黃佳梅，蔡紫璨，張花，2，黎玲，2，葉朝陽，2，金志春，2

（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北武漢430065；2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬湖北婦幼保健院，湖北武漢 430070）

卵巢儲備功能減退（diminished ovarian reserve，DOR）是指卵巢皮質(zhì)區(qū)內(nèi)儲備的卵母細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量下降，常伴隨生殖內(nèi)分泌功能紊亂和生育能力下降。本病的發(fā)生機制目前尚不完全明確，但卵巢顆粒細(xì)胞異常凋亡而導(dǎo)致卵泡過度閉鎖是DOR發(fā)病的關(guān)鍵[1-2]。有研究通過觀察顆粒細(xì)胞的凋亡情況，評估卵母細(xì)胞和胚胎的形態(tài)，預(yù)測體外受精（IVF）的結(jié)局，發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞凋亡與IVF女性受孕和妊娠率呈負(fù)相關(guān)[3-4]。在治療上，對有生育需求的患者，鼓勵積極試孕，或采用輔酶Q10、生長激素、脫氫表雄酮、中醫(yī)藥等藥物預(yù)處理后進(jìn)行輔助生殖技術(shù)助孕，但這些藥物的療效目前尚無定論[2]，其中中醫(yī)藥因療效良好、副作用小等優(yōu)勢具有廣闊的應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步深入研究。

本課題組前期研究結(jié)果表明，補腎生精調(diào)和氣血法中藥復(fù)方可恢復(fù)DOR模型大鼠動情周期，降低血清卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、丙二醛（MDA）水平，升高血清雌二醇（E2）和抗氧化指標(biāo)超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）、總抗氧化能力（T-AOC）水平，改善DOR大鼠卵巢抗氧化損傷。本研究以B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）相關(guān)線粒體凋亡信號通路為切入點，進(jìn)一步探討補腎生精調(diào)和氣血法改善卵巢儲備功能的作用機制，以期為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料

1.1 動物60只SPF級性成熟雌性SD大鼠，體質(zhì)量200～220 g，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供，動物質(zhì)量合格證號：430727221100041752。實驗于華中科技大學(xué)實驗動物中心完成，動物使用許可證號：SYXK（鄂）2016-0057。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫24～25℃，濕度50%～60%，光照周期12/12 h（明/暗），自由攝食飲水。動物適應(yīng)環(huán)境7 d后用于實驗。本動物實驗經(jīng)華中科技大學(xué)動物倫理委員會審批通過（批號：S2699）。

1.2藥物補腎生精調(diào)和氣血法中藥復(fù)方組成：菟絲子15 g、補骨脂10 g、枸杞子15 g、熟地黃15 g、山茱萸15 g、山藥15 g、當(dāng)歸10 g、川芎10 g、白芍藥10 g、香附子10 g、黨參15 g、黃芪15 g、白術(shù)15 g。所有中藥飲片由湖北省婦幼保健院中藥房提供。采用常規(guī)水煎法制備，具體方法如下：取總藥材2倍量雙蒸水浸泡20 min后，武火煎煮，沸后文火再煎20 min，取藥汁；再加2倍量雙蒸水，武火沸后文火再煎20 min，取藥汁。將2次中藥汁均勻混合，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至生藥濃度1.0 g·mL-1，4℃密封保存?zhèn)溆?。安道生（注射用環(huán)磷酰胺，0.2 g×1支，德國Baxter Oncology GmbH公司生產(chǎn)，批號：1A445A）；補佳樂（戊酸雌二醇片，每片含戊酸雌二醇1 mg，拜爾醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)，批號：626A）。

1.3 試劑卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；雌二醇（E2）、抗苗勒管激素（AMH）等檢測試劑盒（羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司）；B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）抗體（美國Abcam公司）；兔抗Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）抗體（美國Novus Biologicals公司）；兔抗半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）抗體、兔抗半胱氨酸蛋白酶9（Caspase-9）抗體、兔抗血紅素氧合酶1（HO-1）抗體、小鼠抗醌氧化還原酶1（NQO-1）抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；DAKO免疫組化試劑盒，大鼠HO-1、NQO-1、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9內(nèi)參引物合成（武漢恒意賽生物科技有限公司）；NucleoZOL試劑（德國Macherey-Nagel公司）；Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit試劑盒（美國New England Biolabs公司）。

1.4 儀器DM4000生物顯微鏡（德國Leika公司）；Access全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（美國Beckman Couiter公司）；iMark酶 標(biāo)儀、Mini-PROTEAN Tetra電泳槽、MiniP4小型垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、CFX Connect熒光定量PCR檢測系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；BG-gdsAUTO 710 MINI化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（上海Baygene生物技術(shù)有限公司）；P100+超微量分光光度計（美國Pultton公司）。

2 方法

2.1 分組與動物模型制備適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束次日起，每日檢查實驗大鼠陰道脫落細(xì)胞，陰道涂片見大鼠動情周期4～5 d規(guī)律性改變（動情前期、動情期、動情后期、動情間期）。將動情周期正常的大鼠按隨機數(shù)字表分為正常組，模型組，西藥組，中藥低、中、高劑量組，每組各10只。除正常組外，其余各組大鼠參照前期預(yù)實驗?zāi)Ｐ脱芯拷o予75 mg·kg-1環(huán)磷酰胺單次腹腔注射復(fù)制DOR模型。正常組給予等體積生理鹽水腹腔注射。每日上午10點進(jìn)行陰道細(xì)胞學(xué)涂片，觀察大鼠動情周期變化情況，以造模大鼠出現(xiàn)動情周期紊亂（周期延長、停滯或無明顯周期改變）確定造模成功[5]。

2.2 給藥動物給藥劑量參照“人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表”[6]進(jìn)行換算。于造模次日開始，西藥組給予戊酸雌二醇片混懸液（溶于去離子水）0.105 mg·kg-1·d-1灌胃，中藥低、中、高劑量組分別對應(yīng)給予補腎生精調(diào)和氣血法中藥復(fù)方水煎液8.075、16.15、32.3 g·kg-1·d-1灌胃，正常組、模型組給予等體積去離子水灌胃，每日1次，連續(xù)21 d。

2.3 大鼠一般情況及動情周期自造模當(dāng)日開始每日觀察各組大鼠一般情況，包括飲食攝水量、皮毛色澤、精神狀態(tài)、二便情況、體質(zhì)量，同時進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片，觀察動情周期變化。

2.4 取材給藥結(jié)束后次日，麻醉大鼠，心尖取血，分離血清，置-20℃冰箱備測。取出雙側(cè)卵巢稱質(zhì)量，一側(cè)卵巢置于4%多聚甲醛中固定，另一側(cè)干冰速凍后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 血清FSH、LH、E2、AMH水平檢測采用ELISA法檢測血清FSH、LH，采用電化學(xué)發(fā)光法檢測血清E2、AMH水平，具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.6蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察卵巢病理組織學(xué)變化取卵巢組織于4%多聚甲醛中固定48 h后，進(jìn)行浸蠟、脫水、石蠟包埋、切片，HE常規(guī)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察卵巢病理組織學(xué)變化。

2.7 Western Blot法檢測大鼠卵巢組織中HO-1、NQO-1、Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9的蛋白表達(dá)放射免疫沉淀分析（RIPA）液裂解離心提取卵巢組織總蛋白，按照蛋白定量試劑盒進(jìn)行樣本蛋白含量測定，加5×Laemmli混勻，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。以鼠?actin為內(nèi)參，進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加按體積比稀釋的一抗HO-1（1∶2 000）、NQO-1（1∶10 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Caspase-3（1∶1 000）、Caspase-9（1∶1 000）4℃冰箱孵育過夜，加按體積比稀釋的二抗（1∶20 000）室溫孵育2 h，顯影，結(jié)果使用ImageJ軟件測定圖像平均灰度值數(shù)據(jù)后進(jìn)行分析統(tǒng)計。

2.8 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法檢測大鼠卵巢組織中HO-1、NQO-1、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9的mRNA表達(dá)NucleoZOL裂解并提取卵巢組織中總RNA，測定RNA樣品濃度，設(shè)計目的基因?qū)?yīng)引物，HO-1、NQO-1、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9引物序列見表1。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，按照Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit試劑盒說明書操作。以20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行檢測，反應(yīng)體系：One-Step Reaction Mix 10 μL、RT Enzyme Mix 1 μL、0.4 μmol/L上游引物、0.4 μmol/L下游引物、2 μL RNA樣品（濃度0.1 μg/μL）。反應(yīng)條件：反轉(zhuǎn)錄55℃10 min；預(yù)變性95℃3 min；變性95℃10 s、退火58℃30 s、延伸72℃30 s共循環(huán)40次。結(jié)果使用Bio-Rad CFX Manger軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析，并計算目的基因mRNA的相對表達(dá)量。

表1 PCR引物序列表Table 1 Sequence list of PCR primers

2.9 統(tǒng)計方法采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 補腎生精調(diào)和氣血法對DOR大鼠血清性激素水平的影響表2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清FSH、LH水平升高，E2、AMH水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組和中藥中、高劑量組血清FSH及西藥組和中藥低、中、高劑量組LH水平降低，各給藥組E2及中藥高劑量組AMH水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。中藥各劑量組上述指標(biāo)與西藥組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠血清FSH、LH、E2、AMH水平比較Table 2 Comparison of serum FSH，LH，E2 and AMH levels among various groups of rats （±s）

表2 各組大鼠血清FSH、LH、E2、AMH水平比較Table 2 Comparison of serum FSH，LH，E2 and AMH levels among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組西藥組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組鼠數(shù)/只5 5 5 5 5 5 FSH/（ng·mL-1）91.486±17.143 158.343±16.296①112.816±9.782②146.005±31.961 108.104±13.517②117.765±18.827②LH/（mIU·mL-1）33.993±6.964 61.716±5.544①43.558±2.991②47.270±1.029②35.591±3.067②40.283±5.036②E2/（pg·mL-1）27.976±7.899 9.522±2.396①48.362±5.937②29.294±6.298②40.592±4.382②35.424±7.874②AMH/（ng·mL-1）2.728±0.677 1.472±0.234①1.878±0.328 1.796±0.719 1.762±0.431 2.388±0.370②

3.2 補腎生精調(diào)和氣血法對DOR大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)的影響圖1結(jié)果顯示：正常組可見各級卵泡均勻生長（包括初級卵泡、次級卵泡、發(fā)育卵泡）。與正常組比較，模型組卵巢皮質(zhì)處生長卵泡較少，以初級卵泡為主，且部分卵泡內(nèi)僅1～2層顆粒細(xì)胞環(huán)繞，閉鎖卵泡增多。藥物干預(yù)后，西藥組和中藥低、中、高劑量組卵巢皮質(zhì)生長卵泡數(shù)量較模型組明顯增多，閉鎖卵泡減少，且黃體組織體積增大。中藥中、高劑量組卵泡顆粒細(xì)胞及生長卵泡數(shù)量較西藥組多。

圖1 各組大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)比較（HE染色，×100）Figure 1 Comparison of the histomorphology of the ovaries among various groups of rats（HE staining，×100）

3.3 補腎生精調(diào)和氣血法對DOR大鼠卵巢組織HO-1、NQO-1、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響表3、圖2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織HO-1、NQO-1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)水平上調(diào)（均P＜0.05）；與模型組比較，西藥組和中藥中、高劑量組HO-1，中藥低、中、高劑量組NQO-1，西藥組和中藥中、高劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)水平上調(diào)（均P＜0.05），中藥高劑量組Bax水平下調(diào)（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠卵巢組織HO-1、NQO-1、Bcl-2、Bax蛋白的Western Blot電泳圖Figure 2 Western Blot electrophotogram of HO-1，NQO-1，Bcl-2 and Bax proteins in rat ovarian tissue in various groups of rats

表3 各組大鼠卵巢組織HO-1、NQO-1、Bcl-2、Bax蛋白相對表達(dá)量比較Table 3 Comparison of the protein relative expressions of HO-1，NQO-1，Bcl-2 and Bax in the ovarian tissues among various groups of rats （±s）

表3 各組大鼠卵巢組織HO-1、NQO-1、Bcl-2、Bax蛋白相對表達(dá)量比較Table 3 Comparison of the protein relative expressions of HO-1，NQO-1，Bcl-2 and Bax in the ovarian tissues among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組西藥組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組鼠數(shù)/只5 5 5 5 5 5 HO-1 1.000±0.053 0.577±0.031①0.359±0.004②0.547±0.071 0.773±0.062②1.016±0.081②NQO-1 1.000±0.041 0.242±0.031①0.221±0.012 0.514±0.055②0.412±0.014②0.404±0.025②Bcl-2 1.000±0.070 0.625±0.020①1.127±0.068②0.580±0.065 1.000±0.078②0.836±0.033②Bax 1.000±0.024 2.728±0.044①3.125±0.545 2.596±0.235 2.248±0.102 1.129±0.047②

3.4 補腎生精調(diào)和氣血法對DOR大鼠卵巢組織Caspase-3、cleaved Caspase-3、Caspase-9、cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)的影響表4、圖3結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織cleaved Caspase-3、Caspase-9、cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平升高（均P＜0.05）；與模型組比較，西藥組和中藥低、中、高劑量組Caspase-3、cleaved Caspase-3、Caspase-9、cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平均呈下調(diào)趨勢，其中，中藥低、高劑量組Caspase-3，中藥低、中、高劑量組cleaved Caspase-3，中藥低劑量組Caspase-9及中藥低、中劑量組cleaved Caspase-9下調(diào)水平有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠卵巢組織Caspase-3、cleaved Caspase-3、Caspase-9、cleaved Caspase-9蛋白的Western Blot電泳圖Figure 3 Western Blot electrophotogram of Caspase-3，cleaved Caspase-3，Caspase-9 and cleaved Caspase-9 proteins in rat ovarian tissue among various groups of rats

表4 各組大鼠卵巢組織Caspase-3、cleaved Caspase-3、Caspase-9、cleaved Caspase-9蛋白相對表達(dá)量比較Table 4 Comparison of the protein relative expressions of Caspase-3，cleaved Caspase-3，Caspase-9 and cleaved Caspase-9 in rat ovarian tissue among various groups of rats （±s）

表4 各組大鼠卵巢組織Caspase-3、cleaved Caspase-3、Caspase-9、cleaved Caspase-9蛋白相對表達(dá)量比較Table 4 Comparison of the protein relative expressions of Caspase-3，cleaved Caspase-3，Caspase-9 and cleaved Caspase-9 in rat ovarian tissue among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組西藥組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組鼠數(shù)/只5 5 5 5 5 5 Caspase-3 1.000±0.141 1.190±0.071 1.169±0.163 0.625±0.051①②0.918±0.072 0.315±0.015①②cleaved Caspase-3 1.000±0.055 5.554±0.228①5.044±0.400 2.224±0.618②1.301±0.199②3.676±0.503②Caspase-9 1.000±0.077 1.681±0.165①1.603±0.201 1.221±0.136②1.448±0.122 1.517±0.108 cleaved Caspase-9 1.000±0.085 1.431±0.148①1.312±0.137 0.510±0.045①②0.953±0.104②1.347±0.127

3.5 補腎生精調(diào)和氣血法對DOR大鼠卵巢組織HO-1、NQO-1、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)的影響表5結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)水平升高（均P＜0.05），HO-1、NQO-1、Bcl-2 mRNA表達(dá)有下調(diào)趨勢，Bax mRNA表達(dá)上調(diào)（均P＞0.05）；與模型組比較，西藥組和中藥低、中、高劑量組HO-1、NQO-1、Bcl-2 mRNA表達(dá)均有上調(diào)趨勢，其中，中藥低、中劑量組HO-1，西藥組和中藥低、中劑量組Bcl-2 mRNA上調(diào)水平有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），Bax、Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)均有下調(diào)趨勢，其中，西藥組和中藥低、中、高劑量組Caspase-3，中藥低、中、高劑量組Caspase-9 mRNA表達(dá)下調(diào)水平有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

表5 各組大鼠卵巢組織HO-1、NQO-1、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9 mRNA相對表達(dá)量比較Table 5 Comparison of the mRNA relative expressions of HO-1，NQO-1，Bcl-2，Bax，Caspase-3 and Caspase-9 in the ovarian tissue among various groups of rats （±s）

表5 各組大鼠卵巢組織HO-1、NQO-1、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9 mRNA相對表達(dá)量比較Table 5 Comparison of the mRNA relative expressions of HO-1，NQO-1，Bcl-2，Bax，Caspase-3 and Caspase-9 in the ovarian tissue among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組西藥組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組鼠數(shù)/只5 5 5 5 5 5 HO-1 1.003±0.101 0.489±0.099 1.539±0.174 1.591±0.346②1.265±0.255②1.083±0.473 NQO-1 1.012±0.190 0.630±0.268 0.910±0.229 1.162±0.235 1.456±0.291 1.111±0.216 Bcl-2 2.090±0.491 1.044±0.230 3.385±0.509②3.225±0.529②4.759±0.625①②2.337±0.510 Bax 1.040±0.328 1.591±0.413 0.779±0.316 1.368±0.414 1.325±0.238 0.955±0.499 Caspase-3 1.567±0.656 4.120±0.480①1.300±0.469②1.647±0.210②1.217±0.294②0.685±0.209②Caspase-9 0.806±0.312 2.831±0.568①1.937±0.068 0.929±0.129②1.369±0.375②1.247±0.396②

4 討論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種形式，維持著機體穩(wěn)態(tài)的平衡，細(xì)胞過度凋亡可引發(fā)機體神經(jīng)退行性疾病、自身免疫疾病及發(fā)育不全等多種疾病，女性卵巢卵泡發(fā)育、排卵和黃體形成退化的復(fù)雜調(diào)控同樣依賴促凋亡和抗凋亡因子的平衡調(diào)節(jié)[4，7]。卵泡顆粒細(xì)胞過度凋亡會導(dǎo)致卵泡加速閉鎖，卵巢卵泡中主要涉及環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、Bcl-2、Fas/FasL 3條細(xì)胞凋亡信號通路[8]。其中，Bcl-2家族蛋白主要包括以Bcl-2為代表的抗凋亡蛋白和以Bax為代表的促凋亡效應(yīng)蛋白作用于線粒體外膜，共同調(diào)控著線粒體外膜通透性及線粒體凋亡途徑。激活的Bax因子在線粒體外膜聚合并形成孔道，使線粒體外膜通透性改變，并觸發(fā)線粒體中細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）等多種凋亡因子釋放入胞漿，細(xì)胞色素C、凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）與Caspase-9前體結(jié)合形成凋亡復(fù)合體[9]。Caspase-9為凋亡啟動因子，結(jié)合后發(fā)生自身切割活化為cleaved Caspase-9，進(jìn)一步激活下游Caspase-3等效應(yīng)因子，剪切并活化為cleaved Caspase-3，釋放細(xì)胞色素C誘導(dǎo)凋亡級聯(lián)反應(yīng)，形成凋亡小體[4，7]。Bcl-2則通過抑制Bax的活性，將其隔離在線粒體外膜，以阻斷凋亡信號傳導(dǎo)[10]。隨著卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，血清E2、AMH分泌減少，在下丘腦-垂體-卵巢軸（HPOA）負(fù)反饋的調(diào)節(jié)下血清FSH、LH分泌持續(xù)增多，從而出現(xiàn)不同程度的卵巢功能減退；而FSH、LH、E2、AMH等生殖激素同時也影響著顆粒細(xì)胞的凋亡[11]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清FSH、LH水平升高，E2、AMH水平降低，卵巢組織可見生長卵泡明顯減少，提示環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)卵巢儲備功能減退（DOR）造模成功。中藥干預(yù)后，DOR大鼠生殖內(nèi)分泌水平及卵巢卵泡生長情況均有所恢復(fù)。

除上述經(jīng)典凋亡途徑外，機體過高的活性氧（ROS）水平引起氧化應(yīng)激同樣可以激活線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡[12-13]。研究[14-15]發(fā)現(xiàn)，Bcl-2具有促氧化劑和抗氧化劑活性的作用，可通過多種途徑微調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，將細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)維持在對細(xì)胞生存最有利的水平，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，防止ROS的過度積累，從而抑制線粒體凋亡信號傳導(dǎo)。Bcl-2的表達(dá)對細(xì)胞過氧化氫酶（CAT）、SOD、GSH、環(huán)氧化酶（COX）等多種抗氧化因子的活性均有影響[16]。Keap1/Nrf2/抗氧化反應(yīng)元件（ARE）是機體抵抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵信號通路，可通過位于Bcl-2啟動子內(nèi)的ARE調(diào)節(jié)Bcl-2的轉(zhuǎn)錄，而血紅素加氧酶1（HO-1）和醌氧化還原酶1（NQO-1）是該通路下游的關(guān)鍵靶基因[17]。本課題組前期研究結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺制備的DOR模型大鼠出現(xiàn)氧化損傷狀態(tài)、卵巢儲備功能下降，表現(xiàn)為血清SOD、GSH、TAOC水平下降，MDA水平升高。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)DOR模型大鼠卵巢Bcl-2、HO-1、NQO-1蛋白及mRNA表達(dá)下調(diào)，Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白及mRNA表達(dá)上調(diào)，提示DOR模型大鼠發(fā)病機制與Bcl-2相關(guān)線粒體凋亡信號通路有關(guān)。

DOR歸屬于中醫(yī)學(xué)“經(jīng)水早斷”“月經(jīng)過少”“閉經(jīng)”“不孕”等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，DOR主要病機為先天腎精虛衰，后天腎精充養(yǎng)不足，脾腎虛弱，沖任氣血失調(diào)。近年來，運用中藥單體、復(fù)方、針灸等抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡、抗氧化損傷，是改善卵巢儲備功能研究的熱點，其治療多以補腎健脾、行氣養(yǎng)血填精為主[18-19]。補腎生精調(diào)和氣血法中藥復(fù)方為本課題組長期臨床及實驗研究的基礎(chǔ)方，前期臨床研究結(jié)果顯示，本方聯(lián)合雌孕激素治療可有效改善卵巢早衰患者月經(jīng)周期、陰道干澀和性欲低下等癥狀，調(diào)節(jié)患者生殖內(nèi)分泌，并改善子宮內(nèi)膜厚度、卵巢體積和竇卵泡數(shù)[20-21]。并在實驗研究[22-23]中發(fā)現(xiàn)，本方可上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及其受體Flt-1、激酶插入?yún)^(qū)受體（KDR）蛋白的表達(dá)，具有促進(jìn)卵巢組織間質(zhì)血管生成的作用，可間接改善卵巢儲備功能。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)補腎生精調(diào)和氣血法可通過上調(diào)卵巢HO-1、NQO-1、Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，阻斷下游Caspase相關(guān)蛋白的激活，發(fā)揮卵巢保護(hù)作用，提示補腎生精調(diào)和氣血法調(diào)控Bcl-2相關(guān)線粒體凋亡信號通路，抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，可能是其改善大鼠DOR的機制之一。

綜上所述，補腎生精調(diào)和氣血法中藥可通過調(diào)控Bcl-2相關(guān)線粒體凋亡信號通路，抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，改善大鼠卵巢儲備功能。