鄧敏兒，李 娜，郭亞瓊，馮耀宇，肖立華

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642)

原生動(dòng)物包含許多人獸共患和重大動(dòng)物疫病寄生蟲，嚴(yán)重影響人類和動(dòng)物健康。由于生活史復(fù)雜，不少寄生蟲缺乏完成整個(gè)生活史的體外培養(yǎng)技術(shù)，原蟲的功能基因組學(xué)和分子生物學(xué)研究因此受阻。1993年，弓形蟲[1-2]和瘧原蟲[3]被報(bào)道可以利用同源重組實(shí)現(xiàn)報(bào)告基因的表達(dá)，此后其他原蟲的反向遺傳學(xué)工作平臺也逐步建立。最近20年，原蟲的反向遺傳學(xué)研究取得長足進(jìn)展。通過設(shè)置同源臂的方法，同源重組技術(shù)為原蟲的基因定位、功能研究、抗原篩選等研究提供有力支持[4]。但同源重組的基因編輯系統(tǒng)存在轉(zhuǎn)染效率較低、需要的同源臂較長、篩選過程時(shí)間長的問題。有的原蟲(如隱孢子蟲)基因組小，缺乏同源重組修復(fù)系統(tǒng)，較難開發(fā)同源重組基因編輯體系。

CRISPR(成簇的規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列)是在細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一種天然存在的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，其作用是破壞噬菌體和質(zhì)粒等外源DNA序列[5-7]。最早研究的源自化膿鏈球菌的Cas9蛋白(SpCas9，最初被命名為CSN1)是目前最常用的Cas9蛋白。此外，2017年報(bào)道源自金黃色葡萄球菌的SaCas9蛋白在克氏錐蟲基因編輯中達(dá)到幾乎100%的基因敲除效率。2012年2個(gè)實(shí)驗(yàn)室的工作證明優(yōu)化后的CRISPR/Cas9系統(tǒng)可用于生物的基因編輯，并將該系統(tǒng)工作所需的2條RNA進(jìn)一步簡化為一條向?qū)NA(gRNA)，實(shí)現(xiàn)人工設(shè)計(jì)靶向不同基因區(qū)域的gRNA和Cas9蛋白，完成定向高效的DNA雙鏈切割[6-7]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)被《Science》雜志評選為2013年度最重要的科學(xué)突破之一，自應(yīng)用以來在生命科學(xué)領(lǐng)域大放異彩，在寄生蟲研究上也從瘧原蟲和弓形蟲，逐步推廣到在利什曼原蟲、隱孢子蟲和艾美耳球蟲等的應(yīng)用。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在人工設(shè)計(jì)的前提下，完成定向DNA雙鏈斷裂(DSB)，供體的模板質(zhì)粒只需更短的同源臂，即可完成準(zhǔn)確高效的基因編輯。該系統(tǒng)還可針對多基因家族[8]，利用少量的gRNA完成高通量全基因組篩查工作，是寄生蟲的基因功能研究強(qiáng)有力的工具。本文將從CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作原理和目前在寄生原蟲中的主要應(yīng)用進(jìn)行介紹。

1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)工作原理

在CRISPR/Cas9系統(tǒng)出現(xiàn)之前，原蟲的基因編輯主要通過同源重組的方式實(shí)現(xiàn)。將帶有一定長度(一般至少400 bp)同源臂的目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入寄生蟲，利用同源重組讓目的基因插入原蟲基因組同源臂中，從而實(shí)現(xiàn)基因編輯[9]。該方法所需時(shí)間長，轉(zhuǎn)染效率低(雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的效率更低)，藥物篩選耗時(shí)較長，一般只能進(jìn)行單基因的研究。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)分為I型、II型和III型，其中III型在基因編輯上應(yīng)用最廣泛——主要通過Cas9蛋白對目標(biāo)DNA雙鏈切割。2013年，CRISPR/Cas9系統(tǒng)被簡化為只需要Cas9蛋白和20 bp的gRNA即可完成定向DNA編輯[6-7]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)工作原理及修復(fù)機(jī)制如圖1所示，其中DNA雙鏈斷裂修復(fù)主要通過3個(gè)機(jī)制：1)同源直接修復(fù)(homologous direct repair，HDR)。當(dāng)存在具有斷裂位點(diǎn)上下游同源臂的DNA時(shí)，以此為模板進(jìn)行修復(fù)。2)非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)。當(dāng)缺少供體模板時(shí)，在兩個(gè)斷口直接連接。3)微同源末端連接(microhomology-mediated end joining，MMEJ)。利用微同源小片段切除非同源的單鏈DNA，斷口處直接連接。

圖1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)工作原理及修復(fù)機(jī)制Fig.1 Principle and repair mechanism of the CRISPR/Cas9 system

除常用的電轉(zhuǎn)含有Cas9和gRNA質(zhì)粒的方法外，還可以將Cas9蛋白和gRNA復(fù)合物直接轉(zhuǎn)入寄生蟲體內(nèi)。后者在克氏錐蟲中達(dá)到轉(zhuǎn)染效率接近100%的效果[10]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)顯著提高原蟲的轉(zhuǎn)染效率，并且可通過建立gRNA文庫的方式，完成雙基因、甚至多基因的研究，為多基因家族功能研究提供高通量快速篩查的高效準(zhǔn)確工具。

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在原蟲中的應(yīng)用

寄生原蟲基于CRISPR/Cas9的基因編輯技術(shù)開展較早，可追溯到20世紀(jì)80年代末、90年代初[1-3, 11-16]。2014年Shen等[17]和Zhang等[18]分別將CRISPR/Cas9技術(shù)引入弓形蟲和克氏錐蟲的反向遺傳學(xué)研究，自此CRISPR/Cas9系統(tǒng)逐漸在研究原蟲的基因定位、基因敲除、基因家族高通量篩選等方面嶄露頭角[19-60](部分原蟲基因編輯技術(shù)發(fā)展情況見圖2)。與傳統(tǒng)的同源重組技術(shù)相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)不僅具有轉(zhuǎn)染效率更高、周期更短、準(zhǔn)確性更高等優(yōu)點(diǎn)，并且可在較短的時(shí)間內(nèi)對同源性高的基因家族進(jìn)行高通量篩選。此外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可結(jié)合多種反向遺傳學(xué)研究策略，如利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)標(biāo)記關(guān)鍵基因[19]、結(jié)合類植物生長素誘導(dǎo)條件性降解系統(tǒng)(auxin-inducible degron，AID)[20]研究必需基因的功能和表型、利用改良的CRISPR/dCas9系統(tǒng)進(jìn)行表觀遺傳學(xué)研究[21-22]等，顯著擴(kuò)展其應(yīng)用領(lǐng)域，為假定基因的功能研究提供高效工具。

月亮、太陽和星星標(biāo)記分別代表瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和CRISPR/Cas9技術(shù)[1-3,9,11-13,15-19,23-24,49-63]Moon, sun, and star shapes indicate transient, stable transfection, and CRISPR/Cas9-based editing, respectively[1-3,9,11-13,15-19,23-24,49-63]圖2 部分原蟲基因編輯技術(shù)發(fā)展時(shí)間線Fig.2 Timeline of the development of genetic manipulation methods in some parasitic protozoa

2.1 瘧原蟲

2014年，2個(gè)研究團(tuán)隊(duì)分別報(bào)道了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在瘧原蟲上的應(yīng)用。Wagner等[23]利用T7 RNA聚合酶產(chǎn)生的sgRNA和Cas9蛋白對惡性瘧原蟲的基因組進(jìn)行編輯，分別靶向富含組氨酸的疣狀突起相關(guān)蛋白基因(kahrp)和紅細(xì)胞結(jié)合抗原175基因(eba-175)，證實(shí)該系統(tǒng)在惡性瘧原蟲上具有較高的基因編輯效率(50%～100%)。惡性瘧原蟲缺乏NHEJ途徑，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可顯著提高瘧原蟲的基因編輯效率。

同年，Ghorbal等[24]同樣構(gòu)建對惡性瘧原蟲基因編輯的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，利用Cas9質(zhì)粒及含sgRNA和人二氫葉酸還原酶藥篩基因(hdhfr)的供體模板質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的方案，敲除表達(dá)綠熒光的NF54株的egfp基因。此時(shí)Cas9蛋白為瞬時(shí)表達(dá)。3周內(nèi)得到的WR耐藥蟲株P(guān)CR和熒光檢測均證實(shí)egfp基因被成功敲除。供體模板質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)染，證實(shí)與環(huán)形質(zhì)粒幾乎一致的轉(zhuǎn)染效率，而且具有轉(zhuǎn)染4 d后線性化模板自動(dòng)丟失的優(yōu)點(diǎn)，避免供體模板對整合效果檢測的影響。除了靶向egfp基因，同樣的方案應(yīng)用在內(nèi)源性的非必需基因kahrp上得到了相似的效果。后續(xù)研究利用該系統(tǒng)對orc1基因完成不帶標(biāo)簽的定點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)基因敲除的克隆株具有青蒿素抗性。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為強(qiáng)大的基因編輯工具，為瘧原蟲的基因編輯研究提供有力支持。如2015年Nacer等[25]利用該系統(tǒng)鑒定PfVAP1(毒力相關(guān)蛋白1)是惡性瘧原蟲細(xì)胞黏附的關(guān)鍵因素。Mogollon等[26]2016年改良Ghorbal等團(tuán)隊(duì)的研究方法，重新設(shè)計(jì)sgRNA和供體質(zhì)粒，證實(shí)PfVAP1在FCR3瘧原蟲的黏附過程中的作用。Bryant等[27]在2017年使用該系統(tǒng)完成惡性瘧原蟲var2csa基因編輯，發(fā)現(xiàn)缺失內(nèi)含子不影響該基因?qū)φＵ{(diào)控。2019年Xiao等[22]應(yīng)用改良的 CRISPR/dCas9 系統(tǒng)對寄生蟲入侵相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行表觀遺傳調(diào)控，并證明dCas9可以將融合的表觀遺傳調(diào)節(jié)因子[如組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)或去乙?；?HDAC)結(jié)構(gòu)域]，完成惡性瘧原蟲基因過表達(dá)或轉(zhuǎn)錄敲低。同年Mohring等[28]實(shí)現(xiàn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)在諾氏瘧原蟲基因組編輯上的應(yīng)用，但存在同源重組修復(fù)效率低的問題。2021年Boltryk等[29]報(bào)道利用CRISPR/Cas9建立NF54誘導(dǎo)的配子體產(chǎn)生蟲株，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模同步產(chǎn)生定向分化的配子體，為瘧疾傳播階段研究提供寶貴工具。

2.2 弓形蟲

弓形蟲具有較為成熟且容易的體外培養(yǎng)和遺傳研究系統(tǒng)，突變誘導(dǎo)、基因標(biāo)記、基因敲除和基因替換等較其他原蟲容易[8]。同時(shí)弓形蟲具有活躍的NHEJ途徑，DNA隨機(jī)整合效率高，因此降低同源重組的精確性。

Shen等[17]早在2014年對CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行改造，將含有靶向尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(UPRT)基因的sgRNA和Cas9-NLS-GFP的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入I型RH株中，有20%～30%的弓形蟲為Cas9-GFP陽性。UPRT失活可產(chǎn)生氟脫氧核糖(FUDR)抗性，故FUDR耐藥性的噬斑試驗(yàn)證實(shí)約有10%的Cas9-GFP陽性弓形蟲UPRT失活。FUDR耐藥的單克隆蟲株目標(biāo)區(qū)域的基因測序結(jié)果證實(shí)UPRT存在短缺失或插入突變。重復(fù)上述轉(zhuǎn)染試驗(yàn)時(shí)共轉(zhuǎn)包含乙胺嘧啶耐藥基因DHFR的供體質(zhì)粒，同時(shí)用乙胺嘧啶篩選，觀察到70%～100%的乙胺嘧啶抗性寄生蟲同樣抗FUDR。乙胺嘧啶抗性蟲株的單克隆的PCR結(jié)果證實(shí)超過45%的蟲株為DHFR的正確整合，說明該系統(tǒng)能有效增強(qiáng)gRNA靶向區(qū)域的局部重組，提高基因敲除頻率。改變供體質(zhì)粒后重復(fù)試驗(yàn)，成功刪除UPRT基因，說明該系統(tǒng)可同樣應(yīng)用于較大基因區(qū)域的敲除。為研究該系統(tǒng)是否與同源重組的基因編輯相同、存在需要相對較長同源臂的局限性，該團(tuán)隊(duì)將長同源區(qū)域(750～900 bp)、20 bp側(cè)翼區(qū)域和缺乏同源性的dhfr的靶向效率做比較，發(fā)現(xiàn)三者均顯示高于50%的正確整合效率，表明該系統(tǒng)可用于提高特定位點(diǎn)的非同源整合效率。該團(tuán)隊(duì)用靶向絲氨酸蘇氨酸激酶(ROP18)的質(zhì)粒對I型的GT1株的敲除及敲除蟲株的回補(bǔ)試驗(yàn)，證實(shí)該系統(tǒng)可廣泛地應(yīng)用于弓形蟲基因編輯。2017年該團(tuán)隊(duì)優(yōu)化CRISPR/Cas9系統(tǒng)，通過引入突變降低Cas9蛋白毒性，并提供弓形蟲CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用操作指南[30]。

Sibley團(tuán)隊(duì)在2017年報(bào)道2篇CRISPR/Cas9系統(tǒng)和類植物生長素誘導(dǎo)的降解因子(AID)系統(tǒng)在弓形蟲基因功能研究中的應(yīng)用：Long等[31]檢測類鈣調(diào)蛋白(CaM)的功能，證實(shí)CaM與肌凝蛋白(MyoH)共定位，且與弓形蟲入侵密切相關(guān)；Brown等[32]檢測蛋白激酶(PKGs)的功能，證實(shí)PKG I為弓形蟲生長必需蛋白，而PKG I存在的前提下，PKG II為弓形蟲的非必需蛋白。

Sidik等[33]在2014年構(gòu)建包含靶向速殖子表面蛋白基因(sag1)的嵌合體RNA(chiRNA)和帶flag標(biāo)簽帶Cas9蛋白的質(zhì)粒。在未經(jīng)篩選的情況下，RH株的sag1敲除效率約為20%。用缺少NHEJ修復(fù)機(jī)制的ΔKU80株重復(fù)上述試驗(yàn)，寄生蟲數(shù)量與RH株相比減少10倍，而轉(zhuǎn)染效率相當(dāng)。根據(jù)轉(zhuǎn)染替換Cas9成dhfr的相似質(zhì)粒的2種蟲株的噬斑試驗(yàn)對比，進(jìn)一步證明弓形蟲在DNA雙鏈斷裂后依賴NHEJ修復(fù)。該研究還利用較短的同源臂(40 bp)定點(diǎn)插入模板DNA，實(shí)現(xiàn)對內(nèi)源性基因cdpk3的標(biāo)記。該團(tuán)隊(duì)在2016年設(shè)計(jì)gRNA文庫，對弓形蟲基因組進(jìn)行高通量篩選[8]。

Cas9蛋白在弓形蟲中存在內(nèi)在毒性，傳代過程中該基因頻繁丟失，Markus等[34]在2019年發(fā)現(xiàn)優(yōu)化表達(dá)載體和gRNA的設(shè)計(jì)能顯著降低Cas9蛋白的毒性，認(rèn)為gRNA同時(shí)具有基因組靶向、促進(jìn)Cas9蛋白的整合和降低Cas9毒性、提高適應(yīng)性的功能。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)在弓形蟲研究中應(yīng)用以來，已成為弓形蟲高通量篩選[8,35-37]、基因功能驗(yàn)證[38-39]、致病機(jī)制[40-41]、免疫互作[35, 42-44]、代謝分析[45]、藥物機(jī)制[36, 46]、疫苗開發(fā)[47]等研究必不可少的工具，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)的AID系統(tǒng)[20]、轉(zhuǎn)錄抑制(基因條件性敲低)[48]等新工具，為寄生蟲研究提供更廣闊的研究前景。

2.3 艾美耳球蟲

Tang等[57]報(bào)道CRISPR/Cas9系統(tǒng)在柔嫩艾美耳球蟲高效基因編輯的應(yīng)用。首先通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染His4啟動(dòng)子介導(dǎo)的含有黃熒光基因(yfp)標(biāo)記的Cas9質(zhì)粒進(jìn)入子孢子，體外培養(yǎng)24 h觀察到球蟲細(xì)胞核發(fā)黃熒光，證實(shí)His啟動(dòng)子介導(dǎo)的Cas9基因可在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。然后構(gòu)建靶向黃熒光基因的sgRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染已有同時(shí)發(fā)黃熒光和紅熒光的EtER蟲株，在CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用下，轉(zhuǎn)染成功的球蟲內(nèi)因?yàn)辄S熒光基因發(fā)生斷裂而失去黃熒光。經(jīng)過4次傳代和流式細(xì)胞術(shù)篩選，發(fā)現(xiàn)黃熒光陽性比例減少到89.5%，說明缺少供體質(zhì)粒的情況下，球蟲偏向于利用NFEJ途徑進(jìn)行自我修復(fù)。另外還構(gòu)建靶向mic2基因末端的sgRNA質(zhì)粒和帶有紅熒光基因和藥篩基因的供體質(zhì)粒，對野生型球蟲子孢子共轉(zhuǎn)染，并利用PCR和IFA進(jìn)行驗(yàn)證。試驗(yàn)證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可用于球蟲內(nèi)源性基因和外源性基因的基因編輯，但效率遠(yuǎn)低于弓形蟲或瘧原蟲，推測可能是雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染效率低所致。

Hu等[19]利用同源重組技術(shù)成功構(gòu)建在生活史各階段均能穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白的柔嫩艾美耳球蟲株。該蟲株轉(zhuǎn)染不同sgRNA質(zhì)粒，能進(jìn)行高效的球蟲單基因編輯。向該蟲株轉(zhuǎn)染含有靶向外源的黃熒光基因的sgRNA的質(zhì)粒，證實(shí)該系統(tǒng)切割效率可達(dá)29%。接著轉(zhuǎn)染針對內(nèi)源性蛋白EtGRA9的sgRNA和供體質(zhì)粒，為EtGRA9加上熒光標(biāo)記，在共聚焦顯微鏡下發(fā)現(xiàn)EtGRA9標(biāo)記信號存在于囊泡中而不是致密顆粒中，說明EtGRA9屬于分泌蛋白。同時(shí)設(shè)計(jì)靶向AP2家族33個(gè)基因的sgRNA，經(jīng)過6次轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)只有10個(gè)AP2家族的基因被靶向破壞，其中可檢測9個(gè)gRNA(另一個(gè)有效讀數(shù)較低，表明破壞該基因引起蟲體生長缺陷)。該試驗(yàn)證明球蟲AP2家族中，23個(gè)基因在球蟲生長繁殖必不可少，為球蟲AP2家族研究奠定基礎(chǔ)，也證明該工具蟲株可以對球蟲進(jìn)行高效的單基因編輯。

2021年Cheng等[64]報(bào)道FnCas12a/crRNA和RNP技術(shù)可用于柔嫩艾美耳球蟲的基因編輯。該團(tuán)隊(duì)成功靶向組蛋白H4基因?qū)е缕銬NA雙鏈斷裂，另外還利用eYFP標(biāo)記內(nèi)源性EtActin蛋白，觀察不同時(shí)期肌動(dòng)蛋白的定位情況。同年Mohsin等[65]報(bào)道體外試驗(yàn)中Cas9 mRNA與sgRNA結(jié)合可降低卵囊的孢子化率和存活率，為抗球蟲試劑研發(fā)提供新思路。

2.4 錐蟲

克氏錐蟲由于缺少RNAi的機(jī)制，故在功能遺傳學(xué)研究中受到限制。因此，克氏錐蟲的研究需要更強(qiáng)大的反向遺傳學(xué)研究工具。

2014年P(guān)eng等[49]報(bào)道CRISPR/Cas9系統(tǒng)在克氏錐蟲的首次應(yīng)用。構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)綠熒光(GFP)和Cas9(源自化膿鏈球菌)的蟲株后，再分別轉(zhuǎn)入3種靶向gfp的sgRNA。在沒有模板的情況下，克氏錐蟲的Cas9誘導(dǎo)的DSB的修復(fù)缺乏NHEJ途徑，只能通過MMEJ進(jìn)行，產(chǎn)生各種大小的基因缺失。在提供模板tomato標(biāo)記的情況下，CRISPR/Cas9的基因編輯效率比僅用模板質(zhì)粒的同源重組方式更高。除外源性基因gfp的破壞外，還利用CRISPR/Cas9分別成功敲除內(nèi)源性的α-微管蛋白基因、組氨酸裂合酶(HAL)基因和脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FATP)基因。此外，還利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對同源性高的多基因家族進(jìn)行研究，僅設(shè)計(jì)3個(gè)sgRNA即可靶向β-半呋喃糖基糖基轉(zhuǎn)移酶(GAL)家族的65個(gè)基因，3次轉(zhuǎn)染后，63%的gal基因獲得至少1個(gè)靶位點(diǎn)突變，顯著敲低該酶基因家族的表達(dá)，且未觀察到脫靶現(xiàn)象。最后，該研究利用靶向Cas9的sgRNA對Cas9基因破壞，挽救表達(dá)Cas9的蟲株生長缺陷。上述研究證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可快速高效敲除單拷貝或多拷貝基因，但存在蟲株生長速度慢和Cas9活性隨時(shí)間降低的問題。

Lander等[66]在2015年報(bào)道CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)對鞭毛桿蛋白1和2敲除研究，試驗(yàn)結(jié)果亦反映出該系統(tǒng)存在藥物篩選時(shí)間長(數(shù)周)和無法研究必需基因的問題。

Soares等[10]在2017年采取源自金黃色葡萄球菌(SaCas9)的Cas9蛋白和gRNA復(fù)合物電轉(zhuǎn)的方式，建立接近100%轉(zhuǎn)染效率的克氏錐蟲快速基因編輯的系統(tǒng)。首先利用SaCas9/eGFP sgRNA復(fù)合物對表達(dá)綠色熒光的克氏錐蟲進(jìn)行轉(zhuǎn)染，7 d即達(dá)到超過97%寄生蟲的敲除，且對照組gfp自發(fā)損失極小。其中基因敲除效率與gRNA選擇、RNP復(fù)合物濃度及電轉(zhuǎn)次數(shù)有關(guān)。接著構(gòu)建具有SaCas9-egfp/gRNA復(fù)合物，該復(fù)合物大小與SpCas9大致相同且具有Cas9活性，用SaCas9-egfp復(fù)合物轉(zhuǎn)染低于7%，遠(yuǎn)低于SaCas9/gRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率(大于75%)，證實(shí)轉(zhuǎn)染SgCas9/gRNA復(fù)合物無法進(jìn)行基因敲除與Cas9-RNP較大有關(guān)。通過分別轉(zhuǎn)染不同品系和生活史階段的錐蟲，證實(shí)SaCas9/gRNA復(fù)合物可轉(zhuǎn)染錐鞭毛體，轉(zhuǎn)染不同表型和基因型的蟲株效率相當(dāng)。單次轉(zhuǎn)染靶向2個(gè)基因的RNP復(fù)合物，單敲除效率可高達(dá)90%，雙敲除效率為55%。利用含有終止密碼子的修復(fù)模板和RNP，可以使galf這類克氏錐蟲必需單基因敲除時(shí)完成單等位基因敲除。利用RNP和修復(fù)模板分別對NTR和CYP進(jìn)行敲除，再用對應(yīng)的抗性藥物處理，發(fā)現(xiàn)RNP介導(dǎo)的必須基因敲低可應(yīng)用于寄生蟲藥物基因的研究。此外，還可以用RNP和攜帶表達(dá)標(biāo)簽(如HA)的修復(fù)模板對內(nèi)源性基因標(biāo)記，在標(biāo)記的抗體染色和流式細(xì)胞術(shù)的配合下不需藥物篩選，快速高效完成內(nèi)源基因標(biāo)記。SacCas9/sgRNA復(fù)合物可同樣適用于布氏錐蟲和利什曼原蟲的研究。同年，Beneke等[67]報(bào)道建立穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白的布氏錐蟲蟲株，結(jié)合PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可用于基因高效快速的編輯。該技術(shù)亦可應(yīng)用于利什曼原蟲反向遺傳學(xué)研究：該團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9建立鞭毛突變體文庫[68]，研究利什曼原蟲鞭毛蛋白組功能和真核生物的鞭毛運(yùn)動(dòng)。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在克氏錐蟲上成功應(yīng)用，極大加快錐蟲反向遺傳學(xué)研究進(jìn)展。1993年用傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)成功敲除克氏錐蟲[12]，此后20年僅20篇關(guān)于克氏錐蟲的基因編輯報(bào)道。自CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成功應(yīng)用后至今，克氏錐蟲完成基因編輯的基因超過67個(gè)[69]。

2.5 利什曼原蟲

Zhang等[18]在2015年利用杜氏利什曼原蟲的rRNA啟動(dòng)子和肝炎三角洲病毒(HDV)核酶構(gòu)建gRNA表達(dá)載體，與Cas9蛋白轉(zhuǎn)入杜氏利什曼原蟲中，靶向米替福新(MLF)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(LdMT)。LdMT的兩個(gè)等位基因均突變時(shí)，寄生蟲表現(xiàn)為MLF耐藥。從MLF耐藥率可以看出，含有HDV核酶的gRNA質(zhì)粒讓gRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率從0.5%增至12%。對轉(zhuǎn)染后表現(xiàn)MLF耐藥的利什曼原蟲進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)利什曼原蟲以MMEJ而不是NHEJ途徑修復(fù)DSB。對比轉(zhuǎn)染含有終止密碼子的模板質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率提高2～6倍，說明HDR途徑可以顯著改善定點(diǎn)插入的基因編輯能力。用該系統(tǒng)將ble基因定點(diǎn)替換Ldbpk_241510.1基因(一種多藥抗性蛋白樣基因)，博來霉素藥物篩選的陽性蟲株的PCR結(jié)果證明該系統(tǒng)可以定點(diǎn)插入外源蛋白和敲除非必需基因。用同樣的方法靶向必需基因TOR1基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率較低，并只能破壞其中一個(gè)等位基因，說明該系統(tǒng)能部分敲除利什曼原蟲的必需基因。還利用該系統(tǒng)成功在LdMT蛋白的基因位點(diǎn)加上gfp標(biāo)簽，以精確標(biāo)記內(nèi)源性基因。最后，該研究利用錘頭核酶和HDV核酶構(gòu)建效率更高的雙gRNA表達(dá)載體，提高利什曼原蟲基因編輯效率。2017年該團(tuán)隊(duì)優(yōu)化原有基因編輯技術(shù)，構(gòu)建Cas蛋白和gRNA共表達(dá)載體，成功對杜氏利什曼原蟲、碩大利什曼原蟲及墨西哥利什曼原蟲完成基因編輯，并且利用多靶向gRNA實(shí)現(xiàn)對杜氏利什曼原蟲AP2家族的11個(gè)基因敲除[70]。

Sollelis等[51]在2015年構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Cas9的碩大利什曼原蟲株(命名為M756株)，再向M756株轉(zhuǎn)入同時(shí)包含靶向鞭毛桿2基因pfr2(位于鞭毛桿，屬于非必需基因)的gRNA和作為供體的DHFR-Ts藥篩基因。PCR和FISH檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后的M90株屬于陽性和陰性蟲株混合群體。從M90株篩選的8個(gè)克隆種，2個(gè)克隆被鑒定為成功轉(zhuǎn)染的蟲株。為分析CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)，接著對2個(gè)陽性克隆株進(jìn)行全基因組測序，軟件評估出的排名前十的潛在脫靶位點(diǎn)的20 nt內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)插入缺失標(biāo)記，證明未出現(xiàn)脫靶現(xiàn)象。

雖然RNAi技術(shù)在利什曼原蟲中已有廣泛應(yīng)用，但CRISPR/Cas9系統(tǒng)亦可作為與之互補(bǔ)的基因編輯工具，二者為不同目的和應(yīng)用的研究提供重要技術(shù)支持。2019年Shrivastava等[71]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)建立LeishIF4E-3(+/-) 突變體，該突變體對巨噬細(xì)胞的感染性嚴(yán)重降低，且形態(tài)發(fā)生改變。2021年Baker等[72]用 mNeonGreen 熒光蛋白標(biāo)記蛋白激酶以進(jìn)行定位研究，同時(shí)建立ePK以及PIKK兩種蛋白激酶突變蟲株，評價(jià)蛋白激酶調(diào)節(jié)寄生蟲的復(fù)制、分化等的作用。

2.6 隱孢子蟲

Vinayak等[53]在2015年報(bào)道CRISPR/Cas9系統(tǒng)在微小隱孢子蟲的應(yīng)用，該團(tuán)隊(duì)在2017年提供隱孢子蟲轉(zhuǎn)基因技術(shù)的詳細(xì)試驗(yàn)方法[73]。首先在感染HCT-8細(xì)胞體外培養(yǎng)的條件下，利用同源重組將熒光素酶基因(nluc)插入烯醇酶基因(一種持家基因)后，利用熒光強(qiáng)度作為寄生蟲計(jì)數(shù)指標(biāo)。向野生蟲株轉(zhuǎn)染nluc缺陷質(zhì)粒(在nluc基因中插入終止密碼子)，在轉(zhuǎn)染靶向nluc缺陷片段的gRNA和一小段DNA雙鏈模板后表達(dá)熒光，證實(shí)CRISPR/Cas9系統(tǒng)可應(yīng)用在微小隱孢子蟲的基因編輯研究。為提高轉(zhuǎn)染效率，選擇氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶NEO(對巴龍霉素有抗藥性)作為藥篩基因，通過Nluc-Neo融合表達(dá)的方式，在巴龍霉素作用下篩選轉(zhuǎn)染的寄生蟲。通過對比試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，同時(shí)共轉(zhuǎn)Nluc-Neo和Cas9質(zhì)粒的寄生蟲排卵囊量迅速恢復(fù)到與無藥野生型組小鼠相似水平，而只轉(zhuǎn)染Nluc-Neo或nluc的小鼠逐步被巴龍霉素治愈，這說明CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯效率高于同源重組。對小鼠傳代后的Nluc-Neo的寄生蟲分別加巴龍霉素進(jìn)行小鼠體內(nèi)培養(yǎng)和細(xì)胞體外培養(yǎng)，小鼠傳代與野生型蟲株排卵囊量對比，可明顯看出Nluc-Neo蟲株對巴龍霉素耐藥，免疫印跡、IFA和熒光素試驗(yàn)均證實(shí)轉(zhuǎn)染蟲株是穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因蟲株。同時(shí)，因?yàn)槲⑿‰[孢子蟲具有兩條合成dTMP的途徑，其中一條為TK酶利用EdU合成dTMP。因此設(shè)計(jì)針對tk基因的gRNA和Nluc-Neo作為報(bào)告基因的供體模板，對隱孢子蟲的內(nèi)源性基因tk完成敲除。該報(bào)道中還優(yōu)化電轉(zhuǎn)程序和緩沖液體系，達(dá)到提高10倍電轉(zhuǎn)效率的效果。此外，該團(tuán)隊(duì)根據(jù)基因組測序結(jié)果認(rèn)為隱孢子蟲缺少非同源末端連接的DNA修復(fù)途徑，在使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)時(shí)，必需要提供供體DNA。2020年該團(tuán)隊(duì)在雙環(huán)氮雜環(huán)丁烷治療隱孢子蟲病的研究中，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在隱孢子蟲中插入苯丙氨酰-tRNA合成酶基因(pheRS基因)并使之產(chǎn)生藥物抗性，證實(shí)苯丙氨酰-tRNA 合成酶被鑒定為雙環(huán)氮雜環(huán)丁烷的靶標(biāo)[74]。同年，Choudhary等[75]報(bào)道基于大腸桿菌二氫葉酸還原酶降解結(jié)構(gòu)域 (DDD) 和甲氧芐啶 (TMP)和 CRISPR/Cas9系統(tǒng)建立第一個(gè)隱孢子蟲條件性敲降技術(shù)，并完成cdpk1基因進(jìn)行條件性敲除，有助于隱孢子蟲的必需基因功能研究。

2021年Xu等[76]在INS1蛋白功能研究中使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)標(biāo)記或敲除ins1基因，發(fā)現(xiàn)INS1蛋白參與大配子體形成或成熟。同年，Hasan等[77]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對隱孢子蟲耐藥性進(jìn)行研究。該團(tuán)隊(duì)證實(shí)Cp MetRS合成酶發(fā)生突變后隱孢子蟲能正常生長并對MetRS抑制劑2093藥物產(chǎn)生抗性。

2.7 其他原蟲

CRISPR/Cas9系統(tǒng)在新孢子蟲(Neosporacaninum)的應(yīng)用首次報(bào)道出現(xiàn)在2018年。Arranz-Solís等[63]首次在犬新孢子蟲利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)基因編輯，另外Nishikawa等[78]在同年也報(bào)道應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行犬新孢子蟲NcGRA7蛋白的敲除及功能鑒定。前者報(bào)道中利用原本用于弓形蟲的質(zhì)粒系統(tǒng)，成功應(yīng)用于新孢子蟲研究。該研究一方面設(shè)計(jì)2個(gè)針對Nc-1-GFP表達(dá)蟲株中的GFP蛋白的gRNA，實(shí)現(xiàn)外源基因的敲除；另一方面針對新孢子蟲的gra7基因設(shè)計(jì)2個(gè)gRNA及相應(yīng)的供體質(zhì)粒，完成內(nèi)源基因gra7的敲除。此外，該團(tuán)隊(duì)證實(shí)CRISPR/Cas9系統(tǒng)可應(yīng)用于犬新孢子蟲的基因編輯。該團(tuán)隊(duì)在2022年報(bào)道弓形蟲的生長素誘導(dǎo)條件性降解系統(tǒng)(AID)可在新孢子蟲中成功應(yīng)用[79]。

2019年Hakimi等[60]利用單個(gè)表達(dá) Cas9、gRNA 和供體模板DNA的質(zhì)粒，成功用于牛巴貝斯蟲(Babesiabovis)的基因編輯。該團(tuán)隊(duì)用單質(zhì)粒系統(tǒng)對牛巴貝斯蟲SBP3蛋白末端融合表達(dá)myc標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)蛋白定位，并在感染巴貝斯蟲的紅細(xì)胞表面呈現(xiàn)斑塊狀染色。該報(bào)道還設(shè)計(jì)針對細(xì)胞質(zhì)抗氧化酶過氧還蛋白基因tpx-1實(shí)現(xiàn)單質(zhì)粒的點(diǎn)突變，將49位的過氧化半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸。另外，該團(tuán)隊(duì)還構(gòu)建敲除tpx-1基因并替換為gfp基因的蟲株。通過tpx-1的突變株和敲除株與原有的野生型的對比發(fā)現(xiàn)，前兩者均表現(xiàn)出對藥物硝普鈉(SNP)敏感的特性。

3 展 望

CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以對單基因甚至多基因進(jìn)行高效、精確和快速的編輯，但在寄生原蟲基因編輯的應(yīng)用上仍存在部分問題。第一，CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用時(shí)可能存在脫靶效應(yīng)，應(yīng)進(jìn)一步完善gRNA的設(shè)計(jì)方法，在試驗(yàn)過程中注意對潛在脫靶位點(diǎn)的檢查。第二，Cas9蛋白較大，整合到寄生蟲基因組中較為困難，對于寄生蟲穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白帶來挑戰(zhàn)。第三，Cas9蛋白對寄生蟲有一定毒性，如克氏錐蟲的Cas9蛋白表達(dá)株存在生長缺陷[49]，弓形蟲表達(dá)的Cas9蛋白自發(fā)丟失[34]。可在表達(dá)Cas9蛋白的同時(shí)加入“陷阱sgRNA”的方式降低毒性[34]，或?qū)as9蛋白優(yōu)化，選擇更高效安全的Cas9蛋白(如金黃色葡萄球菌的Cas9蛋白[10])。第四，與瘧原蟲和弓形蟲相比，隱孢子蟲、球蟲等部分原蟲可用轉(zhuǎn)基因蟲株篩選的抗性基因較少，限制轉(zhuǎn)染效率的提高及基因編輯策略的發(fā)展。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因編輯應(yīng)用的不到十年里中，已經(jīng)在生命科學(xué)領(lǐng)域占有重要地位。除了高效的單基因編輯、精確的點(diǎn)突變外，在弓形蟲等原蟲中出現(xiàn)利用不同策略實(shí)現(xiàn)多基因家族編輯、全基因組編輯篩選的報(bào)道，展示CRISPR/Cas9系統(tǒng)功能的多樣性。雖然仍存在上述的問題，但相信通過科研人員的努力，將來CRISPR/Cas9系統(tǒng)可作為高效便捷的遺傳操作工具，可應(yīng)用在多種寄生性原蟲的基因家族功能研究、全基因組功能分析、數(shù)量性狀研究、藥物篩選與耐藥基因研究、表觀遺傳學(xué)調(diào)控等深入研究之中，并具有應(yīng)用在往日較難開展反向遺傳學(xué)操作的寄生性原蟲中的潛力，可以為原生動(dòng)物的反向遺傳學(xué)、基因功能和疫苗開發(fā)等研究提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持，有望在寄生性原蟲的基礎(chǔ)研究與防控開展上大放異彩。