張希宇，翟 頻，王 璠，戴瑩瑩，趙博昊，陳 陽(yáng)，吳信生*

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，南京 210014)

毛囊的形態(tài)發(fā)生和生長(zhǎng)發(fā)育受到多種信號(hào)通路的共調(diào)控，并在多種細(xì)胞的調(diào)控下，經(jīng)歷生長(zhǎng)期(anagen)、退行期(catagen)和休止期(telogen)[1]。在此過程中，角蛋白(keratin，KRT)在毛囊生長(zhǎng)發(fā)育中扮演重要角色。角蛋白屬于中間絲蛋白，是上皮細(xì)胞重要組成部分，對(duì)上皮細(xì)胞具有重要保護(hù)作用[2]。除了保護(hù)作用，角蛋白家族還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑及生物反應(yīng)，如細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、凋亡、增殖等[3]。其中，KRT17能夠調(diào)節(jié)TNFα信號(hào)，從而影響毛囊生長(zhǎng)周期[4]；而KRT81、KRT83、KRT85、KRT86和KRT2-25的缺失導(dǎo)致SD大鼠出現(xiàn)無毛表型，這體現(xiàn)了角蛋白基因?qū)γl(fā)生長(zhǎng)的重要性[5]。此外，KRT1和KRT4基因突變會(huì)引起皮毛顏色變化，表明角蛋白還能調(diào)節(jié)皮膚色素沉著[6-8]。

角蛋白16(keratin 16，KRT16)屬于一大類酸性Ⅰ型角蛋白，已有研究表明，KRT16是皮膚的重要保護(hù)屏障，與一些皮膚疾病有著緊密聯(lián)系[9]。如銀屑病、先天性厚甲癥和掌跖腳皮癥。在銀屑病的研究中，過表達(dá)KRT16后，角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖，從而導(dǎo)致銀屑病的發(fā)生[10]。另外，KRT16表達(dá)的沉默能夠抑制VEGF分泌，而VEGF通過影響血液生成進(jìn)而影響毛囊循環(huán)和生長(zhǎng)[11]。本研究克隆得到兔KRT16基因的編碼序列，對(duì)KRT16編碼序列(CDS)的生物學(xué)特性初步進(jìn)行生物信息學(xué)分析。在毛乳頭細(xì)胞(dermal papilla cell，DPC)中過表達(dá)和敲低KRT16，探究KRT16對(duì)毛囊生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的調(diào)控作用，以及對(duì)DPC細(xì)胞增殖的影響。該研究有助于我們進(jìn)一步了解KRT16在兔毛囊生長(zhǎng)發(fā)育中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 皖系長(zhǎng)毛兔由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，共12只。飼養(yǎng)在相同環(huán)境下，給予充足的水和飼料。耳緣靜脈注射Zoteil-50麻醉，采集毛囊不同時(shí)期的長(zhǎng)毛兔背部皮膚，每組一式三份，對(duì)傷口進(jìn)行碘伏消毒[12]。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 Zoteil-50購(gòu)自法國(guó)維克寵物保健公司；HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR、ChamQTM SYBR?qPCR、ClonExpress?II One Step Cloning Kit、HiScript III 1 st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)和CCK-8 Cell Counting Kit購(gòu)自南京諾維贊；Trizol試劑和無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒購(gòu)于天根；限制性內(nèi)切酶Hind III和EcoR I、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit膠回收試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自TaKaRa;PBS購(gòu)于HyClone；MSCM培養(yǎng)基購(gòu)于Sciencell；LipofecctamineTM3000購(gòu)自賽默飛。

1.2 長(zhǎng)毛兔皮膚組織總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

Trizol法提取兔皮膚組織總RNA，并用NanoDrop 2000檢測(cè)RNA濃度和純度，再經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。通過HiScript III 1 st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)合成第一鏈cDNA。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的KRT16基因的CDS序列(XM_002719157.3)，使用Primer 5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，同時(shí)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)引物，并送至擎科生物公司進(jìn)行合成(表1)。

表1 引物信息Table 1 Primers information

1.4 KRT16過表達(dá)載體和干擾載體構(gòu)建

提取兔背部皮膚總RNA，進(jìn)行長(zhǎng)鏈第一鏈cDNA合成，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中編碼序列(XM_002719157.3)設(shè)計(jì)KRT16 CDS引物，構(gòu)建pcDNA3.1(+)過表達(dá)載體，引物序列如表1所示。pcDNA3.1載體經(jīng)Hind III和EcoR I雙酶切后，切膠回收，利用ClonExpress?II One Step Cloning Kit進(jìn)行一步克隆試驗(yàn)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜后挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定。小干擾RNA(small interference RNA, siRNA)和siRNA-NC購(gòu)自上海吉瑪制藥有限公司，siRNA序列見表2。

表2 siRNA序列信息Table 2 Sequences of the siRNAs

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

DPC在MSCM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并在37 ℃含有5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前，將DPC接種于24孔板中，待細(xì)胞的匯合度達(dá)80%時(shí)，使用LipofecctamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染，具體操作根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 細(xì)胞增殖試驗(yàn)

細(xì)胞計(jì)數(shù)后，將定量的細(xì)胞接種于96孔板中，每孔總體積100 μL，培養(yǎng)24 h后，在每個(gè)測(cè)定時(shí)間向每孔中加入10 μL CCK8 Solution，避光孵育3 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光值。

1.7 生物信息學(xué)分析

通過MegAlign軟件(https://en.freedownloadmanager.org/Mac-OS/MegAlign.html)進(jìn)行多序列比對(duì)[13]；使用ExPASy在線軟件(http://au.expasy.org/)預(yù)測(cè)KRT16的理化性質(zhì)[14]；使用SPOMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/)和SWISS-MODEL軟件(http://www.swissmodel.expasy.org)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)[15]。使用UniProt在線軟件(https://www.uniprot.org/)預(yù)測(cè)KRT16的亞細(xì)胞定位，并通過ProtoScale在線軟件(http://expasy.org/tools/protscale.html)分析蛋白質(zhì)疏水性[16-17]。使用NetPhos 3.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)、NetOGlyc 4.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetOGlyc-4.0)和NetNGlyc 1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)[12,18-19]。使用SignalP-4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)和TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行蛋白質(zhì)信號(hào)肽和跨膜區(qū)預(yù)測(cè)[19]。STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/cgi/input.pl)對(duì)蛋白進(jìn)行交聯(lián)分析[20]；使用MEGA X軟件進(jìn)行進(jìn)化樹分析[21]。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

收集轉(zhuǎn)染后的DPC，用Trizol法提取總RNA，并通過HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR合成cDNA第一鏈，cDNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于qRT-PCR試驗(yàn)，使用ChamQTM SYBR?qPCR Master Mix配置PCR體系，由QuantStudio?5上機(jī)操作，引物序列見表1。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2019整理數(shù)據(jù)，2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。利用SPSS 25.0進(jìn)行差異分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，試驗(yàn)中至少設(shè)計(jì)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，結(jié)果使用“平均值±SD”表示。

2 結(jié) 果

2.1 KRT16的克隆和生物信息學(xué)分析

由試驗(yàn)結(jié)果可知，KRT16基因CDS為1 431 bp，共編碼476個(gè)氨基酸，其分子式為C2207H3544N652O749S18，分子量為51.77 ku，理論等電位為5.08。不穩(wěn)定系數(shù)為63.48，表明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。利用ProtoScal在線軟件對(duì)蛋白進(jìn)行親/疏水性分析，結(jié)果見圖1A。由圖1A可知，第93位的苯丙氨酸疏水性最強(qiáng)，第150位的谷氨酰胺親水性最強(qiáng)，親水系數(shù)均值為-0.545，說明KRT16為親水蛋白。UniProt預(yù)測(cè)KRT16蛋白主要定位于細(xì)胞骨架。NetPhos 3.1 Server預(yù)測(cè)結(jié)果如圖1B所示，KRT16蛋白存在69個(gè)磷酸化位點(diǎn)：52個(gè)絲氨酸(Ser)，12個(gè)蘇氨酸(Thr)，5個(gè)酪氨酸(Tyr)。NetOGlyc 4.0預(yù)測(cè)KRT16蛋白 O-糖基化位點(diǎn)有21個(gè)。NetNGlyc 1.0 Server預(yù)測(cè)KRT16蛋白不存在 N-糖基化位點(diǎn)(圖1C)。SignalP 4.0和TMHMM 2.0預(yù)測(cè)，KRT16蛋白不包含跨膜區(qū)(圖1D)和信號(hào)肽(圖1E)。

A. KRT16蛋白的親水性預(yù)測(cè)；B. KRT16蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)； C. KRT16蛋白的N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)； D. KRT16蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；E.KRT16蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)A. Prediction of hydrophilicity of KRT16 protein; B. Prediction of phosphorylation sites of KRT16 protein; C. Prediction of N-glycosylation sites of KRT16 protein; D. Transmembrane domain prediction of KRT16 protein; E. Signal peptide prediction of KRT16 protein圖1 KRT16蛋白的生物信息學(xué)分析Fig.1 Bioinformatics analysis of KRT16 protein

2.2 KRT16蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

KRT16的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，α-螺旋占61.76%，延伸鏈占7.77%，β轉(zhuǎn)角占3.15%，無規(guī)則卷曲占27.31%(圖2A)。KRT16三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)為一條螺旋鏈(圖2B)。KRT16蛋白的交聯(lián)作用利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析(圖2C)，結(jié)果表明KRT16與KRT1、KRT5、KRT17、DSG1蛋白等存在互作關(guān)系。

A. KRT16蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；B. KRT16蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；C. KRT16及其相關(guān)蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)A. Secondary structure prediction of the KRT16 protein; B. Tertiary structure prediction of KRT16 protein; C. Interaction network of KRT16 and its related proteins圖2 KRT16蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及互作蛋白Fig.2 KRT16 structural prediction and PPI network

2.3 KRT16基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析

利用MEGA X軟件，將家兔KRT16基因序列與中國(guó)倉(cāng)鼠(Cricetulusgriseus)、小鼠(Musmusculus)、河貍(Castorcanadensis)、北美鼠兔(Ochotonaprinceps)、人(Homosapiens)、家貓(Feliscatus)、狗(Canislupusfamiliaris)及水牛(Bubalusbubalis)的KRT16基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建(圖3)。結(jié)果顯示，兔和北美鼠兔形成一個(gè)分支，同源性達(dá)到76%。

圖3 不同物種間KRT16基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of KRT16 and other homologous sequences

2.4 KRT16在不同毛囊發(fā)育周期的表達(dá)分析

qRT-PCR結(jié)果顯示(圖4)，KRT16在毛囊周期同期化后的生長(zhǎng)期表達(dá)量最高，顯著高于退行期(P<0.05)，極顯著高于休止期(P<0.01)，由此說明KRT16在毛囊生長(zhǎng)期高表達(dá)。KRT16的表達(dá)水平隨時(shí)間變化而變化，提示其參與毛囊周期性發(fā)育。

*.表示差異顯著(P<0.05)，**.表示差異極顯著(P<0.01)，下同*.indicates the significant difference (P<0.05), **. indicates the extremely significant difference (P<0.01)，the same as below圖4 KRT16在長(zhǎng)毛兔不同毛囊發(fā)育周期中的表達(dá)量變化Fig.4 The expression level of KRT16 mRNA during the hair follicle cycle and skin development in Angora rabbits

2.5 KRT16對(duì)毛囊發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

將pcDNA3.1-KRT16過表達(dá)載體和siRNA-KRT16轉(zhuǎn)染至DPC中，qRT-PCR結(jié)果表明pcDNA3.1-KRT16能夠極顯著上調(diào)KRT16基因的表達(dá)量(P<0.01，圖5A)，siRNA-KRT16能夠極顯著下調(diào)KRT16基因的表達(dá)量(P<0.01，圖5C)，提示過表達(dá)載體和siRNA轉(zhuǎn)染成功。同時(shí)發(fā)現(xiàn)(圖5B、5D)，過表達(dá)KRT16后，SFRP2和TGFβ1基因的mRNA表達(dá)量極顯著下降(P<0.01)，BCL2、CCND1、EGF、LEF1和CTNNB1基因的mRNA表達(dá)量極顯著提高(P<0.01)；而敲減KRT16后，SFRP2和TGFβ1基因的表達(dá)量極顯著提高(P<0.01)，BCL2、CCND1、EGF、LEF1和CTNNB1基因的表達(dá)量極顯著下降(P<0.01)。由此可知，KRT16基因能夠調(diào)控毛囊生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)。

A. pcDNA3.1-KRT16極顯著上調(diào)DPC中KRT16 mRNA表達(dá)水平；B. pcDNA3.1-KRT16對(duì)毛囊發(fā)育相關(guān)基因的影響；C. siRNA-KRT16極顯著下調(diào)DPC中KRT16 mRNA表達(dá)水平；D siRNA-KRT16對(duì)毛囊發(fā)育相關(guān)基因的影響A. pcDNA3.1-KRT16 significantly increased the expression of the KRT16 mRNA level in DPC; B. Effects of pcDNA3.1-KRT16 on the expression levels of hair follicle development related genes; C. siRNA-KRT16 significantly reduced the expression of the KRT16 mRNA level in DPC; D. Effects of siRNA-KRT16 on the expression levels of hair follicle development related genes圖5 KRT16對(duì)毛囊發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.5 Effects of KRT16 on the expression levels of hair follicle development related genes

2.6 KRT16促進(jìn)DPC增殖

DPC中過表達(dá)和敲減KRT16，通過CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。結(jié)果表明，在細(xì)胞處理后的0和24 h，細(xì)胞增殖無明顯差異。轉(zhuǎn)染48 h后，與對(duì)照組相比，過表達(dá)KRT16極顯著促進(jìn)DPC增殖(P<0.01)，而敲低KRT16顯著抑制DPC的增殖(P<0.05)(圖6)。

A. pcDNA3.1-KRT16對(duì)DPC細(xì)胞增殖的影響；B. siRNA-KRT16對(duì)DPC細(xì)胞增殖的影響A. Effects of pcDNA3.1-KRT16 on DPC proliferation; B. Effects of siRNA-KRT16 on DPC proliferation圖6 KRT16對(duì)DPC增殖的影響Fig.6 Effects of KRT16 on DPC proliferation

3 討 論

角蛋白作為上皮細(xì)胞骨架的主要成分，最初僅被認(rèn)為參與維持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，而隨著對(duì)角蛋白研究的深入，越來越多的研究表明角蛋白參與細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等多種生命活動(dòng)[22]。KRT16在疾病中的研究較為廣泛，與銀屑病、先天性厚甲癥和掌跖角化癥有著密切聯(lián)系[23-24]。已有研究表明，KRT16受到miR-31的靶向調(diào)控，調(diào)節(jié)皮膚和毛囊基因的表達(dá)與毛囊周期變化[25]；EGF可以通過轉(zhuǎn)錄因子Sp1和c-Jun誘導(dǎo)KRT16表達(dá)，而EGF可以促進(jìn)DPC增殖，并通過調(diào)控細(xì)胞信號(hào)途徑改變細(xì)胞周期，進(jìn)而影響毛發(fā)的生長(zhǎng)[26]；Hox13與KRT16互相作用，有研究表明Hoxc13通過調(diào)節(jié)角蛋白分化影響毛囊生長(zhǎng)[27]。

本研究中，KRT16的表達(dá)量在生長(zhǎng)期最高，由此說明KRT16在生長(zhǎng)期處于高表達(dá)水平。獲取完整的兔KRT16 CDS后，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析顯示，KRT16 CDS包含一個(gè)1 431 bp的ORF，編碼476個(gè)氨基酸。KRT16是一種親水蛋白，主要存在于細(xì)胞骨架中，且由α螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)成。通過預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，KRT16蛋白磷酸化和糖基化位點(diǎn)豐富，說明KRT16可能參與細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡，化學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)等重要過程。此外，系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，兔KRT16在進(jìn)化樹上最接近于北美鼠兔。另外，KRT16與KRT17、KRT1和KRT5等蛋白存在互作關(guān)系。已有研究表明，KRT1和KRT5在毛囊生長(zhǎng)期表達(dá)量最高，可能促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)發(fā)育[28]。KRT17同樣對(duì)毛囊生長(zhǎng)有著重要作用，在小鼠中敲除KRT17出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象[29]。在本研究中，過表達(dá)KRT16能夠顯著上調(diào)BCL2、CCND1、CTNNB1、LEF1、和EGF表達(dá)，敲減KRT16能夠顯著下調(diào)它們表達(dá)；過表達(dá)KRT16顯著下調(diào)TGFβ1和SFRP2表達(dá)，敲減KRT16顯著上調(diào)它們的表達(dá)。其中，SFRP2作為Wnt調(diào)節(jié)劑，在毛囊發(fā)育中有著重要作用，并且可以通過抑制Wnt活性來抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖[30]。TGFβ1是一種多功能因子，對(duì)大多數(shù)細(xì)胞的生長(zhǎng)起到抑制作用，并且已有研究發(fā)現(xiàn)TGFβ1在毛囊退行期高表達(dá)[31-32]。Wnt/CTNNB1信號(hào)通路是經(jīng)典的信號(hào)通路，主要參與毛囊生長(zhǎng)調(diào)節(jié)，CTNNB1還是細(xì)胞膜標(biāo)志蛋白質(zhì)，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞間黏附[33]。LEF1被認(rèn)為是毛囊正常發(fā)育以及促進(jìn)毛母質(zhì)細(xì)胞分化所必需的轉(zhuǎn)錄因子[33-34]。EGF因子大量分布在表皮、真皮與表皮結(jié)合處，是一種外源性調(diào)節(jié)因子，具有調(diào)控毛囊生長(zhǎng)的作用，促進(jìn)上皮細(xì)胞繁殖，并且有研究表明EGF可以誘導(dǎo)KRT16表達(dá)[34-35]。CCND1是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，同時(shí)也是抑凋亡基因，對(duì)細(xì)胞增殖起到促進(jìn)作用。BCL2也同樣是抑凋亡基因，有研究表明BCL2能夠在毛囊各個(gè)時(shí)期皆有表達(dá)，并能調(diào)節(jié)毛囊細(xì)胞的凋亡[36-40]。KRT16能夠上調(diào)CCND1與BCL2的表達(dá)，提示KRT16能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖。另外，KRT16的敲低能夠降低肺腺癌癌胞的體外遷移、侵襲和增殖能力，并能降低角質(zhì)形成細(xì)胞的存活率[41]。本研究中，KRT16能夠促進(jìn)DPC增殖，說明KRT16能夠調(diào)控DPC的細(xì)胞活動(dòng)，從而影響毛囊周期性再生。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)成功克隆得到了兔KRT16基因，KRT16基因的編碼序列全長(zhǎng)1 431 bp，可編碼476個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)KRT16蛋白為親水蛋白，存在69個(gè)磷酸位點(diǎn)和21個(gè)O-糖基化位點(diǎn)。在毛囊發(fā)育周期中，KRT16在毛囊生長(zhǎng)期高表達(dá)，并能調(diào)控毛囊生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因，促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞增殖。本研究通過對(duì)KRT16基因功能的初步研究，為毛囊發(fā)育的基礎(chǔ)研究提供參考，同時(shí)為長(zhǎng)毛兔毛囊發(fā)育相關(guān)基因的功能研究提供依據(jù)。