劉佳，羅麗，謝成松，鄧高丕

（1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州510520；2.廣州市荔灣區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，廣東廣州510150；3.廣東太安堂藥業(yè)股份有限公司，廣東汕頭515021；4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

卵巢顆粒細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和功能分化伴隨著卵泡生長發(fā)育全過程，卵巢儲備功能下降（DOR）的發(fā)生建立在卵巢顆粒細(xì)胞損傷的病理基礎(chǔ)上，引起促卵泡生成激素（FSH）、孕酮（P）及雌二醇（E2）的合成分泌異常[1-3]。麒麟丸由制何首烏、墨旱蓮、淫羊藿、菟絲子、鎖陽、黨參、郁金、枸杞子、覆盆子、山藥、丹參、黃芪、白芍、青皮、桑椹組成，具有補腎填精、益氣養(yǎng)血的功效，適用于男子不育癥和女子不孕癥等疾病。既往臨床研究表明，麒麟丸可有效治療DOR和黃體功能不全，能顯著調(diào)節(jié)促卵泡激素受體（FSHR）及E2的合成分泌，刺激孕酮（P）分泌，促進(jìn)子宮內(nèi)膜增厚，且療效優(yōu)于黃體酮治療[4-7]，提示麒麟丸與恢復(fù)卵巢顆粒細(xì)胞正常形態(tài)和功能有關(guān)?；诖?，本研究在細(xì)胞水平上進(jìn)一步探討麒麟丸治療DOR，改善受損卵巢顆粒細(xì)胞可能的作用機制，以期豐富麒麟丸臨床作用內(nèi)涵，為挖掘麒麟丸更多的適應(yīng)癥提供參考。現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株人卵巢顆粒細(xì)胞KGN，購自廣州市欣福聯(lián)生物科技有限公司。以含10%血清的KGN專用培養(yǎng)液置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h換1次新鮮培養(yǎng)液。

1.2 藥物麒麟丸，由廣東太安堂藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號：國藥準(zhǔn)字Z10930034。麒麟丸水提物制備：取麒麟丸溶于水，5 000×g離心15 min去沉淀，冷凍干燥獲得凍干粉，溶于磷酸鹽緩沖液（PBS）中。

1.3 試劑與儀器KGN細(xì)胞專用培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技技術(shù)有限公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲基亞砜（DSMO）（北京索萊寶科技有限公司）；兔抗抗苗勒激素（AMH）抗體（京博奧森生物技術(shù)有限公司）；兔抗Smad2/3抗體（南京巴傲得生物科技有限公司）；兔抗3-磷酸甘油醛脫氫酶（GADPH）抗體，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔IgG（美國Abcam公司）；E2酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（武漢艾博泰克生物有限公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量檢測試劑盒（江蘇凱基生物公司）；增強化學(xué)發(fā)光液（ECL）（美國Bio-Rad公司）。Multiskan SkyHig全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Scientific公司）；垂直電泳儀及轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.4 麒麟丸對正常培養(yǎng)人KGN細(xì)胞活性的影響根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果，當(dāng)麒麟丸水提物劑量高于10 mg·L-1時，對KGN細(xì)胞正常增殖產(chǎn)生了明顯的抑制作用，故以此劑量為上限設(shè)置3個劑量等級（2.5、5、10 mg·L-1）。實驗設(shè)置正常對照組（正常培養(yǎng)液培養(yǎng)），麒麟丸2.5、5、10 mg·L-1組等4組。取處于對數(shù)生長期KGN細(xì)胞，采用胰酶常規(guī)消化，接種至96孔板，細(xì)胞密度為2×105個/孔，每組設(shè)6個復(fù)孔。培養(yǎng)48、72 h后，每個孔加入5 mg·mL-1MTT溶液20 μL，4 h后去掉培養(yǎng)液，加入DMSO工作液，震蕩5 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀于570 nm波長處檢測吸光度（OD）值。

1.5 雷公藤多苷誘導(dǎo)人KGN細(xì)胞損傷模型建立參考文獻(xiàn)研究[8]，應(yīng)用雷公藤多苷誘導(dǎo)建立人KGN細(xì)胞損傷模型。實驗設(shè)置正常對照組（正常培養(yǎng)液培養(yǎng)），雷公藤多苷125、100、80 μg·mL-1組等4組。取處于對數(shù)生長期KGN細(xì)胞，用胰酶常規(guī)消化，接種至96孔板，細(xì)胞密度為2×105個/孔，每組設(shè)6個復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，采用MTT法檢測各組細(xì)胞活性，檢測步驟同“1.4”項。

1.6 麒麟丸對雷公藤多苷致人KGN細(xì)胞損傷模型活性的影響實驗分為正常對照組，模型組，麒麟丸2.5、5、10 mg·L-1組等5組。取處于對數(shù)生長期KGN細(xì)胞，用胰酶常規(guī)消化，接種至96孔板，細(xì)胞密度為2×105個/孔，每組6個復(fù)孔。正常對照組以正常培養(yǎng)液培養(yǎng)，模型組以含雷公藤多苷125 μg·mL-1的培養(yǎng)液培養(yǎng)，麒麟丸2.5、5、10 mg·L-1組在含有雷公藤多苷125 μg·mL-1培養(yǎng)液中分別對應(yīng)加入2.5、5、10 mg·L-1麒麟丸水提物。培養(yǎng)48 h后，采用MTT法測定各組細(xì)胞活性。

1.7 采用Western Blot法觀察麒麟丸對雷公藤多苷致人KGN細(xì)胞損傷模型AMH、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)的影響按“1.6”項分組，取干預(yù)48 h后的KGN細(xì)胞，加預(yù)冷的裂解液，于冰浴中反復(fù)用1 mL移液器吹打裂解。BCA法測定蛋白濃度，將蛋白調(diào)整至統(tǒng)一濃度后，加入5×上樣緩沖液，沸水浴10 min使蛋白變性后電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%牛血清白蛋白（BSA）封閉2 h，Tris鹽-Tween-20緩沖液（TBST）洗膜后分別加入按體積比稀釋的GAPDH抗體（1∶1 000）、AMH（1∶500）、Smad2/3（1∶500）4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜，加入HRP山羊抗兔IgG（1∶5 000）孵育1 h，TBST洗膜，于ECL發(fā)光液顯影。采用ImageJ軟件識別圖像灰度，結(jié)果以目的蛋白/內(nèi)參蛋白（GAPDH）灰度值比值表示。

1.8 采用ELISA法觀察麒麟丸對雷公藤多苷致人KGN細(xì)胞損傷模型E2的影響按“1.6”項分組，提取干預(yù)48 h后的KGN細(xì)胞上清液（1 000×g離心10 min），按照E2的ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.9 統(tǒng)計方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 麒麟丸對正常培養(yǎng)KGN細(xì)胞活性的影響圖1、圖2結(jié)果顯示：與正常對照組比較，麒麟丸2.5、5、10 mg·L-1組干預(yù)48、72 h細(xì)胞活性均無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。表明麒麟丸對KGN細(xì)胞增殖無明顯的促進(jìn)或抑制作用。

圖1 麒麟丸干預(yù)48 h對KGN細(xì)胞活性的影響Figure 1 Effect of Qilin Pills intervention for 48 hours on KGN cell activity

圖2 麒麟丸干預(yù)72 h對KGN細(xì)胞活性的影響Figure 2 Effect of Qilin Pills intervention for 72 hours on KGN cell activity

2.2 雷公藤多苷誘導(dǎo)KGN細(xì)胞損傷模型建立圖3結(jié)果顯示，與正常對照組比較，雷公藤多苷100、125 μg·mL-1組細(xì)胞活性下降（P＜0.05或P＜0.01），表明雷公藤多苷100、125 μg·mL-1誘導(dǎo)48 h對KGN細(xì)胞有明顯的抑制作用，提示造模成功。雷公藤多苷125 μg·mL-1誘導(dǎo)48 h抑制作用差異更顯著，故選擇雷公藤多苷劑量為125 μg·mL-1誘導(dǎo)48 h進(jìn)行后續(xù)研究。

圖3 不同濃度雷公藤多苷誘導(dǎo)48 h對KGN細(xì)胞活性的影響（n=3，MTT法）Figure 3 Effect of different concentrations of tripterygium glycosides on the activity of KGN cells induced for 48 hours（n=3，MTT method）

2.3 麒麟丸對雷公藤多苷致KGN細(xì)胞損傷模型活性的影響圖4結(jié)果顯示：與正常對照組比較，模型組細(xì)胞活性顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，麒麟丸2.5、5、10 mg·L-1組細(xì)胞活性均顯著升高（P＜0.01）。表明麒麟丸可促進(jìn)雷公藤多苷致KGN細(xì)胞損傷的修復(fù)。

圖4 麒麟丸對雷公藤多苷致KGN細(xì)胞損傷模型活性的影響（n=3，MTT法）Figure 4 Effect of Qilin Pills on the activity of KGN cell injury model caused by tripterygium glycosides（n=3，MTT method）

2.4 麒麟丸對雷公藤多苷致KGN細(xì)胞損傷模型AMH、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)的影響圖5～圖8結(jié)果顯示：與正常對照組比較，模型組細(xì)胞AMH、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，麒麟丸2.5、5、10 mg·L-1組AMH蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），麒麟丸2.5 mg·L-1組Smad2蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），麒麟丸2.5、5、10 mg·L-1組Smad3蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。表明麒麟丸可逆轉(zhuǎn)雷公藤多苷致KGN細(xì)胞損傷AMH、Smad2/3蛋白表達(dá)的降低。

圖5 各組AMH、Smad2、Smad3蛋白電泳圖Figure 5 Electrophoretogram of AMH，Smad2 and Smad3 proteins in each group

圖8 麒麟丸對雷公藤多苷致KGN細(xì)胞損傷模型Smad3蛋白表達(dá)的影響Figure 8 Effect of Qilin Pills on Smad3 protein expression in KGN cell injury model caused by tripterygium glycosides

圖6 麒麟丸對雷公藤多苷致KGN細(xì)胞損傷模型AMH蛋白表達(dá)的影響Figure 6 Effect of Qilin Pills on AMH protein expression in KGN cell injury model caused by tripterygium glycosides

圖7 麒麟丸對雷公藤多苷致KGN細(xì)胞損傷模型Smad2蛋白表達(dá)的影響Figure 7 Effect of Qilin Pills on Smad2 protein expression in KGN cell injury model caused by tripterygium glycosides

2.5 麒麟丸對雷公藤多苷致KGN細(xì)胞損傷模型E2水平的影響圖9結(jié)果顯示：與正常對照組比較，模型組E2水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，麒麟丸2.5、5、10 mg·L-1組E2水平顯著升高（P＜0.01）。表明麒麟丸能促進(jìn)雷公藤多苷致?lián)p傷的KGN細(xì)胞E2的分泌。

圖9 麒麟丸對雷公藤多苷致KGN細(xì)胞損傷模型雌二醇（E2）水平的影響Figure 9 Effect of Qilin Pills on E2 level in KGN cell injury model caused by tripterygium glycosides

3 討論

卵巢儲備功能是指卵巢皮質(zhì)區(qū)卵泡生長、發(fā)育形成可受精的卵母細(xì)胞的能力。卵巢卵泡池中卵子數(shù)目減少或是質(zhì)量下降導(dǎo)致女性生育能力下降及雌孕激素的缺乏，即為卵巢儲備功能下降（DOR）[9-10]。卵子由卵巢中的卵泡產(chǎn)生，初級卵母細(xì)胞由卵巢中單層顆粒細(xì)胞包被形成原始卵泡，而后形成由多層顆粒細(xì)胞包被的成熟卵泡，同時顆粒細(xì)胞由扁平細(xì)胞分化為立方或者柱狀上皮細(xì)胞，并逐步表達(dá)促卵泡激素受體（FSHR），調(diào)節(jié)抗苗勒管激素（AMH）和雌二醇（E2）等激素的分泌。故以上各激素分泌水平常用來評價卵巢儲備功能。

卵巢顆粒細(xì)胞KGN分離自卵巢組織，是卵巢的主要功能細(xì)胞，其增殖與分化直接影響著卵泡的生長、啟動、發(fā)育、排卵、黃體形成以及甾體激素分泌等卵巢功能活動。KGN細(xì)胞是卵泡內(nèi)的最大細(xì)胞群，卵泡發(fā)育的顯著標(biāo)志之一就是卵巢顆粒細(xì)胞迅速生長及增殖。本研究對正常的KGN細(xì)胞給予麒麟丸干預(yù)，發(fā)現(xiàn)在48 h和72 h干預(yù)過程中，2.5、5、10 mg·L-1麒麟丸均未對其增殖產(chǎn)生明顯影響，這表明麒麟丸對KGN細(xì)胞的增殖無明顯刺激或抑制作用，使其正常增殖，而并非激化其肆意增殖。采用80、100、125 μg·mL-1雷公藤多苷誘導(dǎo)KGN細(xì)胞48 h，發(fā)現(xiàn)其抑制作用呈量效趨勢，認(rèn)為劑量為125 μg·mL-1更適合KGN細(xì)胞損傷模型的構(gòu)建。然后，在此細(xì)胞損傷模型基礎(chǔ)上給予2.5、5、10 mg·L-1麒麟丸干預(yù)，發(fā)現(xiàn)干預(yù)48 h時，3個劑量的麒麟丸均能夠顯著逆轉(zhuǎn)雷公藤多苷對KGN細(xì)胞增殖的抑制作用，使之增殖活性接近于正常水平，并呈一定的量效趨勢，表明麒麟丸對受損KGN細(xì)胞增殖活性具有保護(hù)作用。

除了對KGN細(xì)胞宏觀生長增殖進(jìn)行觀察，本研究還檢測了能夠反映KGN細(xì)胞功能的AMH和E2指標(biāo)。AMH主要由次級卵泡、竇前卵泡和竇狀卵泡顆粒細(xì)胞分泌，調(diào)節(jié)卵泡的生長發(fā)育，不受促性腺激素等藥物的調(diào)節(jié)，可早期準(zhǔn)確評估卵巢儲備功能，是公認(rèn)的預(yù)測價值最大的生物標(biāo)志物。E2的產(chǎn)生受到卵巢顆粒細(xì)胞分泌抑制素B（INHB）的調(diào)控，是預(yù)測卵巢儲備功能的指標(biāo)[11]。通過檢測AMH和E2水平，可了解受損KGN細(xì)胞功能的恢復(fù)情況。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雷公藤多苷誘導(dǎo)可明顯抑制KGN細(xì)胞AMH蛋白表達(dá)，2.5、5、10 mg·L-1麒麟丸均能夠逆轉(zhuǎn)此抑制作用，且呈現(xiàn)明顯的量效促進(jìn)作用。其中，10 mg·L-1麒麟丸不但能夠逆轉(zhuǎn)雷公藤多苷誘導(dǎo)對KGN細(xì)胞活性的抑制作用，與正常的KGN細(xì)胞組比較還具有明顯的促進(jìn)KGN細(xì)胞AMH蛋白表達(dá)的作用，而與相同劑量麒麟丸對受損KGN細(xì)胞增殖促進(jìn)作用的結(jié)果進(jìn)行橫向比較，其對AMH蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用更為顯著。這說明，10 mg·L-1的麒麟丸雖然在一定程度上促進(jìn)了KGN細(xì)胞增殖，但是在細(xì)胞功能上已經(jīng)產(chǎn)生了相對突出地促進(jìn)AMH表達(dá)的作用，這也佐證了AMH在一定程度上具有抑制KGN細(xì)胞過度增殖的作用。

本研究通過觀察麒麟丸對受損KGN細(xì)胞E2分泌的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，麒麟丸能夠逆轉(zhuǎn)雷公藤多苷對KGN細(xì)胞E2分泌的抑制作用，使之恢復(fù)正常水平，此作用結(jié)果與其對受損KGN細(xì)胞增殖的修復(fù)結(jié)果相符。提示麒麟丸可改善受損KGN細(xì)胞E2的異常分泌，具有保護(hù)卵巢儲備功能的作用。

DOR發(fā)生的病理基礎(chǔ)存在KGN細(xì)胞的形態(tài)及功能異常。在卵泡發(fā)育初期，主要以KGN細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化為主，形成初級卵泡后，KGN細(xì)胞的功能也出現(xiàn)了分化，逐漸能夠表達(dá)FSHR等，并開始合成分泌雌激素?？梢?，KGN細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和功能的分化是卵泡生長發(fā)育的基礎(chǔ)。有研究[12-13]表明，Smads信號通路是調(diào)控卵泡發(fā)育的重要途徑，對卵泡的生長發(fā)育有調(diào)控作用。Smad蛋白家族使轉(zhuǎn)化生長因子βⅠ型受體（TGF-βRⅠ）磷酸化，繼而激活Smad2、Smad3使其磷酸化，正向調(diào)控細(xì)胞膜至核的信號傳導(dǎo)。本研究結(jié)果表明，麒麟丸干預(yù)能夠促進(jìn)受損KGN細(xì)胞中受到抑制的Smad2和Smad3蛋白表達(dá)，并與指標(biāo)E2和AMH結(jié)果一致。

綜上所述，麒麟丸能夠在細(xì)胞水平上表現(xiàn)出很好地促進(jìn)受損卵巢顆粒細(xì)胞修復(fù)和功能恢復(fù)的作用，麒麟丸改善DOR的機制可能是經(jīng)由Smads信號通路調(diào)控Smad2、Smad3蛋白表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)雌激素的分泌。