)情況進行檢測。引物設(shè)計見表1，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同“1.2.4”。

1.2.7 成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化及鑒定 取P7代EpSCs細(xì)胞隨機分為對照組和成骨誘導(dǎo)組，待其匯合度達(dá)到70%時，將成骨誘導(dǎo)組培養(yǎng)基更換成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d更換1次成骨誘導(dǎo)液；對照組加入完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，每3 d更換1次完全培養(yǎng)基。連續(xù)培養(yǎng)15～16 d后，觀察細(xì)胞形態(tài)，用茜素紅對鈣結(jié)節(jié)進行染色，并利用TRIzol提取RNA通過RT-PCR對成骨特異性基因膠原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ)和矮小轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)表達(dá)情況進行檢測。引物設(shè)計見表1，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同“1.2.4”。

1.2.8 軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化及鑒定 取P7代EpSCs細(xì)胞隨機分為對照組和軟骨誘導(dǎo)組，待其匯合度達(dá)到70%時，將軟骨誘導(dǎo)組培養(yǎng)基更換成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d更換1次軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液；對照組加入完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，每3 d更換1次完全培養(yǎng)基。軟骨誘導(dǎo)在培養(yǎng)21 d后，觀察細(xì)胞形態(tài)，用阿利新藍(lán)對其染色，并提取RNA利用RT-PCR對成軟骨特異性基因雙糖鏈蛋白多糖(BGN)和膠原蛋白Ⅱ(CollagenⅡ)表達(dá)情況進行檢測。引物設(shè)計見表1，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同“1.2.4”。

2 結(jié) 果

2.1 西門塔爾牛表皮干細(xì)胞分離培養(yǎng)

利用組織塊貼壁法將組織培養(yǎng)至第6天時，有少量長梭形和多邊形細(xì)胞從組織塊周圍游離出。如圖1A所示，通過組織貼壁法獲得的細(xì)胞致密雜亂，存在許多成纖維狀細(xì)胞，EpSCs的純度較低。經(jīng)過不斷傳代純化EpSCs，傳代至P4代時，細(xì)胞形態(tài)均一，呈多邊形，獲得較高純度的EpSCs。酶消化法利用Dispase Ⅱ?qū)Ρ砥そM織消化30 min后得到分散的細(xì)胞，培養(yǎng)12 h后細(xì)胞貼壁率達(dá)85%。如圖1B所示，此時細(xì)胞大多呈鋪路石狀，細(xì)胞大小均勻，純度較高。對比直接將組織塊和消化后的細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)皿底部鋪上TypeⅣ可增加EpSCs細(xì)胞的粘附性，同時起到一定純化EpSCs的作用。細(xì)胞平均2 d傳代1次，傳代至P28代時，細(xì)胞開始扁平化，有少量空泡產(chǎn)生，細(xì)胞增殖緩慢，傳代時間延長，出現(xiàn)細(xì)胞衰老。

2.2 西門塔爾牛表皮干細(xì)胞生長曲線測定

利用細(xì)胞計數(shù)法對西門塔爾牛EpSCs連續(xù)計數(shù)7 d，利用graphpad prism 9軟件繪制細(xì)胞生長曲線(圖2)。由圖2可知，EpSCs P3代、P10代和P15代細(xì)胞生長曲線均呈“S”型。在第1～3天經(jīng)歷了潛伏期，第1～2天細(xì)胞增殖緩慢，第2～3天細(xì)胞增殖變快；第3～5天為對數(shù)生長期，細(xì)胞呈指數(shù)增長；第6～7天細(xì)胞增殖減緩，逐漸進入平臺期。由不同代次EpSCs生長曲線可知，隨著細(xì)胞代次的增加，細(xì)胞增殖速度逐漸減弱，達(dá)到的細(xì)胞飽和密度也相應(yīng)降低。由表2可知P3代細(xì)胞的群體倍增時間為31.08 h，P10代細(xì)胞的群體倍增時間為32.77 h，P15代細(xì)胞的群體倍增時間為34.08 h。隨著代次的增加，EpSCs的群體倍增時間逐漸增加。由3個代次數(shù)據(jù)得出西門塔爾牛EpSCs平均群體倍增時間為32.64 h。

圖2 西門塔爾牛EpSCs生長曲線Fig.2 Growth curve of EpSCs in Simmental cattle

表2 西門塔爾牛EpSCs群體倍增時間Table 2 Population doubling time of EpSCs in Simmental cattle

2.3 西門塔爾牛表皮干細(xì)胞RT-PCR鑒定

通過RT-PCR的方法對西門塔爾牛EpSCs特異性基因進行擴增，由圖3可知，西門塔爾牛EpSCs表達(dá)ITGβ1、ITGα6和KRT19基因，不表達(dá)CD31。符合表皮干細(xì)胞特性，表明此細(xì)胞是西門塔爾牛EpSCs。

M.DL1000 DNA Marker；1～5.分別為ITG β1、KRT19、ITG α6、CD31和GAPDH基因M.DL1000 DNA Marker；1-5. ITG β1, KRT19, ITG α6, CD31 and GAPDH genes，respectively圖3 西門塔爾牛EpSCs 表面標(biāo)記物PCR檢測Fig.3 PCR identification of EpSCs surface markers in Simmental cattle

2.4 西門塔爾牛表皮干細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測

取P6代生長旺盛的西門塔爾牛EpSCs消化收集并接種于6孔板中。待細(xì)胞匯合度達(dá)到60%時利用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法對細(xì)胞表面特異性標(biāo)記物ITG β1、P63和CD71進行檢測。在共聚焦顯微鏡下觀察分析EpSCs表面標(biāo)志物ITG β1、P63和CD71的表達(dá)情況。結(jié)果如圖4所示，F(xiàn)luorescence為相應(yīng)抗體著色，DAPI為EpSCs核染，Merged為兩者疊加情況。在共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)EpSCs表面標(biāo)志物ITG β1、P63和CD71呈陽性表達(dá)。符合表皮干細(xì)胞生物學(xué)特性，表明此細(xì)胞是西門塔爾牛EpSCs。經(jīng)計算得細(xì)胞中ITG β1陽性細(xì)胞比為98.5%，P63陽性細(xì)胞比為100%，CD71陽性細(xì)胞比為95.3%。

圖4 西門塔爾牛EpSCs免疫熒光Fig.4 Immunofluorescence of EpSCs in Simmental cattle

2.5 脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化及鑒定

西門塔爾牛EpSCs在加入脂肪誘導(dǎo)液誘導(dǎo)16 d后，細(xì)胞增殖緩慢，鏡下可見大量小而分散，折光性非常強的透明脂滴(圖5B)，這些脂滴經(jīng)過一段時間的積累呈簇狀聚集。利用油紅O對脂滴進行染色，大量脂滴呈紅色，如圖5C箭頭所示。對誘導(dǎo)后的脂肪細(xì)胞提取RNA并進行RT-PCR檢測。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的細(xì)胞LPL和PPAR-γ基因呈陽性表達(dá)，結(jié)果如圖5D所示。

2.6 成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化及鑒定

西門塔爾牛EpSCs成骨誘導(dǎo)16 d后，鏡下可觀察到如圖6B所示鈣化結(jié)節(jié)，經(jīng)茜素紅染色后，如圖6C所示鈣結(jié)節(jié)呈紅色。對誘導(dǎo)后的成骨細(xì)胞提取RNA并進行RT-PCR檢測，結(jié)果表明，誘導(dǎo)后的成骨細(xì)胞RUNX2和CollagenI基因呈陽性表達(dá)，如圖6D所示。

A. 未加成骨誘導(dǎo)液的EpSCs；B. 加成骨誘導(dǎo)液的EpSCs；C. 茜素紅染色；D. 骨細(xì)胞特異性基因PCR檢測：M. DL1000 DNA Marker；1～3. 分別為 CollagenⅠ、RUNX2和GAPDH 基因A. No osteogenic inducer of EpSCs；B. Add osteogenic inducer of EpSCs；C. Alizarin Red Staining；D. Detection of bone cell-specific gene by PCR: M. DL1000 DNA Marker；1-3. CollagenⅠ, RUNX2 and GAPDH genes，respectively圖6 西門塔爾牛EpSCs的成骨誘導(dǎo)Fig.6 Osteogenic induction of EpSCs in Simmental cattle

2.7 軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化及鑒定

軟骨誘導(dǎo)14 d后鏡下觀察，培養(yǎng)皿中出現(xiàn)少量具有一定厚度邊緣模糊的軟骨基質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，如圖7B箭頭所示，同時伴有大量折光性強的結(jié)晶樣物質(zhì)產(chǎn)生。誘導(dǎo)21 d軟骨基質(zhì)樣結(jié)構(gòu)變多，利用阿利新藍(lán)對軟骨基質(zhì)進行染色，結(jié)果如圖7C所示，軟骨基質(zhì)被阿利新藍(lán)染色呈藍(lán)色突起。對誘導(dǎo)后的軟骨細(xì)胞及軟骨基質(zhì)提取RNA并通過RT-PCR檢測軟骨細(xì)胞特異性基因。結(jié)果如圖7D所示，誘導(dǎo)后的軟骨細(xì)胞BGN和CollagenⅡ呈陽性表達(dá)。

A. 未加軟骨誘導(dǎo)液的EpSCs；B. 加軟骨誘導(dǎo)液的EpSCs；C. 阿利新藍(lán)染色；D. 軟骨細(xì)胞特異性基因PCR檢測：M. DL1000 DNA Marker；1～3. 分別為和GAPDH、BGN和CollagenⅡ基因A. No cartilage inducer of EpSCs；B. Add cartilage inducer of EpSCs；C. Alcian blue staining；D. Detection of chondrocyte-specific gene by PCR: M. DL1000 DNA Marker；1-3. GAPDH, BGN and CollagenⅡ genes，respectively圖7 西門塔爾牛EpSCs的軟骨誘導(dǎo)Fig.7 Cartilage induced of EpSCs in Simmental cattle

3 討 論

目前干細(xì)胞治療研究成為生命科學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)的研究熱點，在2020年大規(guī)模爆發(fā)的新型冠狀病毒治療中，干細(xì)胞為新型冠狀病毒感染的患者提供了新型的治療方案[26-27]，干細(xì)胞在臨床醫(yī)學(xué)上有著巨大的潛力。在醫(yī)療和美容行業(yè)，以EpSCs為種子細(xì)胞，推動了皮膚創(chuàng)傷修復(fù)研究和醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化[4]。在西門塔爾牛種質(zhì)資源的保存研究中，EpSCs資源的保存將為其提供一種新方法，為西門塔爾牛的育種及資源保存提供重要材料。本研究以酶消化法和組織貼壁法分離得到EpSCs。組織貼壁法獲得EpSCs較緩慢，組織貼壁后6～7 d生長出細(xì)胞，酶消法獲取EpSCs迅速，效率高，純度高。EpSCs對基底膜有較強的黏附性，但在體外培養(yǎng)中，EpSCs對細(xì)胞培養(yǎng)皿的黏附性較弱，本試驗采用在細(xì)胞培養(yǎng)皿中鋪TypeⅣ[28]的方式增加其黏附性。同時對比表皮成纖維細(xì)胞，EpSCs酶消化時間較長，不易脫落，通過控制酶消時間可對EpSCs進行逐步純化，通過試驗發(fā)現(xiàn)，EpSCs胰酶適宜消化條件為0.25%胰酶，37 ℃消化3 min。生長曲線從一定程度上可以反應(yīng)細(xì)胞活力[29]。EpSCs生長曲線呈典型的“S”型，由細(xì)胞生長曲線和群體倍增時間可知隨著EpSCs代次增加細(xì)胞增殖速度減弱，群體倍增時間延長。隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞會受到外力的機械性損傷以及自然衰老，細(xì)胞的活力逐漸下降。RT-PCR結(jié)果顯示細(xì)胞表達(dá)ITGβ1、ITGα6和KRT19，不表達(dá)CD31基因；免疫熒光結(jié)果顯示EpSCs表達(dá)ITG β1、P63和CD71，與Wang等[30]研究結(jié)果一致，說明分離得到的細(xì)胞為EpSCs，經(jīng)免疫熒光細(xì)胞計數(shù)比得到細(xì)胞陽性率大于90%。

干細(xì)胞在自我更新的同時具有多向分化的潛能，EpSCs在體內(nèi)被證實具有向表皮、毛囊和皮膚附件分化的潛能[17]。EpSCs在體外培養(yǎng)時，P4代EpSCs純度較低，傳代至P12代時部分細(xì)胞存在分化情況，同時P5～P10代細(xì)胞增殖速度快，細(xì)胞活力強，因此誘導(dǎo)分化時可選用P5～P10代細(xì)胞進行檢測。在研究EpSCs分化潛能時則統(tǒng)一選取P7代EpSC進行誘導(dǎo)分化。本試驗在研究EpSCs向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的過程中，總結(jié)前人干細(xì)胞脂肪誘導(dǎo)液配方，采用L-DMEM培養(yǎng)基+12% FBS+1%青、鏈霉素+0.5 mmol·L-1IBMX+10 mg·L-1INS+1 μmol·L-1DXMS+200 μmol·L-1吲哚美辛誘導(dǎo)體系[31]，16 d即可得到折光性強的大量脂滴，油紅O染色后脂滴變紅。對EpSCs進行檢測，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的細(xì)胞特異性表達(dá)脂肪細(xì)胞PPAR-γ和LPL基因。在體外將EpSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的過程中，在誘導(dǎo)液中加入β-甘油磷酸鈉，抗壞血酸和地塞米松的基礎(chǔ)上，加10 ng·mL-1TGF-β3會顯著提高誘導(dǎo)效率，誘導(dǎo)10 d后鏡下可觀察到鈣結(jié)節(jié)的形成，16 d產(chǎn)生大量可被茜素紅著色的鈣沉積物，且表達(dá)CollagenⅠ和RUNX2基因。EpSCs在體外向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的過程中加入10% FBS培養(yǎng)2 d后細(xì)胞匯合度達(dá)90 %甚至更高，引起很多細(xì)胞飄落甚至在宏觀條件下可看到細(xì)胞培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞呈片狀卷邊飄起。故在添加FBS時可適當(dāng)減少血清含量以減慢細(xì)胞的增殖。在誘導(dǎo)14 d后可在鏡下觀察到少量小的軟骨基質(zhì)，誘導(dǎo)21 d后軟骨基質(zhì)增多，結(jié)構(gòu)增大，經(jīng)阿利新藍(lán)染色后軟骨基質(zhì)呈藍(lán)色且高表達(dá)BGN和CollagenⅡ基因。說明EpSCs具有向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化的潛能。

4 結(jié) 論

本試驗成功從西門塔爾牛表皮中分離得到EpSCs，細(xì)胞形態(tài)呈鋪路石狀，細(xì)胞生長狀態(tài)和活力良好。免疫熒光結(jié)果顯示EpSCs表面特異性標(biāo)記物ITG β1、P63和CD71呈陽性表達(dá)，RT-PCR結(jié)果顯示EpSCs高度表達(dá)ITGβ1、ITGα6和KRT19，不表達(dá)CD31基因。在體外特定條件下可將EpSCs誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞，軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，證明EpSCs具有向不同胚層細(xì)胞誘導(dǎo)分化的潛能。成功建立了西門塔爾牛EpSCs體外分離培養(yǎng)體系。