李靜，武如通，朱漢平

[1.廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院）脾胃病科，廣東廣州510095；2.廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院）腫瘤病科，廣東廣州510095；3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科，廣東廣州510120]

結(jié)腸癌是消化道常見惡性腫瘤之一。近年來，結(jié)腸癌發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢，由于結(jié)腸癌早期癥狀不明顯，因此，大部分患者診斷時結(jié)腸癌已處于中晚期，手術(shù)治療效果不佳[1]。隨著對結(jié)腸癌的不斷深入研究，對結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞生化有了更加明確的認(rèn)知[2]。CD133、CD166均為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，參與機(jī)體多種病理生理過程[3]。p53作為抑制細(xì)胞生長的基因調(diào)控靶點，可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，p53基因的突變，是導(dǎo)致多種腫瘤發(fā)生的重要因素[4-6]。中醫(yī)藥在治療惡性腫瘤方面，不僅能夠獲得良好療效，對免疫功能和生活質(zhì)量也有一定的提高。既往有學(xué)者對90例大腸癌患者給予滋陰補脾方聯(lián)合化療進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，滋陰補脾方聯(lián)合化療可提高患者治療有效率及Karnofsky功能狀態(tài)（KPS）評分，改善患者免疫功能，減少不良反應(yīng)，改善預(yù)后[7]。本科室對收治的肺癌、乳腺癌、肝癌及結(jié)腸癌化療患者，給予滋陰補脾法干預(yù)，發(fā)現(xiàn)化療聯(lián)合滋陰補脾法治療化療早期患者療效較好，其中，結(jié)腸癌患者改善較為明顯。但是，對于滋陰補脾法抗結(jié)腸癌的作用機(jī)制尚不明確，因此，本研究為進(jìn)一步探究滋陰補脾法對結(jié)腸癌的治療作用及機(jī)制，觀察了其對結(jié)腸癌裸鼠模型腫瘤標(biāo)志物表達(dá)的影響，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物35只SPF級6～8周齡雄性SD裸鼠，體質(zhì)量15～20 g，由廣州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（粵）2021-0014。實驗全程于廣州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心完成。本次實驗符合《實驗動物管理條例》規(guī)定。

1.2 藥物、試劑與儀器滋陰補脾中藥復(fù)方由太子參20 g、黃芪15 g、山藥15 g、茯苓10 g、白花蛇舌草30 g組成，其配方顆粒由廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)；氟尿嘧啶注射液（上海旭東海普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：國藥準(zhǔn)字H31020593）。CD133抗體、CD166抗體、p53抗體（美國Abcam公司）。顯微鏡（天津微儀光學(xué)儀器，型號：BM19A-320M）。

1.3 COLO-320細(xì)胞懸液制備人結(jié)腸腺癌細(xì)胞COLO-320，購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。將COLO-320細(xì)胞以RPMI 1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞制成COLO-320細(xì)胞懸液，密度為1×108個/mL。

1.4 建模、分組與給藥取COLO-320細(xì)胞懸液0.1 mL接種于裸鼠背部皮下構(gòu)建結(jié)腸癌移植瘤模型。接種過程中有2只裸鼠死亡，1只接種失敗。接種結(jié)腸癌細(xì)胞株后成瘤時間為12 d左右。最終選取移植瘤平均直徑為5 mm左右的裸鼠32只，隨機(jī)分為4組，即空白組、化療組、中藥組、聯(lián)合組，每組8只。各組裸鼠建模成功后首次用藥時間記為第1天?？瞻捉M：上午、下午分別給予腹腔注射、灌胃生理鹽水；化療組：上午腹腔注射氟尿嘧啶0.5 g·kg-1，下午灌注生理鹽水；中藥組：上午給予腹腔注射生理鹽水，下午給予滋陰補脾中藥復(fù)方顆?；鞈乙?0 g·kg-1灌胃；聯(lián)合組：上午給予腹腔注射氟尿嘧啶0.5 g·kg-1，下午給予滋陰補脾中藥復(fù)方顆?；鞈乙簻珓?0 g·kg-1灌胃。連續(xù)干預(yù)7 d，至第14天（即治療后第7天）處死動物收集標(biāo)本（因藥物療效有滯后性，因此第14天處死實驗裸鼠）。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 腫瘤生長情況給藥期間，采用活體成像儀測量裸鼠移植瘤最大徑（a）及最小徑（b），2 d測量1次，給藥期間裸鼠無死亡。最后32只裸鼠于治療后第7天處死，解剖出移植瘤稱質(zhì)量。根據(jù)移植瘤體積[V=1/2（a×b2）]的均數(shù)繪制腫瘤生長曲線，體積抑制率=（空白組瘤體積-實驗組瘤體積）/空白組瘤體積×100%。計算抑瘤率，抑瘤率=（顯效只數(shù)+有效只數(shù)）/總只數(shù)×100%。顯效：腫瘤消失或者腫瘤直徑減小超過80%；有效：腫瘤直徑減小40%～80%；無效：腫瘤直徑無顯著減小或者腫瘤直徑呈現(xiàn)增長。

1.5.2 Western Blot法檢測治療前后結(jié)腸癌組織中CD133、CD166、p53蛋白表達(dá)取結(jié)腸癌組織，剪碎后裂解提取組織蛋白，用BCA測定其濃度，分裝后，-20℃保存。將蛋白溶液和緩沖溶液按照4∶1的體積比例混勻，然后煮沸使其變性，電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，脫脂奶粉封閉，PBS洗滌3次后分別加入CD133、CD166、p53等一抗（1∶100體積比稀釋）4℃過夜孵育?；販睾驪BS洗滌3次，加入生物素標(biāo)記的二抗（1∶500體積比稀釋），室溫孵育60 min，PBS洗滌3次，用DBA試劑盒顯色，曝光，應(yīng)用Image Pro Plus 6.0（Media Cybernetics）軟件分析結(jié)果。結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（GAPDH）灰度值比值表示。

1.6 統(tǒng)計方法采用SPSS 21.0軟件對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。其中：計數(shù)資料采用χ2檢驗，以n/%表示；計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較用方差分析，不同時間點多組比較采用重復(fù)測量方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組結(jié)腸癌裸鼠瘤體直徑、質(zhì)量比較表1、圖1結(jié)果顯示：治療后第7天，化療組、中藥組以及聯(lián)合組結(jié)腸癌裸鼠瘤體最小徑、最大徑及瘤體質(zhì)量較空白組均顯著下降（P＜0.05），化療組和聯(lián)合組的瘤體最小徑、最大徑及瘤體質(zhì)量顯著低于中藥組（P＜0.05），聯(lián)合組的瘤體最小徑、最大徑及瘤體質(zhì)量則顯著低于化療組（P＜0.05）。

表1 各組結(jié)腸癌裸鼠瘤體直徑、質(zhì)量比較Table 1 Comparison of tumor diameter and mass among various groups of nude mice bearing colon cancer （±s）

表1 各組結(jié)腸癌裸鼠瘤體直徑、質(zhì)量比較Table 1 Comparison of tumor diameter and mass among various groups of nude mice bearing colon cancer （±s）

注：①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，與化療組比較；③P＜0.05，與中藥組比較

組別空白組化療組中藥組聯(lián)合組鼠數(shù)/只8 8 8 8瘤體最小徑/mm 6.77±0.35 2.19±0.16①3.22±0.18①②1.09±0.09①②③瘤體最大徑/mm 8.37±2.19 3.73±1.01①4.93±1.37①②3.01±0.86①②③瘤體質(zhì)量/g 18.43±4.10 6.92±2.09①12.13±2.49①②4.01±1.08①②③

圖1 各組結(jié)腸癌裸鼠治療后第7天瘤體圖片F(xiàn)igure 1 Image of tumors in each group of nude mice bearing colon cancer day 7 after treatment

2.2 各組結(jié)腸癌裸鼠腫瘤生長情況比較表2、圖2結(jié)果顯示：治療前，各組結(jié)腸癌裸鼠腫瘤體積比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；從治療第2天開始，空白組裸鼠腫瘤體積不斷增加，化療組、中藥組以及聯(lián)合組結(jié)腸癌裸鼠腫瘤體積逐漸下降，與空白組同期比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。從治療后第1天開始，聯(lián)合組、化療組結(jié)腸癌裸鼠腫瘤體積明顯低于中藥組（P＜0.05）。從治療后第3天開始，聯(lián)合組結(jié)腸癌裸鼠腫瘤體積明顯低于化療組、中藥組（P＜0.05）。

圖2 各組結(jié)腸癌裸鼠腫瘤生長曲線Figure 2 Tumor growth curve of each group of nude mice bearing colon cancer

表2 各組結(jié)腸癌裸鼠腫瘤體積比較Table 2 Comparison of tumor volume among various groups of nude mice bearing colon cancer（±s，mm3）

表2 各組結(jié)腸癌裸鼠腫瘤體積比較Table 2 Comparison of tumor volume among various groups of nude mice bearing colon cancer（±s，mm3）

注：①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，與化療組比較；③P＜0.05，與中藥組比較

組別空白組化療組中藥組聯(lián)合組鼠數(shù)/只8 8 8 8治療前62.7±10.18 62.4±9.87 62.1±9.96 62.6±10.03治療第2天70.17±11.17 54.09±9.72①56.47±8.37①52.02±9.26①治療第4天79.42±13.21 45.28±7.93①48.08±7.93①45.09±7.63①治療第6天90.63±15.09 37.14±6.05①40.18±5.98①35.41±5.09①治療后第1天106.36±17.12 26.09±4.79①35.52±5.11①②25.16±3.10①②治療后第3天124.29±18.06 18.57±3.47①28.19±4.61①②13.09±2.13①②③治療后第5天136.08±19.56 10.36±2.81①24.31±3.97①②6.27±1.53①②③治療后第7天144.15±20.37 7.27±1.38①20.16±3.09①②3.08±1.07①②③

2.3 各組抑瘤率比較表3結(jié)果顯示：治療后第7天，空白組、化療組、中藥組、聯(lián)合組抑瘤率分別為0.00%、87.50%、75.00%、100.00%，各組抑瘤率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組抑瘤率比較Table 3 Comparison of tumor suppression rates among various groups

2.4 各組結(jié)腸癌裸鼠腫瘤組織CD133、CD166、p53蛋白表達(dá)比較表4、圖3結(jié)果顯示，治療前，各組結(jié)腸癌裸鼠腫瘤組織CD133、CD166、p53蛋白表達(dá)水平均呈高表達(dá)，組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；治療后第7天，空白組結(jié)腸癌裸鼠腫瘤組織CD133、CD166、p53蛋白表達(dá)水平均高于治療前（P＜0.05），化療組、中藥組以及聯(lián)合組結(jié)腸癌裸鼠腫瘤組織CD133、CD166、p53蛋白表達(dá)水平均低于治療前，并顯著低于空白組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且聯(lián)合組的降低作用優(yōu)于化療組、中藥組（P＜0.05）。

圖3 各組結(jié)腸癌裸鼠治療后第7天腫瘤組織CD133、CD166、p53蛋白Western Blot電泳圖Figure 3 Western Blot electrophotogram of CD133，CD166 and p53 proteins in tumor tissue in each group of nude mice bearing colon cancer on 7th day after treatment

表4 各組結(jié)腸癌裸鼠腫瘤組織CD133、CD166、p53蛋白表達(dá)比較Table 4 Comparison of protein expressions of CD133，CD166 and p53 in tumor tissue among various groups of nude mice bearing colon cancer （±s）

表4 各組結(jié)腸癌裸鼠腫瘤組織CD133、CD166、p53蛋白表達(dá)比較Table 4 Comparison of protein expressions of CD133，CD166 and p53 in tumor tissue among various groups of nude mice bearing colon cancer （±s）

注：①P＜0.05，與同組治療前比較；②P＜0.05，與空白組治療后第7天比較；③P＜0.05，與化療組治療后第7天比較；④P＜0.05，與中藥組治療后第7天比較

組別空白組化療組中藥組聯(lián)合組鼠數(shù)/只8 8 8 8 CD133蛋白相對表達(dá)量治療前1.15±0.16 1.18±0.17 1.13±0.15 1.19±0.18治療后第7天1.39±0.21①0.74±0.12①②0.83±0.14①②0.52±0.08①②③④CD166蛋白相對表達(dá)量治療前1.26±0.14 1.23±0.16 1.28±0.17 1.24±0.13治療后第7天1.47±0.23 0.89±0.14①②0.85±0.11①②0.59±0.06①②③④p53蛋白相對表達(dá)量治療前1.39±0.18 1.41±0.19 1.37±0.16 1.42±0.15治療后第7天1.58±0.24 1.11±0.09①②0.86±0.15①②③0.64±0.13①②③④

3 討論

氟尿嘧啶等傳統(tǒng)化療方案的毒副反應(yīng)是影響化療實施的主要原因。滋陰補脾中藥復(fù)方是本科室臨床輔助治療胃腸道腫瘤的經(jīng)驗方。處方中以扶正益氣之藥黃芪、太子參、山藥等為君，以攻伐抗癌之藥白花蛇舌草為臣，佐以茯苓以助消癌，全方合用，共奏扶助正氣、攻伐癌腫之功效。本研究結(jié)果顯示，以人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型為研究對象，滋陰補脾法可以對結(jié)腸癌細(xì)胞生長起到抑制作用，與化療藥物聯(lián)用可以明顯抑制腫瘤生長，降低腫瘤標(biāo)志物表達(dá)，有助于結(jié)腸癌的化療藥物治療。

近年來，對癌干細(xì)胞的研究一直是科研的熱點，包括癌干細(xì)胞生物學(xué)鑒定、癌干細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展、癌干細(xì)胞標(biāo)志物以及癌干細(xì)胞對腫瘤治療的影響等[8]。癌干細(xì)胞具有一些特殊的表面標(biāo)志物（marker），如CD133、CD44、CD166等，不同的腫瘤癌干細(xì)胞表面marker不同。CD133和CD166也被公認(rèn)為識別結(jié)腸癌癌干細(xì)胞的表面marker[9-11]。有研究指出，結(jié)腸癌患者死亡率高、易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)的主要原因與癌干細(xì)胞相關(guān)，通過CD133、CD166表達(dá)水平，可以初步判斷癌干細(xì)胞的分化能力，評估結(jié)腸癌患者預(yù)后[12-14]。p53基因作為抑癌基因，主要由393個氨基酸組成，p53基因在細(xì)胞周期的調(diào)控、細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)、細(xì)胞分化等重要生物學(xué)功能有關(guān)，p53過表達(dá)被認(rèn)為與腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)以及不良預(yù)后關(guān)系密切[15-17]。本研究結(jié)果顯示，從開始治療至治療后第7天，空白組結(jié)腸癌裸鼠瘤體最大徑、最小徑，瘤體體積及瘤體質(zhì)量均呈現(xiàn)增長，且腫瘤組織CD133、CD166以及p53蛋白表達(dá)水平呈高表達(dá)；與空白組比較，化療組、中藥組以及聯(lián)合組結(jié)腸癌裸鼠瘤體最大徑、最小徑，瘤體體積及瘤體質(zhì)量均下降，抑瘤率增加，腫瘤組織CD133、CD166以及p53蛋白表達(dá)水平亦明顯下降，且聯(lián)合組作用效果明顯優(yōu)于化療組、中藥組。根據(jù)結(jié)果可以看出，僅給予生理鹽水對腫瘤生長無抑制作用，停止生理鹽水后腫瘤繼續(xù)生長，化療組在給予氟尿嘧啶干預(yù)后腫瘤停止生長且出現(xiàn)腫瘤體積變小的現(xiàn)象，表明腫瘤細(xì)胞對化療藥物敏感，化療效果顯著；中藥組結(jié)腸癌裸鼠給予滋陰補脾中藥復(fù)方治療后腫瘤體積亦被抑制，但是較化療組抑制效果稍顯不足；聯(lián)合組療效是最顯著的，表明化療藥物和滋陰補脾法中藥聯(lián)合使用，治療效果更佳。

綜上所述，滋陰補脾法可明顯抑制結(jié)腸癌裸鼠腫瘤細(xì)胞生長，下調(diào)腫瘤標(biāo)志物表達(dá)，與化療藥物聯(lián)用抑制腫瘤生長作用更優(yōu)，提示其有助于結(jié)腸癌的化療藥物治療，因此可考慮進(jìn)一步應(yīng)用于臨床研究。但是由于納入研究裸鼠數(shù)量有限，且研究周期較短，對藥物敏感度特異性的研究尚不足，因此有待進(jìn)一步評估此結(jié)論。