戴超輝，李 輝，趙為民，付言峰，廖 超，李碧俠，王學敏，程金花

(江蘇省農業(yè)科學院畜牧研究所，農業(yè)農村部種養(yǎng)結合重點實驗室，江蘇省農業(yè)種質資源保護與利用平臺，南京 210014)

豬飼料主要由大豆、玉米、豆粕、稻糠、大麥、礦物質和飼料添加劑等組成，極易受到霉菌毒素的污染。有人員對全球豬飼料的污染情況進行了研究，結果檢測的飼料樣本中有96%的樣本至少被一種霉菌毒素污染，其中被檢測到最多的霉菌毒素主要是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、伏馬毒素和玉米赤霉烯酮，而豬是對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇最易感的動物之一[1-3]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)又名嘔吐毒素(vomitoxin, VT)，是由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)、擬枝孢鐮刀菌(Fusariumsporotrichioides)、粉紅鐮刀菌(Fusariumfoseum)和雪腐鐮刀菌(Fusariumnivale)等產生的單端孢菌毒素[4-5]。DON主要存在于小麥、大麥、燕麥、玉米等谷類作物中，在低溫條件下仍能保持其活性[6-7]。DON化學結構穩(wěn)定，耐高溫和強酸條件，在飼料加工過程中不易被破壞，因此DON污染已成為飼料質量安全的重大威脅之一[8]。DON對所有動物都有毒性作用，而豬對DON的敏感性最高[9-10]。近年來DON的發(fā)生率越來越高，嚴重損害了豬的健康和生長，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大挑戰(zhàn)[11]。本文主要綜述了DON對豬的毒害作用、毒理機制以及DON解毒劑開發(fā)研究進展，尤其關注DON毒理作用的遺傳調控研究，旨在為從遺傳本質提高豬抵御脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒害作用提供更全面的參考。

1 DON對豬的毒害作用

隨著飼料工業(yè)和貯藏技術的發(fā)展，在飼料加工和儲存等方面采用了大量防DON污染措施。盡管如此，豬飼料中DON的檢測超標率仍很普遍[11]。豬感染DON主要是由于食用被DON污染的飼料，DON對豬的毒害作用主要體現在出現不良反應(拒食、嘔吐、生長抑制等)、組織器官損傷(肝、脾、胃、腸道等)、細胞毒性(氧化應激、內質網應激、細胞凋亡和增殖受阻等)和免疫毒性(免疫刺激和免疫抑制)等方面(圖1)。

圖1 DON對豬的毒害作用(原始圖片素材來自https://www.pigprogress.net/health-tool/)Fig.1 Toxic effects of DON on pigs (the original image comes from https://www.pigprogress.net/health-tool/)

1.1 DON引起豬不良反應

豬在采食DON污染的飼料后，可能會出現嘔吐、腹瀉等中毒癥狀，有時還可能站立不穩(wěn)[12]。研究表明，飼料攝入DON會降低豬的采食量和增重，當飼喂含1～3 mg·kg-1的DON飼料時，豬的生長性能開始下降；每增加1 mg·kg-1的DON就會使豬的增重降低8%左右[13-14]。長期、低劑量食用被DON污染的飼料可導致采食量降低甚至拒食、體重增加減少和營養(yǎng)效率改變；急性、高劑量暴露于DON可能導致嘔吐、腹瀉、腸道炎癥和胃腸道出血[12]。進一步研究發(fā)現，DON通過調節(jié)局部血清素和減少腸蠕動、增加飽腹感信號、促炎細胞因子的釋放以及可能引起嘔吐來減少豬的采食量[15-17]。此外，DON誘導的腸道屏障破壞和通過激活豬的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑增加腸道通透性也會導致生長抑制[18]。研究表明，飼料中10 mg·kg-1的DON會降低豬對必需氨基酸的消化率，導致能量和營養(yǎng)攝入量、營養(yǎng)吸收降低，以及細胞代謝受損，最終對豬的生長產生負面影響[18-19]。另外，4 000和8 000 ng·mL-1濃度DON會抑制豬空腸對丙氨酸和葡萄糖的吸收，表明DON對通過豬小腸營養(yǎng)物質的運輸具有抑制作用[20]。懷孕母豬在采食含有DON的飼料后，機體對疾病的抵抗力下降，并且在所生胎兒的血清、肝和腎等器官中均能檢測到DON[21]。

1.2 DON對豬組織器官和細胞的毒害作用

豬采食受DON污染的飼料，經消化道吸收后在肝中首先檢測到DON，采食DON污染飼料組豬的肝重量比對照組要重[22]；并且肝中血清白蛋白的含量顯著降低，出現肝細胞組織紊亂；不論是急性還是慢性DON中毒，仔豬肝組織都會發(fā)生病變[23-24]。DON通過抑制肝的蛋白合成，易引發(fā)宿主氨基酸血癥，進而對肝器官的生長造成影響[25]。另外，DON對未成熟的后備母豬肝組織學和超微結構也產生了影響，包括小葉周圍結締組織的厚度增加及其對小葉的滲透、總微觀肝評分(組織學活動指數，HAI)增加、豬肝竇擴張、糖原含量變化、肝細胞中鐵離子積累增加、豬肝細胞內質網組織的變化以及肝巨噬細胞形態(tài)的變化，也會間接誘導豬肝細胞凋亡[26-27]。DON還可能對豬造成其他一些不良影響，包括胃食管區(qū)域、肺和腎的病變，以及不同臨床化學參數(血漿營養(yǎng)素和血漿酶活性)的變化[28]。另外，有研究報道DON導致原代豬脾淋巴細胞產生氧化損傷，從而抑制線粒體融合并促進線粒體自噬[29]?？傊?，DON可削弱肝、脾、腎、胃等組織器官的功能。

此外，有研究報道了低劑量DON對豬大腸組織結構和超微結構的影響，發(fā)現低劑量的DON不會影響大腸黏膜和黏膜下層的結構，不影響增殖細胞核抗原的表達和腸道屏障通透性，但顯著減少了盲腸和降結腸中杯狀細胞的數量，增加了大腸中淋巴細胞和漿細胞的數量，可能會影響大腸的防御機制[30]。但當給豬飼喂高劑量的DON后，可觀察到其空腸絨毛萎縮、溶解，絨毛高度降低和腸道細胞增殖受到影響等現象[31-32]。并且，DON能夠損傷腸道運輸并影響營養(yǎng)物質的吸收[33]。DON對營養(yǎng)吸收的毒性作用包括抑制小腸刷狀緣膜中鈉葡萄糖共轉運載體蛋白SGLT-1的活性，從而限制機體對關鍵營養(yǎng)素(例如葡萄糖)的吸收[34-35]。

關于DON對豬生殖系統(tǒng)的毒害作用，目前也有相關報道。Tiemann和D?nicke[28]研究指出，DON可抑制母豬子宮細胞增殖，阻礙卵母細胞和胚胎發(fā)育。孫文濤等[36]發(fā)現，含DON的污染飼料會引起斷奶仔豬子宮器官指數極顯著增加、子宮腺腺泡數量增多、密度增大、子宮內膜厚度極顯著增加。另外，霉變玉米中的DON導致仔豬相對卵巢重量顯著增加，并使仔豬卵巢組織抗氧化水平降低[37]。此外，DON可以誘導豬卵巢顆粒細胞(porcine granulosa cells, pGCs)的形態(tài)變化和凋亡，并抑制細胞增殖[38]。并且，DON能夠導致公豬睪丸支持細胞結構破壞、細胞周期停滯和氧化應激[39]。

1.3 DON對豬的免疫毒性

免疫系統(tǒng)對DON敏感，DON會使機體免疫調節(jié)異常[40]。DON免疫毒性相關的MAPK信號通路激活的結果取決于劑量和持續(xù)時間：急性低劑量暴露會導致免疫刺激，其特征是細胞因子、趨化因子和其他促炎相關蛋白的上調，而長期高劑量暴露通常會導致細胞凋亡、細胞周期停滯和免疫抑制[12]。這種免疫功能失調是核毒性應激的結果，之所以會出現免疫激活和免疫抑制兩種截然不同的影響，是因為DON激活了p38和ERK1/2兩個絲裂原活化蛋白激酶相互競爭的信號通路，p38通路促進細胞凋亡，而ERK1/2通路有利于細胞存活和細胞因子的表達[41]。研究發(fā)現，低濃度的DON誘導T細胞和B細胞中促炎基因mRNA和蛋白表達；而高濃度的DON會導致白細胞迅速凋亡并伴隨免疫抑制[42-43]。另外，DON會損害體液和細胞介導的免疫反應，導致體液免疫反應失調，使機體對疾病的抵抗力減弱；且DON會改變血清IgA水平，而IgA和免疫球蛋白腎炎息息相關[44]。DON還會對骨髓造血干細胞產生細胞毒性，當其作用于T、B淋巴細胞時，造成的免疫毒性作用會誘導細胞凋亡[45]。DON能夠抑制蛋白質的合成和細胞增殖，減少巨噬細胞、淋巴細胞和紅細胞的數量，抑制細胞合成[9]。長期飼喂DON污染飼料會導致豬只IL-8和GPX-2的表達增加，血清總免疫球蛋白A和特異性免疫球蛋白增加[46-47]；并且DON能夠降低T細胞增殖和參與T細胞活化的分子表達，導致免疫抑制[48]。此外，DON可以改變豬多形核細胞(polymorphonuclear cells, PMNC)的免疫功能，能夠導致LPS誘導的IL-8分泌、趨化性和吞噬能力都發(fā)生變化，并引起PMNC發(fā)生凋亡[49]。

2 DON毒理機制研究進展

2.1 DON毒性作用機制

從化學角度看，DON分子中C12/C13(圖2)上的環(huán)氧基團決定了其主要毒性，其毒性也與3個羥自由基有關[50]。從分子生物學角度看，DON有兩種已知的致病機制：1)DON靶向核糖體，DON分子的環(huán)氧基與細胞的肽基轉移酶中心(PTC)的A位結合，導致蛋白質合成鏈延伸步驟的延長，抑制DNA、RNA和蛋白質的合成；2)DON能夠激活與增殖、分化和凋亡有關的(包括p38、JNK、ERK1/2等)信號轉導細胞激酶，引起“核糖體毒性應激”效應，從而破壞正常細胞功能[40]。有研究報道，DON會通過使細胞周期停留在DNA合成期前期，抑制細胞進入DNA合成期，造成細胞休眠，使細胞增殖出現阻礙，最終導致細胞數量下降[51-52]。另外，DON可通過氧化應激介導細胞DNA損傷，造成基因毒性[53]。DON通過誘導核糖體應激反應改變細胞膜完整性，使細胞氧化還原狀態(tài)和細胞信號傳導發(fā)生改變，致使宿主機體各處細胞發(fā)生凋亡[12]。總之，DON已被證明可影響豬細胞中的信號通路、氧化應激、內質網應激、細胞凋亡和增殖，最終發(fā)揮毒性作用[54]。

圖2 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的化學結構示意圖[64]Fig.2 Schematic diagram of the chemical structure of deoxynivalenol (DON)[64]

2.2 DON對豬腸道損害的機制研究

目前關于DON對豬腸道損害的機制研究比較多。一方面，DON能通過改變豬腸道的跨膜上皮電阻或經上皮的離子導電性，損傷豬腸道屏障功能、降低腸道細胞間常見離子傳遞和腸道細胞完整性[18]。另外，DON可以通過激活MAPK信號通路和改變負責豬腸道組織關鍵生理和免疫功能的基因表達產生毒性；MAPK信號級聯(lián)的激活導致腸道屏障功能中斷，并通過減少緊密連接蛋白的表達增加通透性[35]。Kang等[55]研究表明，DON以劑量依賴性方式誘導產生豬腸上皮細胞(IPEC-J2)的細胞毒性，增加了與炎癥和細胞凋亡相關基因的表達，并降低細胞抗氧化狀態(tài)，揭示了DON誘導的IPEC-J2細胞損傷機制與活性氧ROS產生增加、細胞凋亡和炎癥相關的基因和蛋白質的表達有關。另外，雖然DON短時間處理不影響豬腸道屏障功能，但顯著抑制了豬腸上皮細胞增殖和腸道干細胞擴增，其作用機制與ABC transporter、PI3K/Akt/m TOR信號通路、JAK/STAT信號通路和Wnt/β-catenin信號通路有關[56]。DON還會對IPEC-J2細胞中的炎癥損傷核因子kappa-B(NF-κB)通路產生影響，當DON濃度增加時，NF-κB p65蛋白在細胞質和細胞核中的表達逐漸增加，一些炎癥因子的轉錄上調，從而導致NF-κB相關基因的表達或細胞中的蛋白質發(fā)生改變[57]。另外，DON通過MAPK信號通路的磷酸化觸發(fā)IPEC-J2細胞的炎癥，主要表現在MAPK信號通路(p38、ERK和JNK)的磷酸化增加[58]。DON能夠影響?zhàn)つっ庖叻磻瑢е旅庖咭种苹虼碳ぞ植棵庖呒毎图毎蜃俞尫?，并促進腸道病原體在腸道中的持久存在，這些免疫反應均會加劇豬腸道感染和局部炎癥，使腸細胞和宿主更容易受到管腔毒性化合物的影響[35]。DON可以在長時間低劑量情況下使豬回腸中IL-1β和IL-8表達下調[59]。而且，DON可通過改變腸道IL-1β和IL-6的分布和表達進而影響腸道的免疫機能[60]。此外，DON可能會抑制Wnt/β-catenin通路，導致腸隱窩細胞的有絲分裂減少[61]。DON可以改變IPEC-J2細胞的形態(tài)，破壞其亞微觀結構，增強細胞膜的通透性，降低跨上皮電阻，破壞腸道屏障[57, 62]?？傊珼ON能夠改變腸道屏障，削弱免疫反應并增加對傳染病的易感性[63]。筆者綜合上述文獻資料繪制了DON對腸道的毒害作用及其可能機制(圖3)。

圖3 DON對豬腸道的毒害作用及其可能機制Fig.3 Toxic effects of DON on pig intestines and its possible mechanism

2.3 調控DON毒理作用的分子遺傳解析研究進展

隨著分子生物學技術的發(fā)展和組學分析技術的應用，從分子水平(DNA和RNA等)探析DON毒理作用的研究也逐漸受到關注。Zhang等[41]使用豬腸上皮細胞系研究了DON對IPEC-J2的細胞毒性，通過RNA-seq篩選并鑒定出320個上調基因和160個下調基因，這些差異基因主要富集在免疫相關途徑上；進一步分析發(fā)現，DON通過激活p38 MAPK和ERK1誘導IPEC-J2細胞中促炎因子的產生。Xu等[65]研究發(fā)現，DON處理顯著降低了IPEC-J2的細胞活力，阻斷了G2/M期細胞周期，增加了細胞凋亡率，顯著下調了SLC4A11和MFSD3基因的表達水平；而且SLC4A11和MFSD3的過表達可以增強細胞活力，提示豬SLC4A11和MFSD3基因過表達可能具有緩減DON誘導的細胞毒性的作用。趙呈祥[66]利用全基因組DNA甲基化分析技術，鑒定了DON處理的IPEC-J2細胞全基因組DNA甲基化和基因表達變化模式，發(fā)現DON可誘導IPEC-J2細胞全基因組DNA甲基化水平升高；另外，確定27個基因啟動子甲基化水平與其表達水平呈負相關，初步揭示VAV3、SLC4A11、ST3GAL5和DUSP9等基因在DON引起的細胞毒性反應中的表達變化可能受其啟動子DNA甲基化的調控。

此外，Segura-Wang等[67]研究了DON誘導的豬肝、空腸和血清中microRNA表達的變化。在組織中僅檢測到microRNA表達的輕微變化，其中ssc-miR-10b在暴露于DON的仔豬肝中被下調；在血清中，一些microRNA在DON暴露后差異表達，其中4種通過qPCR進行了驗證(ssc-miR-16、ssc-miR-128、ssc-miR-451、ssc-miR-205)；預測的microRNA靶基因顯示出多種途徑的富集，包括PIK3-AKT、Wnt/β-連環(huán)蛋白和黏附連接。Yang等[38]研究表明，DON可以誘導pGCs的形態(tài)變化和凋亡，同時抑制細胞增殖；RNA-seq進一步分析揭示了5 937個差異表達基因，其中1 995個在DON處理組中下調，3 942個上調；KEGG富集分析表明，差異基因主要富集在IL-17信號通路、真核核糖體合成通路、RNA轉運通路和RNA降解等重要代謝通路，并推測DON對pGCs的影響與DNA損傷過程有關。

Wang等[68]揭示了暴露于DON后豬腸上皮細胞的全基因組轉錄譜，在DON暴露和對照細胞樣品之間共鑒定出110個差異表達的miRNAs和143個差異表達的lncRNAs，其中miR-330直接靶向MAPK15基因進而調控DON毒性，是一種潛在生物標志物，可用于監(jiān)測DON毒性。Xie等[69]發(fā)現，豬乳外泌體上調了IPEC-J2細胞中miR-181a、miR-30c、miR-365-5p和miR-769-3p的表達，然后下調其靶向基因在p53通路中的表達，繼而通過促進細胞增殖和抑制細胞凋亡來減輕DON誘導的損傷，最終保護腸道免受損傷。因此，在飼料或食物中添加富含miRNA的外泌體可作為一種新型預防措施應對DON導致的壞死性小腸結腸炎。表1 列出了目前可能參與調控DON毒理作用的潛在生物標志物。

表1 參與調控DON毒理作用的潛在生物標志物Table 1 Potential biomarkers involved in regulating the toxicological effects of DON

3 DON解毒劑研究進展

3.1 飼料添加劑的解毒作用

解毒生物學方法表明，精氨酸或谷氨酸等飼料添加劑可有效降低霉菌毒素對幼豬的毒性作用，主要表現在緩解豬DON應激和免疫相關細胞因子引起的損傷、改善了抗氧化系統(tǒng)的不平衡和霉菌毒素引起的腸道結構異常，改善DON導致的空腸形態(tài)、血清、空腸和回腸中的氨基酸濃度和轉運蛋白的表達水平[70-72]。N-乙酰半胱氨酸能緩解由DON引起的仔豬支持細胞結構的損傷、周期停滯和氧化應激損傷[39]。另外，有研究表明乳果糖和富氫水組成的添加劑通過升高抗氧化水平能有效緩解DON對仔豬卵巢造成的危害[37](表2)。

3.2 吸附劑的解毒作用

毒素污染飼料添加2 mg·kg-1蒙脫石或1.0 mg·kg-1蒙脫石+0.5 mg·kg-1酵母培養(yǎng)物復合物可降低霉菌毒素對免疫系統(tǒng)和肝的影響，改善仔豬生長性能[73]。霉菌毒素吸附劑(納米級硅酸鹽血小板以及蒙脫石和酵母細胞壁的混合物)可以通過調節(jié)p38、ERK和JNK的磷酸化來減弱IPEC-J2細胞中DON誘導的炎癥反應[58]。Zhang等[74]發(fā)現，改良水合鋁硅酸鈣鈉(HSCAS)吸附劑能減輕DON誘導的斷奶仔豬血清抗體滴度、胸腺組織病理學、細胞凋亡、氧化還原狀態(tài)、炎癥和細胞凋亡信號的變化。Horky等[75]發(fā)現，含有純化和活化膨潤土的霉菌毒素吸附劑改善了DON誘導的育肥豬中肝的組織病理變化，降低了氧化應激，并且保護了空腸組織不受破壞。Santos等[76]研究表明，由吸附性粘土礦物組成的霉菌毒素滅活劑可以減輕DON對保育豬生長性能和氧化應激的負面影響(表2)。

3.3 微生物的解毒作用

鼠李糖乳桿菌RC007降低了DON導致的組織學改變、促炎癥反應、細胞旁通透性和MAPK激酶的磷酸化，可以作為益生菌使用，降低DON對豬只的腸道毒性[77]。腸道微生物群已被證明有助于對抗霉菌毒素的影響，Reddy等[78]通過對豬盲腸內容物進行16S rRNA測序發(fā)現，乳酸桿菌和類桿菌在緩減DON對豬盲腸的毒害作用和改善免疫應答過程中起關鍵作用。細菌(真桿菌BBSH797)和酶(伏馬菌素酯酶 FumD)能夠有效改善DON引起的仔豬血液學、生物化學、組織形態(tài)學變化和免疫反應[79]。Garcia等[80]研究發(fā)現，釀酒酵母RC016可改善動物生長和腸道免疫系統(tǒng)，并且可以通過抵消DON誘導的仔豬斷奶相關腸道炎癥來改善腸道健康。同樣，釀酒酵母S.cerevisiaeboulardii可以減輕DON誘導的氧化應激，減少DON誘導的腸道轉錄組改變[81](表2)。

3.4 天然成分(提取物)的解毒作用

小檗堿(berberine, BBR)亦稱黃連素，是黃連抗菌的主要有效成分，一方面可以通過增加血清抗氧化酶和T細胞表面抗原的表達，減少小腸促炎細胞因子的釋放來抑制DON誘導的腸道損傷；另一方面可以通過調控NF-κB和MAPK信號通路來調節(jié)DON誘導的腸道損傷、免疫抑制和氧化應激，最終維持仔豬腸道健康[82]。白藜蘆醇(resveratrol, RES)是一種植物中的酚類植物抗毒素，RES補充劑通過增強腸道屏障功能、減輕腸道炎癥和氧化損傷以及正向調節(jié)腸道微生物群來改善DON誘導的仔豬腸道健康[83]。落新婦苷(astilbin, AST)是一種天然抗氧化劑，20 μg·mL-1的AST可通過增強抗氧化酶活性和腸道屏障功能來改善DON誘導的IPEC-J2細胞氧化應激、炎癥和細胞凋亡，降低炎癥和凋亡基因的表達，改善屏障功能和營養(yǎng)轉運吸收[84]。綠原酸(chlorogenic acid, CGA)是金銀花的主要抗菌、抗病毒有效藥理成分之一，CGA預處理可減輕DON誘導的IPEC-J2細胞毒性、炎癥和凋亡，并保護腸細胞完整性免受DON損傷[85]。番茄紅素(lycopene, LYC)是一種有效的抗氧化類胡蘿卜素，LYC能夠在DON暴露下調節(jié)Keap1/Nrf2信號通路來保護腸上皮免受氧化損傷[86]。表2總結了目前可能的DON解毒劑及主要功效。

表2 DON解毒劑及主要功效Table 2 DON antidotes and their main functions

4 總結與展望

DON作為一種豬最易感的霉菌毒素，能夠導致豬全身組織和器官的損傷和病變，造成豬只生產性能的下降，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的挑戰(zhàn)。目前飼料加工工藝的改進、飼料防霉措施的改善、以吸附劑和生物制劑為主的DON解毒劑的研發(fā)能夠在一定程度上緩減DON的毒害作用，但并不能從根本上提高豬對DON的抵抗力。隨著分子生物學技術的迅速發(fā)展，調控DON毒理作用的分子遺傳機制得到進一步揭示。因此，利用現代分子生物學技術(高通量測序技術、多組學分析技術、基因編輯技術等)對豬耐受(抵抗)DON的毒害作用進行基因功能和調控機制的深入研究，挖掘有意義的生物標志物或分子標記并應用于豬的抗病育種，從遺傳本質提高豬對DON的抵抗力，將對保障養(yǎng)豬業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有深遠的影響。