問清江, 慕 娟, 孫曉宇, 鄭巧霞, 丁 浩

(陜西省微生物研究所,陜西 西安 710043)

右旋糖酐40(Dextran 40)是臨床醫(yī)學(xué)最常用的血漿代用品,靜脈注射后可以提高血漿膠體滲透壓,吸收血管外的水分而增加血容量,從而維護(hù)血壓,擴(kuò)充血容量,還可使已經(jīng)聚集的紅細(xì)胞和血小板解聚,降低血液黏滯性,改善人體血液微循環(huán),具有防止彌散性血管內(nèi)凝血的作用,主要用于治療失血性休克[1-11]。細(xì)菌內(nèi)毒素(Endotoxin)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的脂多糖(Lipopolysaccharde,LPS),主要由菌體死亡解體釋放。 內(nèi)毒素是常見的外源性致熱原,屬于強(qiáng)免疫刺激因子,進(jìn)入機(jī)體后能導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),從而引起一系列的病理生理反應(yīng),在極微量的情況下便可引起人體白細(xì)胞減少、微循環(huán)障礙、全身炎癥反應(yīng)、發(fā)熱、低血壓、心動(dòng)過速、多器官功能衰竭甚至死亡等嚴(yán)重不良反應(yīng)。所以,在藥物尤其是注射劑的生產(chǎn)中,細(xì)菌內(nèi)毒素的去除和嚴(yán)格控制非常重要,關(guān)乎人們的生命安全[12-14]。LPS是一個(gè)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子物質(zhì),但是不同種類革蘭陰性菌的LPS均有共同組成部分。LPS分子結(jié)構(gòu)大致分為O-特異性鏈(O-抗原)、核心多糖(核心區(qū))、類脂A 三個(gè)部分(圖1)。類脂A 由氨基葡萄糖、磷酸和脂肪酸組成,是脂多糖不可缺少的組成部分,幾乎參與內(nèi)毒素介導(dǎo)的所有生物活性。核心區(qū)和O-抗原具有親水性,類脂A具有疏水性。在水中分子量約為50～500 kDa。細(xì)菌內(nèi)毒素的計(jì)量單位為活性單位(endotoxin units,EU)[16-17]。 目前,我國右旋糖酐40原料藥的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中還沒有內(nèi)毒素含量指標(biāo),但是美國、英國和歐洲的同類產(chǎn)品中具有內(nèi)毒素指標(biāo)(≤10 EU/g),因此造成我國的右旋糖酐40的產(chǎn)品質(zhì)量與美國、英國和歐洲存在差距,使用藥物安全性存在隱患[18-20]。我們?cè)诟倪M(jìn)右旋糖酐40原料藥生產(chǎn)新工藝研究過程中,將細(xì)菌內(nèi)毒素也作為一個(gè)指標(biāo),對(duì)乙醇分級(jí)沉淀、超濾膜分離[21-28]及其他相關(guān)因素進(jìn)行了研究,初步探索了細(xì)菌內(nèi)毒素的結(jié)構(gòu)、分子大小等與右旋糖酐40制備過程中的相互關(guān)系,最終使得右旋糖酐40原料藥的細(xì)菌內(nèi)毒素含量達(dá)到國際標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 細(xì)菌內(nèi)毒素的典型結(jié)構(gòu)示意[15]Fig.1 Schematic diagram of endotoxin structure[15]a：細(xì)菌內(nèi)毒素結(jié)構(gòu);b：類脂A分子結(jié)構(gòu)a：Endotoxin structure;b：Mdecular structure of lipid A

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 腸膜狀明串珠菌Leuconstocmesenteriodes-1226 (Lm-1226)由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.1.2 主要試劑與儀器設(shè)備 白砂糖(一級(jí),孟連昌裕糖業(yè)有限責(zé)任公司);右旋糖酐酶(Y200301,寧夏夏圣實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司);鱟試劑(湛江博康海洋生物有限公司);細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)用水(湛江博康海洋生物有限公司);其他試劑為市售分析純。生化培養(yǎng)箱(SPX-150BIII,天津泰斯特儀器有限公司);隔水式培養(yǎng)箱(GH-500,北京科偉永興儀器有限公司);實(shí)驗(yàn)?zāi)し蛛x設(shè)備(LABSTAR UF5,北京安石環(huán)境工程有限公司);分光光度計(jì)(722,上海精密科學(xué)儀器有限公司);糖度計(jì)(WYT-J,成都豪創(chuàng)光電儀器有限公司);數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(85-2,杭州儀表電機(jī)有限公司);電熱鼓風(fēng)干燥箱(101,北京科偉永興儀器有限公司);高效液相色譜儀(2010A-HT,蘇州貝銳儀器科技有限公司);內(nèi)毒素凝膠法測(cè)定儀 (ET-96,天津市天大天發(fā)科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 右旋糖酐的酶解 將腸膜狀明串珠菌Lm-1226的斜面種子接入種子培養(yǎng)基,25 ℃培養(yǎng)36 h,種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)28 h;發(fā)酵結(jié)束后直接加入右旋糖酐酶進(jìn)行酶解(酶濃度0.19 IU/mL,溫度50 ℃,時(shí)間3.5 h);加入1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的活性碳繼續(xù)攪拌保溫40 min過濾,收集濾液為酶解待分離液。

1.2.2 乙醇沉淀分離純化右旋糖酐40的制備 取一定量的1.2.1中的酶解待分離液,按照42%～46%(體積分?jǐn)?shù))加入乙醇,攪拌均勻,40 ℃放置12 h,傾出大部分上清液,剩余部分離心分離,沉淀部分為大分子等雜質(zhì),收集上清液進(jìn)一步乙醇沉淀分離純化;按照50%～60%加入乙醇,攪拌均勻,室溫放置24 h,傾出上清液,收集沉淀,用75%乙醇洗滌沉淀3次,60 ℃烘干,粉碎為右旋糖酐40成品備用。

1.2.3 右旋糖酐發(fā)酵液的預(yù)處理及酸水解 將稀釋后的右旋糖酐發(fā)酵液經(jīng)板框過濾、陶瓷膜濾過及5 kDa 超濾截流濃縮為右旋糖酐發(fā)酵液處理液;然后在0.08%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽酸,95～100 ℃條件下水解3.0 h;加入1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 的活性碳繼續(xù)攪拌保溫40 min過濾,收集濾液為待分離液。

1.2.4 超濾分離純化右旋糖酐40的制備 將1.2.3中的待分離液進(jìn)行超濾分離純化。①100 kDa+5 kDa、100 kDa+10 kDa和100 kDa+20 kDa二膜組合超濾,首先經(jīng)100 kDa膜超濾得截留液并制備成干品,濾過液繼續(xù)經(jīng)5 kDa(或10、20 kDa)膜超濾,截留液制備成干品;②100 kDa+20 kDa+50 kDa三膜組合超濾,首先經(jīng)過100 kDa膜超濾,截留液制備成干品,濾過液繼續(xù)經(jīng)20 kDa膜超濾,截留液再經(jīng)50 kDa膜超濾,截留液和濾過液均制備成干品。截留液用 60%乙醇沉淀、干燥、粉碎備用;濾過液通過減壓濃縮,用50%～60%乙醇沉淀,干燥,粉碎備用。

1.2.5 細(xì)菌內(nèi)毒素的測(cè)定[18,29-30]根據(jù)公式 MVD=(c·L)/λ(MVD代表溶液最大稀釋倍數(shù),c代表溶液濃度,L代表內(nèi)毒素限值,λ代表鱟試劑靈敏度)計(jì)算出相應(yīng)稀釋倍數(shù),用內(nèi)毒素檢查用水依次梯度進(jìn)行稀釋,并及時(shí)用封口膜封住試管口。準(zhǔn)確稱取適量待測(cè)右旋糖酐40固體樣品,加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水進(jìn)行超聲溶解,得右旋糖酐40樣品原液,將其適當(dāng)稀釋后檢測(cè),按照濃度計(jì)算限值(右旋糖酐固體樣品假設(shè)MVD=1)。

1.2.6 分子量與分子量分布[18]取右旋糖酐40樣品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 mL約含10 mg的溶液，振搖，室溫放置過夜作為供試品溶液。另取 4～5 個(gè)已知分子量的右旋糖酐對(duì)照品，依法檢查(2020 版《藥典》四部通則0514)，樣品 10%大分子部分重均分子量不得大于120 000，10%小分子部分重均分子量不得小于5 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇沉淀分離純化右旋糖酐40

2.1.1 不同濃度乙醇沉淀分離純化右旋糖酐40對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素含量的影響 右旋糖酐發(fā)酵液在右旋糖酐酶作用下,降解為一定分子量分布的酶解液,經(jīng)活性炭吸附除雜并收集濾液,將濾液進(jìn)行乙醇分級(jí)沉淀分離純化成右旋糖酐40,并對(duì)分離純化的樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè),同一待分離右旋糖酐溶液選擇不同濃度乙醇沉淀分離右旋糖酐40,乙醇濃度對(duì)右旋糖酐40細(xì)菌內(nèi)毒素含量的影響見表1;乙醇分級(jí)沉淀分離純化右旋糖酐40采取一次沉淀除雜,二次沉淀右旋糖酐40的方法,由于出發(fā)右旋糖酐溶液不同導(dǎo)致相同乙醇濃度沉淀產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素含量不同(表2)。結(jié)果表明,同一待分離液選取不同濃度的乙醇進(jìn)行分離純化,隨著乙醇濃度的增加,相應(yīng)沉淀產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素含量逐漸降低;在乙醇分步沉淀中,隨著乙醇濃度逐級(jí)提高,分離產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素含量隨之降低。細(xì)菌內(nèi)毒素是一種脂多糖,其由O-特異性鏈(O-抗原)、核心多糖(核心區(qū))、類脂A 三個(gè)部分構(gòu)成(圖1),核心區(qū)和O-抗原為親水性,類脂A為疏水性,在水溶液中呈聚集狀態(tài)。乙醇濃度的高低決定了細(xì)菌內(nèi)毒素在溶液中的溶解性,乙醇濃度越高,溶液中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量越高,沉淀中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量越低。右旋糖酐是醇不溶性物質(zhì),隨著乙醇濃度的提高,溶解性降低;而且分子量越大,沉淀乙醇濃度越低,因此可以通過不同乙醇濃度逐級(jí)分離純化不同分子量的右旋糖酐。在保證右旋糖酐40重均分子量和分子量分布的前提下,可以通過乙醇再沉淀分離去除細(xì)菌內(nèi)毒素,提高產(chǎn)品品質(zhì)。

表1 乙醇濃度對(duì)右旋糖酐40細(xì)菌內(nèi)毒素含量的影響

表2 乙醇分步沉淀對(duì)右旋糖酐40細(xì)菌內(nèi)毒素含量的影響Table 2 Effect of ethanol step precipitation on endotoxin content of dextran 40

2.1.2 右旋糖酐40分離純化用水等對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素含量的影響 將右旋糖酐40粗品加水溶解為10%溶液,按照乙醇濃度45%～50%一次沉淀除雜,再按照51%～59%二次沉淀制備右旋糖酐40。在分離純化過程中分離純化產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素沒有降低,反而出現(xiàn)雜亂升高的異常情況(表3)。分析這一現(xiàn)象首先從環(huán)境因素著手,如稱量樣品、溶解、乙醇沉淀、干燥等操作過程暴露于開放環(huán)境中的,空氣中的細(xì)菌落入試液和成品可能引入細(xì)菌內(nèi)毒素;使用非潔凈的試驗(yàn)器具,因器具污染也會(huì)引入細(xì)菌內(nèi)毒素。因此,在非無菌環(huán)境中盡可能減少空氣中的暴露及污染等有可能造成細(xì)菌內(nèi)毒素引入的發(fā)生,分離過程中盡可能避免環(huán)境影響(表3),以改善細(xì)菌內(nèi)毒素含量雜亂的現(xiàn)象,明確了環(huán)境因素是引起分離純化細(xì)菌內(nèi)毒素異常的原因之一;但是終產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素仍然高于出發(fā)品,分析分離純化用水可能存在問題,于是對(duì)實(shí)驗(yàn)室去離子水進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測(cè)(表4),去離子水細(xì)菌內(nèi)毒素含量最高<56.25 EU/mL(存放時(shí)間30 d),最低<3.125 EU/mL,按照后者計(jì)算,每1 g右旋糖酐粗品分離純化時(shí)因水引入細(xì)菌內(nèi)毒素31.25 EU,純化用水會(huì)影響到右旋糖酐40分離純化中細(xì)菌內(nèi)毒素的指標(biāo)。因此右旋糖酐40分離純化時(shí)不僅要考慮環(huán)境因素,而且需要選擇細(xì)菌內(nèi)毒素含量達(dá)標(biāo)的純化用水。

表4 水中細(xì)菌內(nèi)毒素含量

2.1.3 右旋糖酐40的分離純化 用細(xì)菌內(nèi)毒素含量<0.125 EU/mL的娃哈哈純凈水替代實(shí)驗(yàn)室去離子水進(jìn)行右旋糖酐40的分離純化(表5),結(jié)果大大改善了細(xì)菌內(nèi)毒素的去除效果,所有終產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素含量均<6.00 EU/g,最低含量<3.00 EU/g,優(yōu)于國際標(biāo)準(zhǔn)(≤10 EU/g);分離純化的右旋糖酐40的重均分子量和分子量均符合《中國藥典》(2020版二部)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(重均Mr 32 000～42 000,10%大分子Mr≤120 000,10%大分子Mr≥5 000)。

表5 乙醇沉淀分離純化右旋糖酐40結(jié)果

2.2 超濾分離純化右旋糖酐40對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素含量的影響

將右旋糖酐發(fā)酵液經(jīng)過板框過濾、陶瓷膜微濾及超濾預(yù)處理,鹽酸水解和活性炭吸附除雜為待分離溶液。通過100 kDa+5 kDa、100 kDa+10 kDa和100 kDa+20 kDa二膜組合和100 kDa+20 kDa+50 kDa三膜組合超濾分離純化右旋糖酐40,對(duì)其相應(yīng)成品進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)分析(表6、7)。100 kDa超濾膜與5 kDa、10 kDa和20 kDa分別組合成二次超濾,隨著第二次超濾膜截留分子量的增大,去除細(xì)菌內(nèi)毒素的效果增強(qiáng),分離純化的終產(chǎn)品中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量降低,100 kDa+20 kDa超濾分離純化的右旋糖酐40的細(xì)菌內(nèi)毒素含量有望達(dá)到10 EU/g以下;100 kDa+20 kDa+50 kDa三膜組合超濾分離純化右旋糖酐40的細(xì)菌內(nèi)毒素含量達(dá)到3 EU/g以下,重均分子量及分子量分布達(dá)到《中國藥典》(2020版二部)標(biāo)準(zhǔn)。超濾分離純化右旋糖酐40及細(xì)菌內(nèi)毒素的去除與其分子量大小不同有關(guān),右旋糖酐40的重均分子量為32 000～42 000,細(xì)菌內(nèi)毒素的分子量為50～500 kDa,二者之間存在差異,通過對(duì)超濾膜進(jìn)行組合,最終達(dá)到分離純化右旋糖酐40的目標(biāo),在重均分子量和分子量分布保證的前提下,細(xì)菌內(nèi)毒素含量?jī)?yōu)于國際標(biāo)準(zhǔn)(≤10 EU/g)。右旋糖酐水解處理液經(jīng)過100 kDa+20 kDa+50 kDa三膜組合超濾分離純化(首先經(jīng)過100 kDa膜超濾,濾過液繼續(xù)經(jīng)20 kDa膜超濾,截留液再經(jīng)50 kDa膜超濾),其濾過液濃縮、乙醇沉淀制備成右旋糖酐40,細(xì)菌內(nèi)毒素含量和分子量分布雙達(dá)標(biāo)。

表6 二膜組合超濾分離純化對(duì)右旋糖酐40細(xì)菌內(nèi)毒素含量的影響

表7 三膜組合超濾分離純化對(duì)右旋糖酐40細(xì)菌內(nèi)毒素含量的影響

3 討 論

目前,我國右旋糖酐40分離純化主要采用乙醇分級(jí)沉淀法,為了與國際接軌,將細(xì)菌內(nèi)毒素引入右旋糖酐40原料藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。首先需要對(duì)乙醇分離純化過程中對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素含量的影響因素進(jìn)行探究。通過乙醇濃度對(duì)右旋糖酐40細(xì)菌內(nèi)毒素含量的影響及乙醇分步沉淀對(duì)右旋糖酐40細(xì)菌內(nèi)毒素含量的影響研究發(fā)現(xiàn),細(xì)菌內(nèi)毒素分子結(jié)構(gòu)中疏水性類脂A決定了其水溶液中的聚集狀態(tài)及乙醇溶液中的溶解性,乙醇濃度越高,溶液中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量越高,沉淀中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量越低,可以通過不同乙醇濃度逐級(jí)分離純化不同分子量的右旋糖酐40而達(dá)到分離純化的目的,同時(shí)去除細(xì)菌內(nèi)毒素,提高產(chǎn)品品質(zhì)。針對(duì)分離純化過程中出現(xiàn)的細(xì)菌內(nèi)毒素異常情況,通過進(jìn)行環(huán)境因素和純化水對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的影響研究發(fā)現(xiàn),二者均會(huì)影響細(xì)菌內(nèi)毒素的去除,因此控制好這兩個(gè)方面從而保證右旋糖酐40的分離純化,使產(chǎn)品的分子量分布和細(xì)菌內(nèi)毒素含量雙達(dá)標(biāo)。選用細(xì)菌內(nèi)毒素含量達(dá)標(biāo)的純凈水進(jìn)行右旋糖酐40的分離純化,產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素含量均<6.00 EU/g,最低含量<3.00 EU/g,優(yōu)于國際標(biāo)準(zhǔn)(≤10 EU/g),重均分子量和分子量均符合《中國藥典》(2020版二部)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。超濾也用于右旋糖酐40的分離純化,根據(jù)分子量大小的不同,通過不同截留分子量的膜將右旋糖酐分離為不同分子量的產(chǎn)品,細(xì)菌內(nèi)毒素是大分子的脂多糖(LPS)物質(zhì),其水中分子量約為50～500 kDa。首先通過100 kDa+5 kDa、100 kDa+10 kDa和100 kDa+20 kDa二膜組合超濾,產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素含量隨著二次超濾膜截留分子量的增大而減小,100 kDa+20 kDa超濾分離純化的右旋糖酐40的細(xì)菌內(nèi)毒素含量有望達(dá)到10 EU/g以下。經(jīng)過100 kDa+20 kDa+50 kDa三膜組合超濾分離純化,右旋糖酐40的細(xì)菌內(nèi)毒素含量達(dá)到3 EU/g以下,重均分子量及分子量分布達(dá)到《中國藥典》(2020版二部)標(biāo)準(zhǔn)?？傊?在現(xiàn)有的右旋糖酐40生產(chǎn)工藝路線基礎(chǔ)上,進(jìn)行一些工藝條件的改善和控制,細(xì)菌內(nèi)毒素含量可以作為右旋糖酐40原料藥質(zhì)量指標(biāo),而且可以達(dá)到和超過國際最高標(biāo)準(zhǔn),為右旋糖酐40大輸液制劑等的生產(chǎn)減少安全負(fù)荷,提高產(chǎn)品品質(zhì),降低藥物不良反應(yīng)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。