潘友燦，劉彥宜，尹雷，孫健

（1.廣東省中醫(yī)院芳村醫(yī)院傳統(tǒng)療法科，廣東廣州510380；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)期刊中心，廣東廣州510006；3.廣東省中醫(yī)院腦病六科，廣東廣州 510120）

目前，卒中（cerebral stroke，CS）已成為主要的全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題。2020年發(fā)布的《中國(guó)卒中報(bào)告》顯示：我國(guó)卒中患病率為1 114.8/10萬(wàn)，死亡率為149.49/10萬(wàn)[1]。在全球范圍內(nèi)，我國(guó)已經(jīng)成為卒中終身風(fēng)險(xiǎn)最高和疾病負(fù)擔(dān)最重的國(guó)家[2]。卒中后認(rèn)知障礙（post-stroke cognitive impairment，PSCI）是卒中常見(jiàn)的并發(fā)癥。近期大型國(guó)際隊(duì)列研究報(bào)道，卒中幸存者10年內(nèi)PSCI的患病率為61%[3]，而且卒中后認(rèn)知功能障礙患者的死亡率明顯高于無(wú)認(rèn)知障礙患者，卒中后癡呆患者的5年生存率僅為39%，而同齡無(wú)癡呆癥狀的卒中患者生存率為75%[4]。因此，PSCI已成為影響我國(guó)經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展的重大公共衛(wèi)生健康問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題。在治療方面，西醫(yī)主要以多奈哌齊類膽堿酯酶抑制劑為主，但該類藥物只能夠短期改善臨床癥狀，不能長(zhǎng)期延緩病情的進(jìn)展[5]。針灸治療PSCI具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)?！巴ǘ秸{(diào)神”針刺法是許能貴教授以百會(huì)、大椎穴為主穴，治療缺血性中風(fēng)及其并發(fā)癥的治療方案。本課題組前期臨床試驗(yàn)證實(shí)，電針“百會(huì)”“大椎”穴可有效改善缺血性卒中患者認(rèn)知障礙、延緩病程進(jìn)展[6]。盡管該針刺方案治療卒中后認(rèn)知障礙臨床療效確切，但其機(jī)制尚不清楚，從而限制了其臨床的推廣與運(yùn)用。因此，進(jìn)一步探討該方案治療卒中后認(rèn)知障礙的機(jī)制對(duì)本病的有效防治具有重要的臨床意義。

大量研究發(fā)現(xiàn)，在缺血性卒中患者和模型動(dòng)物的海馬和丘腦等與認(rèn)知功能密切相關(guān)的大腦結(jié)構(gòu)中，出現(xiàn)β淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）沉積[7]。Aβ沉積導(dǎo)致神經(jīng)元信號(hào)通路的破壞，從而影響神經(jīng)元形態(tài)和功能，導(dǎo)致記憶和行為缺陷是學(xué)術(shù)界公認(rèn)的卒中后認(rèn)知障礙的重要原因[8]。有研究顯示，針刺對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦組織中Aβ沉積及其前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用[9]?；谝陨衔墨I(xiàn)分析與前期試驗(yàn)結(jié)果，我們假設(shè)：電針百會(huì)、大椎穴可能通過(guò)抑制Aβ的沉積、減少神經(jīng)元損傷，從而發(fā)揮改善認(rèn)知障礙的作用。為了證實(shí)這一科學(xué)假設(shè)，本研究通過(guò)大腦中動(dòng)脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）法誘導(dǎo)建立缺血性卒中動(dòng)物模型，并觀察電針百會(huì)、大椎穴對(duì)其學(xué)習(xí)記憶能力的影響，著重研究針刺對(duì)海馬神經(jīng)元保護(hù)和Aβ蛋白沉積的調(diào)控作用，探討針刺治療卒中后認(rèn)知障礙的可能機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡健康雄性SPF級(jí)C57BL/6小鼠45只，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（粵）2013-0024，體質(zhì)量21.3～22.6 g。所有實(shí)驗(yàn)程序嚴(yán)格按照中華人民共和國(guó)科技部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用指南執(zhí)行。小鼠在食物充足、12 h暗/光循環(huán)的環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2 主要儀器與試劑

中研太和牌針灸針（北京中研太和醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品，規(guī)格：0.2 mm×13 mm）；單絲縫合線（5-0 mm，美國(guó)Doccol公司）；6805-I型電針治療儀（青島鑫升實(shí)業(yè)有限公司提供）；新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)裝置（上海欣軟信息科技有限公司）；水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置（上海欣軟信息科技有限公司）；冰凍切片機(jī)（英國(guó)賽默飛公司）。超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（P0018，上海碧云天公司）；FD Rapid GolgiStain試劑（美國(guó)FD NeuroTechnologies公司，貨號(hào)：PK401）；抗APP抗體（英國(guó)賽默飛公司，批號(hào)：512700）、抗Aβ抗體（美國(guó)Biolegend公司，批號(hào)：803017）；抗GRPDH抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司，批號(hào)：517400）。

1.3 分組與模型建立

將45只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)選取33只進(jìn)行造模，作為MCAO手術(shù)組，其余12只設(shè)為假手術(shù)組。按照Rousselet等[10]報(bào)道的使用MCAO方法誘導(dǎo)缺血性卒中模型：采用5%的異氟醚對(duì)小鼠進(jìn)行深度麻醉后放置在保溫墊上，體溫維持在37℃，手術(shù)暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈。結(jié)扎頸外動(dòng)脈，然后將涂硅5-0單絲縫合線通過(guò)頸外動(dòng)脈殘端插入頸內(nèi)動(dòng)脈，在距插入點(diǎn)9～10 mm處栓塞大腦中動(dòng)脈。MCAO 2 h后，拆線開(kāi)始再灌注。假手術(shù)組小鼠在沒(méi)有閉塞大腦中動(dòng)脈的情況下接受相同的方案。小鼠蘇醒后使用Longa評(píng)分評(píng)估MCAO模型是否成功建立[11]。造模過(guò)程中小鼠死亡8只，死亡率為24.2%（8/33），另有2只手術(shù)后未出現(xiàn)明顯偏癱，故剔除，造模成功率為69.7%（23/33）。造模成功小鼠被隨機(jī)分為模型組11只、電針組12只。

1.4 電針?lè)桨?/h3>

造模成功1周后，將小鼠固定在約束器中馴化1周，確保針刺過(guò)程中無(wú)掙扎以避免應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)誤差。腧穴定位參考李忠仁主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[12]常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位。取百會(huì)、大椎穴，直刺2～3 mm，接通電針儀。電針參數(shù)根據(jù)我們前期實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)[13]設(shè)置為：電流1～2 mA，頻率4～20 Hz，強(qiáng)度以引起穴位周圍組織輕微顫動(dòng)為度。每日1次，每次20 min，連續(xù)15 d。

1.5 觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法

1.5.1 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)

在針刺治療結(jié)束后第1天進(jìn)行新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)，觀察各組小鼠記憶形成能力。實(shí)驗(yàn)方法[14]如下：在熟悉階段，將小鼠放置在裝有兩個(gè)完全相同物體的40 cm×40 cm的正方形盒子中10 min。10 min結(jié)束后，立即將小鼠放回原來(lái)飼養(yǎng)的鼠籠里，待小鼠休息1 h后進(jìn)入測(cè)試階段，其中一個(gè)物體被同一位置的新物體替換，每只小鼠探索該領(lǐng)域5 min。兩次試驗(yàn)之間用75%乙醇徹底清潔盒子和物體以消除嗅覺(jué)線索。以小鼠前爪搭在物體上、鼻子嗅物體、舔物體視為探索行為。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中記錄每只小鼠在熟悉和測(cè)試階段探索對(duì)象所花費(fèi)的時(shí)間。以探索新物體的時(shí)間和總探索時(shí)間的比值（認(rèn)知指數(shù)）作為觀察指標(biāo)。

1.5.2 水迷宮實(shí)驗(yàn)

在針刺治療完成后第2天進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，觀察各組小鼠對(duì)空間位置感和方向感的學(xué)習(xí)記憶能力。根據(jù)Gawel等[15]論述，該實(shí)驗(yàn)在一個(gè)直徑80 cm、高31 cm的圓形水池中進(jìn)行。水池中放入全脂牛奶因而水面不透明，水面下隱藏一直徑5 cm、高14 cm逃生平臺(tái)。水池被平均劃分為東、西、南、北四個(gè)象限。首先，進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，將小鼠頭朝池壁從任一象限放入水池中，記錄小鼠尋找到隱藏在水面下平臺(tái)的時(shí)間（逃離潛伏期）。在前幾次訓(xùn)練中，如果小鼠70 s內(nèi)未找到隱藏平臺(tái)，則引導(dǎo)小鼠至平臺(tái)上并停留10 s。每只小鼠每天訓(xùn)練3次，每次訓(xùn)練間隔15～20 min，連續(xù)4 d。水迷宮實(shí)驗(yàn)第5天移除平臺(tái)后進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，將小鼠由原平臺(tái)象限的對(duì)側(cè)放入水中，記錄小鼠在70 s內(nèi)穿越原平臺(tái)的次數(shù)（平臺(tái)穿越次數(shù)）和平臺(tái)象限滯留時(shí)間占總時(shí)間的比例，以獲得訓(xùn)練中逃離潛伏期和對(duì)位探查訓(xùn)練中平臺(tái)穿越次數(shù)與平臺(tái)象限滯留時(shí)間比為觀察指標(biāo)。

1.5.3 高爾基染色

在針刺治療完成后第7天進(jìn)行高爾基染色實(shí)驗(yàn)觀察各組小鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)，根據(jù)FD Rapid GolgiStain試劑盒說(shuō)明書(shū)及本課題組前期實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)[16]進(jìn)行操作。小鼠深度麻醉后頸椎脫位處死，立即提取腦組織，采用0.9%氯化鈉溶液沖洗后使用FD Rapid GolgiStain試劑盒中A液和B液1∶1混合溶液中避光浸漬2周，轉(zhuǎn)移腦組織到C溶液保存48 h后在冰凍切片上切片。將切片放置在涂有明膠涂層的載玻片上，C液浸泡，室溫中干燥、脫水后用二甲苯溶液洗脫，中性樹(shù)膠封片。每組每只小鼠觀察4個(gè)海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元。在顯微鏡下，選擇靠近切片中心的錐體細(xì)胞，在40倍鏡下繪制在二維平面上。采用Sholl分析軟件以神經(jīng)元胞體為圓心畫(huà)一系列同心圓，同心圓半徑以20 μm逐漸擴(kuò)大，得到離胞體距離變化的神經(jīng)元樹(shù)突與同心圓交點(diǎn)個(gè)數(shù)（交叉點(diǎn)數(shù)量）和樹(shù)突分枝數(shù)量。以交叉點(diǎn)數(shù)量和樹(shù)突分枝數(shù)量為觀察指標(biāo)。

1.5.4 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)

根據(jù)蛋白質(zhì)提取試劑盒說(shuō)明提取小鼠海馬蛋白質(zhì)，常規(guī)配制濃縮膠和分離膠，蛋白加樣，與電泳加樣緩沖液混勻，分離等體積的蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜在5%脫脂牛奶中封閉1 h，然后加入一抗（Aβ所用濃度1∶1 000，APP所用濃度1∶800，GRPDH所用濃度1∶5 000）4℃孵育過(guò)夜。用含有Tween 20緩沖鹽水沖洗膜3次，然后將膜與HRP偶聯(lián)的二抗孵育2 h。采用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色后，顯影和定影拍照。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，并使用ImageJ軟件通過(guò)光密度分析確定蛋白質(zhì)的定量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。首先對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)、方差齊性檢驗(yàn)，經(jīng)檢驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素重復(fù)測(cè)量方差分析或者雙因素重復(fù)測(cè)量方差分析。當(dāng)P＜0.05時(shí)定義差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠在新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中偏好指數(shù)比較

為了驗(yàn)證電針百會(huì)、大椎是否能夠改善缺血性卒中模型小鼠的認(rèn)知功能，進(jìn)行新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)，觀察小鼠記憶形成能力差異。表1結(jié)果顯示：在熟悉階段，各組小鼠對(duì)相同物體的偏好指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），排除了小鼠空間偏向?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。在實(shí)驗(yàn)階段，模型組小鼠對(duì)新物體偏好指數(shù)顯著減少，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；電針組小鼠對(duì)新物體偏好指數(shù)顯著增加，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組小鼠偏好指數(shù)比較Table 1 Comparison of the preference index among various groups of mice （±s，%）

表1 各組小鼠偏好指數(shù)比較Table 1 Comparison of the preference index among various groups of mice （±s，%）

注：①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別假手術(shù)組模型組電針組鼠數(shù)/只12 11 12熟悉階段51.16±12.84 50.42±6.83 48.92±10.19實(shí)驗(yàn)階段70.25±7.97 55.42±11.08①66.25±11.02②

2.2 各組小鼠逃避潛伏期比較

為了進(jìn)一步驗(yàn)證電針百會(huì)、大椎對(duì)缺血性卒中模型小鼠認(rèn)知功能的改善作用，進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，觀察各組小鼠對(duì)空間位置感和方向感的學(xué)習(xí)記憶能力差異。表2結(jié)果顯示：在定位航行實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠第3、4天逃避潛伏期延長(zhǎng)，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；電針組小鼠第4天逃避潛伏期縮短，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組小鼠逃避潛伏期比較Table 2 Comparison of the escape latency among various groups of mice （±s，s）

表2 各組小鼠逃避潛伏期比較Table 2 Comparison of the escape latency among various groups of mice （±s，s）

注：①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別假手術(shù)組模型組電針組鼠數(shù)/只12 11 12第1天66.17±3.43 65.58±2.84 66.67±2.90第2天54.58±9.74 61.67±9.59 57.33±6.17第3天43.00±14.51 56.92±9.89①47.42±11.84第4天30.58±8.35 46.92±10.75①32.25±10.66②

2.3 各組小鼠平臺(tái)穿越次數(shù)和平臺(tái)象限滯留時(shí)間比比較

表3結(jié)果顯示：在空間探索實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠平臺(tái)穿越次數(shù)和平臺(tái)象限滯留時(shí)間比均顯著減少，與假手術(shù)組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；電針組小鼠平臺(tái)穿越次數(shù)和平臺(tái)象限滯留時(shí)間比均顯著增加，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組小鼠平臺(tái)穿越次數(shù)和平臺(tái)象限滯留時(shí)間比比較Table 3 Comparison of the platform crossings times and plateau quadrant retention time ratios among various groups of mice （±s）

表3 各組小鼠平臺(tái)穿越次數(shù)和平臺(tái)象限滯留時(shí)間比比較Table 3 Comparison of the platform crossings times and plateau quadrant retention time ratios among various groups of mice （±s）

注：①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別假手術(shù)組模型組電針組鼠數(shù)/只12 11 12平臺(tái)穿越次數(shù)/次3.25±0.75 2.08±0.67①3.08±0.79②平臺(tái)象限滯留時(shí)間比/%38.08±5.45 28.67±4.23①34.25±6.11②

2.4 各組小鼠海馬CA 1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)比較

鑒于認(rèn)知障礙和與神經(jīng)元的病理性改變有關(guān)，我們利用Golgi staining觀察各組小鼠神經(jīng)元形態(tài)差異（如圖1所示）。表4結(jié)果顯示：模型組小鼠海馬神經(jīng)元樹(shù)突與同心圓交叉點(diǎn)數(shù)量減少，與假手術(shù)組比較，模型組同心圓與胞體的距離為100、140、180 μm時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；電針組小鼠海馬神經(jīng)元樹(shù)突與同心圓交叉點(diǎn)數(shù)量增加，與模型組比較，電針組同心圓與胞體的距離為100、140、180 μm時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 各組小鼠神經(jīng)元樹(shù)突與同心圓交叉點(diǎn)數(shù)量比較Table 4 Comparison of the number of neuronal dendrites and concentric circle crossings among various groups of mice （±s，個(gè)）

表4 各組小鼠神經(jīng)元樹(shù)突與同心圓交叉點(diǎn)數(shù)量比較Table 4 Comparison of the number of neuronal dendrites and concentric circle crossings among various groups of mice （±s，個(gè)）

注：①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別假手術(shù)組模型組電針組鼠數(shù)/只12 11 12同心圓與胞體的距離/μm 20 2.66±1.37 2.50±1.31 3.00±1.76 60 10.50±2.11 8.67±1.67 9.58±1.98 100 13.58±1.88 10.00±2.30①13.50±1.88②140 15.25±1.82 10.00±1.75①14.91±2.27②180 12.42±2.78 6.50±3.71①11.83±2.16②200 7.00±4.02 3.50±3.55 6.00±2.04

圖1 高爾基染色實(shí)驗(yàn)分析各組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化Figure 1 Morphological changes of neurons in the CA1 region of the hippocampus in various groups of mice analyzed by Golgi staining experiment

表5結(jié)果顯示：模型組小鼠樹(shù)突分支數(shù)量顯著減少，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；電針組小鼠樹(shù)突分支數(shù)量顯著增加，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表5 各組小鼠樹(shù)突分支數(shù)量比較Table 5 Comparison of the number of dendritic branches among various groups of mice（±s）

表5 各組小鼠樹(shù)突分支數(shù)量比較Table 5 Comparison of the number of dendritic branches among various groups of mice（±s）

注：①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別假手術(shù)組模型組電針組鼠數(shù)/只12 11 12樹(shù)突分枝數(shù)量/個(gè)46.83±11.44 35.08±10.04①45.25±7.99②

2.5 各組小鼠海馬組織Aβ斑塊沉積和APP表達(dá)比較

Aβ斑塊沉積可導(dǎo)致突觸衰竭、樹(shù)突和軸突受損[17]。Golgi staining實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，電針改善了神經(jīng)元形態(tài)受損，因此，我們研究了這種作用是否可以改善卒中后認(rèn)知障礙小鼠腦組織中的Aβ沉積。圖2結(jié)果顯示：模型組小鼠腦組織中Aβ沉積增加，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；電針組小鼠海馬組織中的Aβ沉積減少，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。APP是導(dǎo)致Aβ斑塊形成的前體蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠腦組織中APP表達(dá)增加，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；電針組小鼠海馬組織中的APP表達(dá)減少，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 各組小鼠腦組織Aβ、APP蛋白表達(dá)水平比較Figure 2 Comparison of protein expression levels of Aβ，APP among various groups of mice（±s）

3 討論

3.1 電針百會(huì)、大椎穴能夠有效改善缺血性卒中模型小鼠認(rèn)知障礙

“通督調(diào)神”針刺法是許能貴教授基于《難經(jīng)·二十八難》記載的“督脈者，起于下極之俞，并于脊里，至風(fēng)府，入于腦”?！端貑?wèn)·骨空論》記載督脈的分支“貫脊，屬腎”“如循膂，絡(luò)腎”“上貫心”及心主神明，腦為元神之府的理論構(gòu)架提出的治療缺血性腦病及其并發(fā)癥的針刺方案。該方案主要取穴為百會(huì)、大椎穴，《太平圣惠方》和《針灸資生經(jīng)》把該二穴記載在“中風(fēng)七穴”之中。現(xiàn)代研究結(jié)果顯示，百會(huì)、大椎穴具有提升椎基底動(dòng)脈和大腦中動(dòng)脈腦血流速度[18]和緩解急性、亞急性腦缺血再灌注損傷的作用[19]。本課題組前期臨床試驗(yàn)已證實(shí)，“通督調(diào)神”針刺法可以有效改善血管性癡呆患者日常生活能力水平和神經(jīng)功能缺損[4]。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，考慮MCAO手術(shù)后小鼠肢體功能障礙可能會(huì)對(duì)新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)、水迷宮結(jié)果造成影響，但在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，礦場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：各組小鼠運(yùn)動(dòng)速度、運(yùn)動(dòng)距離、休息時(shí)間等自發(fā)活動(dòng)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，排除了MCAO手術(shù)導(dǎo)致的肢體功能障礙對(duì)認(rèn)知行為學(xué)結(jié)果的影響。在接下來(lái)的新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)、水迷宮試驗(yàn)中MCAO誘導(dǎo)卒中后認(rèn)知障礙模型小鼠顯示出明顯的認(rèn)知障礙。然而，電針可以有效地改善認(rèn)知功能障礙，進(jìn)一步證明電針百會(huì)、大椎穴可以改善卒中后認(rèn)知功能障礙。

3.2 電針百會(huì)、大椎穴能夠保護(hù)受損神經(jīng)元、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)

海馬在記憶的獲取和儲(chǔ)存過(guò)程中發(fā)揮重要作用[20]，海馬神經(jīng)元樹(shù)突密度和學(xué)習(xí)記憶能力相關(guān)，當(dāng)腦組織缺血缺氧造成神經(jīng)元凋亡、樹(shù)突密度降低，學(xué)習(xí)記憶能力將下降[21]。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，MCAO誘導(dǎo)卒中后認(rèn)知障礙模型動(dòng)物樹(shù)突密度降低。本實(shí)驗(yàn)中，卒中后認(rèn)知障礙模型小鼠在高爾基染色實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出同心圓交叉數(shù)量和樹(shù)突分枝數(shù)量減少，再次證實(shí)，卒中后認(rèn)知障礙模型小鼠存在神經(jīng)元受損。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，電針可有效改善神經(jīng)元受損，證明電針百會(huì)、大椎穴能夠保護(hù)受損神經(jīng)元、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

3.3 電針百會(huì)、大椎穴能夠減少模型小鼠腦組織Aβ斑塊沉積

有研究顯示，Aβ沉積在卒中后認(rèn)知障礙發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，大腦中動(dòng)脈閉塞后7 d內(nèi)，梗死周圍區(qū)域的APP出現(xiàn)了上調(diào)，隨著APP分解Aβ肽逐漸增加并轉(zhuǎn)化為致密的斑塊樣沉積[22]。Aβ沉淀聚積具有強(qiáng)神經(jīng)毒性，可導(dǎo)致神經(jīng)元樹(shù)突密度降低和突觸可塑性受損，從而造成認(rèn)知障礙是卒中后認(rèn)知障礙產(chǎn)生的重要機(jī)制[23]。抑制小鼠海馬區(qū)Aβ沉積和APP表達(dá)可減輕海馬神經(jīng)元損害、改善認(rèn)知障礙[24]。因此，本實(shí)驗(yàn)以Aβ和APP為觀察指標(biāo)，研究結(jié)果表明，電針百會(huì)、大椎穴能夠抑制缺血性腦卒中小鼠海馬組織中Aβ過(guò)度沉積和APP異常表達(dá)。

綜上所述，電針百會(huì)、大椎穴可能是通過(guò)抑制卒中后認(rèn)知障礙模型小鼠海馬區(qū)Aβ沉積發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用，從而改善認(rèn)知功能障礙，為臨床運(yùn)用提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。然而，本研究尚存在一定的局限性，比如電針對(duì)Aβ的作用點(diǎn)何在？是直接阻斷其神經(jīng)毒效應(yīng)，還是阻礙其聚集沉積，或加速降解清除？其確切機(jī)制尚有待于進(jìn)一步的研究。