牛乃琪，蘇艷芳，楊 曼，侯欣華，王立剛，張龍超

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育從一個(gè)單細(xì)胞到一個(gè)獨(dú)立的個(gè)體，是通過高度復(fù)雜而又協(xié)調(diào)的機(jī)制在時(shí)間和空間上共同發(fā)揮作用的，其中一個(gè)關(guān)鍵階段就是脊椎軸向骨骼的形成。在胚胎發(fā)育過程中，體節(jié)是軸向骨骼形成的前提，最初的體節(jié)是由中胚層分化形成，并在形態(tài)上是相似的，但它們具有沿體軸方向的解剖學(xué)特征。最終形成具有復(fù)雜特征的枕骨、頸椎、胸椎、腰椎、薦椎和尾椎[1-3]。在物種內(nèi)每個(gè)域中的椎骨數(shù)量是固定的，但在物種之間每個(gè)域中的椎骨數(shù)量各不相同，從而產(chǎn)生了特定于物種的軸向公式[4]。而豬是為數(shù)不多的胸、腰椎數(shù)可變的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物之一[5]。豬胸、腰椎總數(shù)與胴體性狀相關(guān)性較強(qiáng)，研究表明隨著胸、腰椎數(shù)的增加，胴體長(zhǎng)[6]和胴體重[7]也隨之增加。

體節(jié)作為脊椎形成最重要的前體結(jié)構(gòu)，在形成過程中受到多個(gè)基因及基因家族的調(diào)節(jié)，包括時(shí)鐘基因Hes7[8]和Lfng[9]，以及Hox基因家族[10]等。其中Homeobox(Hox)基因在組織特性規(guī)范中起關(guān)鍵作用，其表達(dá)受到嚴(yán)格的時(shí)間調(diào)控，賦予了軸向特性，還可以控制肢芽的位置，形成側(cè)板中胚層，因此，Hox基因的表達(dá)指定了解剖學(xué)上不同的脊柱亞型[2]。Hox基因被認(rèn)為在脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)生過程中參與前后軸(a-p)模式[11]，在生物體的軸向發(fā)育模式中起著重要作用[12]。哺乳動(dòng)物有將近40個(gè)Hox基因家族成員，分成4個(gè)簇：HoxA、HoxB、HoxC和HoxD，這些基因的形成主要是通過祖先簇的重復(fù)以及隨后的基因丟失或重復(fù)引起[13]。Hox基因具有相似的序列和相對(duì)位置被劃分為13個(gè)組，13組基因在簇內(nèi)的位置具有功能相關(guān)性，反映了基因在前后軸上的時(shí)間和空間表達(dá)順序，這一特征稱為共線性[14]。脊椎動(dòng)物的Hox簇在組中是緊湊的，具有統(tǒng)一的轉(zhuǎn)錄方向，共線Hox基因的激活被翻譯成沿軸的空間表達(dá)模式[15]。其中HoxB簇基因在不同發(fā)育階段和多個(gè)組織中的表達(dá)存在空間共線性[16]。HoxB簇基因共包含10個(gè)基因(HoxB1-9和HoxB13)。前期本團(tuán)隊(duì)對(duì)北京黑豬進(jìn)行GWAS和GO富集分析將HoxB1-7、HoxB9和HoxB13作為影響脊椎數(shù)的候選基因[17]。

北京黑豬是1960年由巴克夏、大白和中國(guó)地方豬種雜交形成的一個(gè)培育豬種[18]，在北方豬肉市場(chǎng)中占有重要地位，但是北京黑豬在Hox基因多態(tài)性與性狀的關(guān)聯(lián)分析方面未見報(bào)道。本研究對(duì)HoxB簇中9個(gè)基因所有外顯子區(qū)進(jìn)行PCR及測(cè)序檢測(cè)突變位點(diǎn)并將其與表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以期探索影響性狀變異候選基因功能位點(diǎn)，為性狀變異遺傳機(jī)理的闡釋奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)群體

北京黑豬群體均飼養(yǎng)在北京黑六牧業(yè)科技有限公司，共251頭個(gè)體，所有豬健康狀況良好。管理方式和飼喂方式均一致。251頭北京黑豬于220日齡在北京二商集團(tuán)有限責(zé)任公司進(jìn)行屠宰，在屠宰中收集其組織樣本并記錄脊椎數(shù)和胴體性狀(胴體長(zhǎng)、胴體斜長(zhǎng)、胴體直長(zhǎng)和胴體重)。

1.2 DNA提取及檢測(cè)

使用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒進(jìn)行組織樣品的DNA提取，使用IMPLEN超微量分光光度計(jì)進(jìn)行DNA質(zhì)量檢測(cè)(DNA濃度、核酸與蛋白及酚類物質(zhì)最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)比值(OD260 nm/OD280 nm)、核酸與碳水化合物最高吸收峰的波長(zhǎng)比值(OD260 nm/OD230 nm)的檢測(cè))，并用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行DNA質(zhì)檢，檢測(cè)合格的DNA樣品用于后期試驗(yàn)。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

本試驗(yàn)的引物均使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，引物序列均由賽默飛(ThermoFisher)合成。本研究設(shè)計(jì)9個(gè)基因(HoxB1 (ENSSSCT0000 0019086.4)、HoxB2 (ENSSSCT00000019087.4)、HoxB3 (ENSSSCT00000019088.4)、HoxB4 (EN SSSCT00000019089.5)、HoxB5 (ENSSSCT00000 019094.5)、HoxB6 (ENSSSCT00000019093.5)、HoxB7 (ENSSSCT00000019092.4)、HoxB9 (ENS SSCT00000101474.1)、HoxB13 (ENSSSCT00-000019095.5))共45對(duì)引物，其中檢測(cè)到SNPs的引物有6對(duì)(表1)。

表1 引物信息Table 1 Information of primers

1.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

使用諾唯贊(Code：P505-d1，Vazyme)的高保真酶進(jìn)行PCR，本試驗(yàn)對(duì)251頭北京黑豬個(gè)體采用25 μL反應(yīng)體系(2×Phanta Max Buffer 12.5 μL，0.5 μL 聚合酶，0.5 μL dNTP，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，8.5 μL 無菌水，1 μL 模板)進(jìn)行PCR。程序如下(ABI, Singapore)：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，57～62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30～90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min。PCR產(chǎn)物通過切膠回收單一條帶在北京六合華大基因科技有限公司平臺(tái)進(jìn)行雙向Sanger測(cè)序。

1.5 基因分型及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

將測(cè)序結(jié)果使用SeqMan進(jìn)行基因分型，使用Microsoft Excel 2016進(jìn)行基因型頻率和等位基因頻率的統(tǒng)計(jì)。采用SAS軟件的GLM程序，以基因型為固定效應(yīng)，采用單因素方差分析(ANOVA)分析基因型效應(yīng)。動(dòng)物模型如下:Y=μ+基因型+e，其中Y為表型值，μ為共同均值，e為隨機(jī)誤差。采用Duncan’s多重檢驗(yàn)估計(jì)不同基因型間最小二乘均值(LSM)的差異。數(shù)據(jù)使用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05判定為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 北京黑豬脊椎數(shù)和胴體性狀的表型統(tǒng)計(jì)

251頭北京黑豬個(gè)體的表型值(脊椎數(shù)和胴體性狀)見表2，脊椎數(shù)的均值為20.95節(jié)，變異系數(shù)為2.67%；胴體長(zhǎng)的均值為98 cm，變異系數(shù)為5.19%；胴體直長(zhǎng)的均值為89.74 cm，變異系數(shù)為4.83%；胴體斜長(zhǎng)的均值為76.06 cm，變異系數(shù)為4.38%；胴體重的均值為64.37 kg，變異系數(shù)為12.47%。

表2 脊椎數(shù)和胴體性狀的表型值統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of phenotypic values of the vertebral number and carcass traits

2.2 北京黑豬HoxB1-7、HoxB9和HoxB13基因的多態(tài)性檢測(cè)及基因型頻率和等位基因頻率分析

通過對(duì)HoxB簇中9個(gè)基因的mRNA序列進(jìn)行變異位點(diǎn)檢測(cè)共發(fā)現(xiàn)12個(gè)SNPs(表3)均在UTR區(qū)，其中1個(gè)5′UTR突變(HoxB2)，11個(gè)3′UTR突變分別在HoxB5、HoxB9、HoxB13中(表3)。這12個(gè)突變位點(diǎn)的等位基因頻率變化范圍為4%～96%，其基因型頻率變化范圍為1%～93%。

表3 北京黑豬HoxB2、HoxB5、HoxB9和HoxB13的基因型頻率及等位基因頻率統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistics of genotype and allele frequencies of HoxB2, HoxB5, HoxB9 and HoxB13 in Beijing black pigs

2.3 北京黑豬HoxB1-7、HoxB9和HoxB13基因的12個(gè)SNPs與脊椎數(shù)和胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析

本研究將HoxB簇中的9個(gè)基因通過PCR擴(kuò)增及變異檢測(cè)篩選到12個(gè)(1個(gè)HoxB2基因5′UTR，2個(gè)HoxB5基因3′UTR，2個(gè)HoxB9基因3′UTR，7個(gè)HoxB13基因3′UTR)SNPs與脊椎數(shù)和胴體性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果見表4。HoxB2上的1個(gè)5′UTR突變c.40 C>T、HoxB5上的2個(gè)3′UTR突變c.1766 A>G、c.1767 A>G與性狀關(guān)聯(lián)不顯著；HoxB9上的2個(gè)3′UTR突變中c.2743 C>T與胴體性狀關(guān)聯(lián)顯著，其中CT基因型對(duì)應(yīng)的胴體性狀有優(yōu)勢(shì)，而c.2254 A>G與性狀關(guān)聯(lián)不顯著；HoxB13上的7個(gè)3′UTR突變中c.1863 G>A、c.1440 A>C與脊椎數(shù)性狀顯著關(guān)聯(lián)，兩個(gè)位點(diǎn)中AA基因型對(duì)應(yīng)的脊椎數(shù)更有優(yōu)勢(shì)，而c.1736 G>A、c.1444 G>C、c.1433 A>C、c.1310 A>G及c.1221 G>A與性狀關(guān)聯(lián)不顯著。

表4 HoxB2、HoxB5、HoxB9和HoxB13基因5個(gè)SNPs與脊椎數(shù)和胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析Table 4 The association analysis of 5 SNPs of HoxB2,HoxB5,HoxB9 and HoxB13 genes with vertebral number and carcass traits

3 討 論

豬的脊椎數(shù)作為一個(gè)高遺傳力的有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的優(yōu)良性狀，一直以來都受到研究者的高度青睞。研究者利用QTL定位和GWAS技術(shù)在豬的多個(gè)經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了大量的QTLs[19]。豬QTL數(shù)據(jù)庫共記錄34 333個(gè)QTLs(http://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/index，2021年12月27日)，其中對(duì)于脊椎數(shù)的研究顯示，QTLs主要集中在SSC1和SSC7上，而對(duì)于胴體長(zhǎng)和胴體重每條染色體上都存在QTL。Mikawa等[20]通過對(duì)3個(gè)F2群體進(jìn)行最小二乘區(qū)間映射分析，發(fā)現(xiàn)SSC1和SSC7上存在與脊椎數(shù)相關(guān)的QTL。大量的研究表明，影響脊椎數(shù)變異的QTL主要集中在SSC7上[21]。對(duì)于胴體性狀也進(jìn)行了大量的QTL定位和GWAS研究，發(fā)現(xiàn)QTL在SSC7上也有定位[22-24]。但在北京黑豬的GWAS結(jié)果中除了SSC7上出現(xiàn)了經(jīng)典的QTL以外，在SSC12上出現(xiàn)了一個(gè)新的QTL，并且在QTL中定位到了HoxB簇的9個(gè)基因?yàn)橛绊懠棺禂?shù)變異的候選基因[17]。

每簇的3′端Hox基因首先表達(dá)，而更多的5′端Hox基因在稍后時(shí)間表達(dá)，這種現(xiàn)象被稱為“時(shí)間共線性”[25]。Hox基因在動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中調(diào)節(jié)軸向區(qū)域特征，最初在原腸胚形成期間被激活。HoxB 簇包含10個(gè)基因，HoxB1-9和HoxB13。HoxB簇基因中缺失90 kb的小鼠表現(xiàn)出一系列有序的沿頸椎和胸椎柱的單節(jié)前部同源異位轉(zhuǎn)化以及胸骨形態(tài)發(fā)生缺陷[26]。在雞胚中，對(duì)HoxB簇基因的研究表明，HoxB1-3基因均在原始條紋附近表現(xiàn)出更高水平的表達(dá)，而在周圍細(xì)胞中表達(dá)水平逐漸降低[16]；HoxB5基因表達(dá)模式與其他HoxB簇基因顯著不同，它始于后原始條紋，隨后沿條紋向前延伸；HoxB8基因沿原始條紋和Hensen節(jié)點(diǎn)表達(dá)，偶爾以不對(duì)稱方式表達(dá)；且HoxB9與HoxB8基因表達(dá)非常相似。研究表明，HoxB9基因在Alpha5 亞基缺陷小鼠的胚胎中表達(dá)減少，Alpha5beta1纖連蛋白的互作對(duì)于中胚層衍生物的維持以及某些神經(jīng)嵴細(xì)胞的存活至關(guān)重要，影響了中胚層的發(fā)育[27]。并且HoxB9基因還對(duì)體節(jié)發(fā)育中胸腔的形成以及前肢的發(fā)育有重要作用[28-30]。HoxB13基因在主動(dòng)終止沿前后軸的后延伸中至關(guān)重要[31-34]。此外，HoxB13基因敲除對(duì)于小鼠體節(jié)的增加有顯著影響[35]。同時(shí)將其啟動(dòng)子進(jìn)行過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎缺失大部分甚至全部尾巴[31]。因此，先前大量的研究均表明Hox家族在發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，從原腸胚形成階段開始，到胚胎前后軸的形成、肢體發(fā)育以及器官形成都起到關(guān)鍵作用[15，30，36-37]。因此，本研究對(duì)北京黑豬SSC12上HoxB簇的9個(gè)基因進(jìn)行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)在mRNA的5′和3′UTRs存在SNPs。其中，有個(gè)通常高度保守的從幾個(gè)到幾百個(gè)核苷酸不等的3′UTRs[38]。儲(chǔ)存在3′UTRs中的遺傳信息可以通過3′UTRs介導(dǎo)的蛋白質(zhì)互作(PPI)的形成傳遞給蛋白質(zhì)[39]。高度保守的序列特征表明3′UTRs具有重要的調(diào)控作用，如mRNA的定位、mRNA的穩(wěn)定性和翻譯等占有重要地位；另一方面，3′UTRs存在異構(gòu)體，可以用來區(qū)分高度相似的蛋白質(zhì)功能[40]。

先前對(duì)于HoxB簇基因進(jìn)行了多態(tài)性研究，對(duì)東亞人HoxB簇基因多態(tài)性與牙齒和咬合特征進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析[41]。對(duì)HoxB13基因的多態(tài)性進(jìn)行探索也發(fā)現(xiàn)了與前列腺癌關(guān)聯(lián)的SNPs[42]。對(duì)肺癌的研究中，在HoxB2基因中也發(fā)現(xiàn)了與其關(guān)聯(lián)顯著的SNPs[43]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)3′UTRs存在與脊椎數(shù)和胴體性狀顯著相關(guān)的SNPs。本研究在HoxB9基因的3′UTR中通過關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP(c.2743 C>T)與胴體性狀關(guān)聯(lián)顯著。因此，HoxB13基因?qū)η昂筝S的完成有至關(guān)重要的作用，主要是在主動(dòng)終止沿前AP軸的后延伸[31-34]。但在本研究中對(duì)其兩個(gè)外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增及關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，3′UTR中2個(gè)SNPs(c.1863 G>A、c.1440 A>C)與脊椎數(shù)性狀關(guān)聯(lián)顯著，與胴體性狀關(guān)聯(lián)不顯著。

4 結(jié) 論

在北京黑豬群體中，HoxB9基因上的c.2743 C>T位點(diǎn)與胴體性狀關(guān)聯(lián)顯著，HoxB13基因中c.1863 G>A、c.1440 A>C與脊椎數(shù)性狀關(guān)聯(lián)顯著。這3個(gè)位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)為豬脊椎數(shù)和胴體性狀的分子標(biāo)記輔助選育工作提供了基礎(chǔ)。