姜南 石楊 趙志慧 李斌 趙熠輝 楊俊彪 閆家銘 靳雨璠 陳稷 黃進(jìn)

（1.成都理工大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，成都 610059；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130）

鎘（cadmium，Cd）具有高毒性且不可被生物通過代謝途徑降解［1］，過度積累會(huì)抑制水稻光合作用及呼吸作用等生理過程，導(dǎo)致水稻（Oryza sativa）的株高、根長(zhǎng)、生物量及產(chǎn)量等明顯降低［2-3］。同時(shí)，Cd 具有高遷移性，不僅易被水稻吸收，還會(huì)通過食物鏈富集于人體，對(duì)人的健康造成損害［4-5］。培育低Cd 積累的水稻品種，減少大米中Cd 的含量，已成為當(dāng)前應(yīng)對(duì)Cd 污染危害主流的研究趨勢(shì)之一［6-8］。研究水稻Cd 吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因及功能為水稻應(yīng)對(duì)Cd 脅迫的機(jī)制及培育低積累Cd 的水稻品種具有重要的借鑒意義［9］。

研究表明，植物可通過相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將重金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外或隔離在液泡及質(zhì)外體中，以降低重金屬對(duì)植物的毒害［10-14］。在這一過程中，部分依賴于H+偶聯(lián)的陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，陽離子/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CAX（cation/H+exchanger）可依賴跨膜H+質(zhì)子梯度，將Mn2+、Cd2+等游離金屬離子逆濃度梯度地轉(zhuǎn)運(yùn)并隔離在液泡中［15］；而Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NHX1（Na+/H+antiporter）則可通過介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)膜上H+濃度，將Cd 轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外［16］，這兩種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均可藉此增強(qiáng)植物對(duì)Cd 脅迫的耐受性。OsPT1 蛋白（phosphate transporter 1）作為水稻H2PO4-/H+共運(yùn)體Pht1 蛋白家族中的一員，是一種定位于細(xì)胞質(zhì)膜上的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它們通過調(diào)控細(xì)胞質(zhì)膜上H+濃度梯度參與水稻對(duì)外界磷酸鹽和重金屬砷（As）的吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)［17］。研究發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，過表達(dá)OsPT1水稻在根和葉片中積累了更多的磷酸鹽和As，當(dāng)OsPT1突變后，水稻地上部分As 的積累量顯著降低，表明OsPT1不但參與水稻對(duì)外源磷酸鹽吸收積累，還可能在水稻應(yīng)對(duì)As 脅迫的過程中發(fā)揮作用［18-20］。而水稻Pht1 家族其他成員（如OsPT3、OsPT4、OsPT5、OsPT7、OsPT8 等）也參與水稻對(duì)磷酸鹽吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過程，其中，OsPT4 和OsPT8 還參與對(duì)As 的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)［21-24］。在對(duì)馬鈴薯StPT7的研究過程中發(fā)現(xiàn)，其野生型、過表達(dá)和突變體植株對(duì)干旱脅迫的耐受性依次降低，表明Pht1 蛋白還影響植物的干旱脅迫耐受性［25］。亞麻薺Pht1 家族成員響應(yīng)多種逆境脅迫，其中就包括Cd［26］。

OsPT1 可能通過調(diào)控細(xì)胞質(zhì)膜上H+濃度介導(dǎo)水稻Cd 轉(zhuǎn)運(yùn)，但當(dāng)前研究對(duì)OsPT1 是否在重金屬Cd轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮作用尚未闡明。前期利用生物信息學(xué)篩選到多個(gè)水稻Cd 響應(yīng)基因，其中包括OsPT1。

本研究以水稻、酵母為材料，克隆OsPT1并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化酵母，驗(yàn)證OsPT1在Cd 脅迫下的功能。利用RT-qPCR 檢測(cè)OsPT1在Cd 脅迫下的表達(dá)情況，為OsPT1的Cd 響應(yīng)功能研究及低積累Cd 的水稻品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻種子消毒后，置于37℃150 r/min 催芽2 d。隨后種植于1/2 MS 植物培養(yǎng)基（pH=5.8），30℃光照培養(yǎng)5 d。選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好且株高相近的幼苗，分別種植于含0（對(duì)照）和100 μmol/L CdCl2的1/2 MS 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。分別在1、6 和12 h 時(shí)取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取8 株幼苗，對(duì)地上部分和根部分別取樣，立即置于液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 水稻總RNA 提取及cDNA 反轉(zhuǎn)錄 將水稻組織樣品研磨成粉末，利用植物RNA 快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取總RNA，并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（默飛世爾科技公司）反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2 水稻OsPT1的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)OsPT1登錄號(hào)（Locus ID：LOC_Os03g05620），從Rice Genome Annotation Project（http://rice.plantbiology.msu.edu/）網(wǎng)站下載CDS 序列。設(shè)計(jì)OsPT1引物（上游引物OsPT1-F：5'-ATGGCGGGAGGGCAGCTCAACG-3'；下游引物OsPT1-R：5'-TTACTTCGGGTAGGCCGCCTCC-3'）。PCR 反應(yīng)體系為引物各1 μL、模板1 μL、金牌Mix 酶44.5 μL、DMSO 2.5 μL，補(bǔ)至50 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?8℃ 2 min；98℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物回收純化后，與pGADT7表達(dá)載體連接，并轉(zhuǎn)化DH5α 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確后送樣測(cè)序。

1.2.3OsPT1表達(dá)分析 cDNA 稀釋10 倍后作為模板，通過RT-qPCR 檢測(cè)OsPT1的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)體系為cDNA 3 μL、上下游引物（表1）各1 μL、2×ChamQ Universal SYBR 5 μL。RT-qPCR 反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 2 min；95℃ 15 s，55℃ 20 s，72℃ 15 s，40 個(gè)循環(huán)。以u(píng)biquitin為內(nèi)參基因，每個(gè)處理3 次重復(fù)，采用2-ΔΔCt相對(duì)定量法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Quantitative real-time PCR primer sequence

1.2.4OsPT1在酵母中的功能分析 使用聚乙二醇（PEG）-乙酸鋰轉(zhuǎn)化法［27］將pGADT7-OsPT1表達(dá)載體與pGADT7空載體（作為陰性對(duì)照）轉(zhuǎn)化到Cd敏感型酵母菌株Δycf BY4741（Mata his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 YDR135c::kanMX4）中。在亮氨酸缺陷型（SD-Leu）酵母固體培養(yǎng)基上選擇酵母單克隆，接種于SD-Leu 液體培養(yǎng)基中，30℃ 200 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜。之后用新鮮的SD-Leu 液體培養(yǎng)基稀釋10 倍后再活化培養(yǎng)2 h，將菌液培養(yǎng)至OD600=0.4-0.8，離心收集細(xì)胞，用無菌水調(diào)OD600=1。隨后，將5 μL 經(jīng)梯度稀釋的酵母細(xì)胞液（OD600為1.0、0.1、0.01和0.001）點(diǎn)樣到含有2%葡萄糖和25 μmol/L CdCl2的SD-Leu 固體培養(yǎng)基表面，30℃培養(yǎng)3 d，拍照采集數(shù)據(jù)。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 利用在線網(wǎng)站ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)分析OsPT1的理化性質(zhì)。使用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html） 分析OsPT1 的二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用PHYRE2 Protein Fold Recognition Server（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index，對(duì)OsPT1 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過NetPhos v3.1（http://www.cbs.dtu.dk/se rvices/NetPhos/）預(yù)測(cè)OsPT1 蛋白可能的磷酸化位點(diǎn)。通過ProtComp（http://linux1.softberry.com/berry.phtm l?topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc）網(wǎng)站預(yù)測(cè)OsPT1 蛋白的亞細(xì)胞定位。使用NCBI 中的BLAST 功能，找到不同物種中OsPT1 蛋白的同源序列，并通過軟件MEGA7.0 使用NJ 法構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 OsPT1的克隆

以水稻cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得一條約1 600 bp 條帶（圖1-A），與重組載體酶切后的產(chǎn)物大小相近（圖1-B）。經(jīng)測(cè)序，獲得的序列與通過Rice Genome Annotation Project 網(wǎng)站查詢得到的OsPT1（LOC_Os03g05620）CDS 序列比對(duì)一致，表明成功克隆目的基因。

圖1 OsPT1 的PCR 擴(kuò)增及pGADT7-OsPT1 重組載體的酶切驗(yàn)證Fig.1 PCR amplification of OsPT1 gene and endonuclease digestion of the recombinant vector pGADT7-OsPT1

2.2 OsPT1的生物信息學(xué)分析

2.2.1 OsPT1 的理化性質(zhì)預(yù)測(cè) 利用ExPASy 網(wǎng)站分析OsPT1 的理化性質(zhì)（表2），OsPT1 蛋白分子質(zhì)量為57.46 kD，蛋白分子式為C2656H4021N667O710S25。其編碼氨基酸組成（表3）如下，Ala（A）有67 個(gè)，所占比例最高，為12.7%，Cys（C）有6 個(gè)，所占比例最低，為1.1%。OsPT1帶負(fù)電殘基總數(shù)（Asp+Glu）34 個(gè)，帶正電殘基總數(shù)（Arg+Lys）38 個(gè)，理論等電點(diǎn)為8.57，不穩(wěn)定指數(shù)為31.09，說明該蛋白為穩(wěn)定的弱堿性蛋白。由于此蛋白親和性（GRAVY）平均水平為0.361，而從蛋白的親和性分析（圖2）可以看出，處于正值的蛋白比例明顯大于負(fù)值部分，說明此蛋白為疏水性蛋白。

圖2 OsPT1 蛋白親疏水性分析Fig.2 Hydrophobicity analysis of OsPT1 protein

表2 OsPT1 蛋白的理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of OsPT1 protein

表3 OsPT1 蛋白的氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of OsPT1 protein

2.2.2 OsPT1 的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 運(yùn)用SOPMA網(wǎng)站預(yù)測(cè)OsPT1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3-A），發(fā)現(xiàn)α-螺旋有260 個(gè)氨基酸，占49.34%；延伸鏈有71個(gè)氨基酸，占13.47%；β-轉(zhuǎn)角有24 個(gè)氨基酸，占4.55%；無規(guī)則卷曲有172 個(gè)氨基酸，占32.64%。使用PHYRE2 網(wǎng)站預(yù)測(cè)OsPT1 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3-B），蛋白質(zhì)中含有大量丙氨酸（Ala），而α-螺旋和無規(guī)則卷曲是蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本吻合。

圖3 OsPT1 蛋白質(zhì)的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Secondary and tertiary structure prediction of OsPT1 protein

2.2.3 OsPT1 蛋白的亞細(xì)胞定位及磷酸化位點(diǎn)分析 使用在線工具ProtComp 分析OsPT1 蛋白的亞細(xì)胞定位，OsPT1 蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)膜上。蛋白質(zhì)的磷酸化可介導(dǎo)蛋白活性，對(duì)生物體內(nèi)很多生理過程都具有重要的調(diào)控作用。利用在線軟件Net Phos 3.1 分析OsPT1 潛在的磷酸化位點(diǎn)（圖4）發(fā)現(xiàn)，OsPT1 存在34 處潛在的磷酸化位點(diǎn)，包括14 處潛在的絲氨酸（S）磷酸化位點(diǎn)，14 處潛在的蘇氨酸（T）磷酸化位點(diǎn)，6 處潛在的酪氨酸（Y）磷酸化位點(diǎn)，這些磷酸化位點(diǎn)對(duì)OsPT1 蛋白行使功能有著重要意義。

圖4 OsPT1 蛋白潛在的磷酸化位點(diǎn)分析Fig.4 potential phosphorylation sites analysis of OsPT1 protein

2.2.4 OsPT1 的系統(tǒng)進(jìn)化分析 為了研究OsPT1 蛋白在不同物種的進(jìn)化關(guān)系，運(yùn)用NCBI Blast 查詢與OsPT1 蛋白同源性最高的其他物種的蛋白序列，利用MEGA7.0 軟件鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹（圖5）。目的基因編碼的蛋白在雙子葉植物和單子葉植物間分為2 支，與高粱（Sorghum bicolor）的親緣關(guān)系最近。

圖5 PT1 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of PT1 proteins

2.2.5OsPT1順式作用元件分析 運(yùn)用PlantCARE網(wǎng)站分析OsPT1上游2 000 bp 啟動(dòng)子區(qū)序列，通過TBtools 對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理。結(jié)果（圖6）顯示，OsPT1上游2 000 bp 啟動(dòng)子區(qū)含有對(duì)光響應(yīng)作用元件CAG-motif、G-Box、AE-box、ACE、GT1-motif、TCT-motif，對(duì)茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA-motif、TGACG-motif，厭氧環(huán)境響應(yīng)元件ARE，對(duì)水楊酸響應(yīng)的元件TCA-element，對(duì)逆境響應(yīng)的元件TC-rich repeats。

圖6 OsPT1 的順式作用元件分析Fig.6 Cis-acting elements analysis of OsPT1 gene

2.3 OsPT1響應(yīng)Cd脅迫的表達(dá)模式

在不同時(shí)間Cd 脅迫下，運(yùn)用RT-qPCR 分析OsPT1水稻幼苗不同組織中的表達(dá)情況，并使用GraphPad Prism 9 軟件分析數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，在Cd處理濃度100 μmol/L 時(shí)，OsPT1在水稻地上部分的相對(duì)表達(dá)量整體呈上升趨勢(shì)。在處理1、6 和12 h 后，OsPT1在植物地上部分的轉(zhuǎn)錄水平分別上調(diào)至處理前的1.31、1.34 和2.46 倍（圖7-A）。而在根中，處理時(shí)間為1 和6 h 時(shí)，OsPT1的相對(duì)表達(dá)量上調(diào)了1.28和1.14 倍；當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到12 h 時(shí)，OsPT1的相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)，約為0.62 倍（圖7-B）。OsPT1相對(duì)表達(dá)量的變化表明其能夠響應(yīng)Cd 脅迫。

圖7 OsPT1 響應(yīng)Cd 脅迫表達(dá)分析Fig.7 Expression analysis of OsPT1 under Cd stress treatment

2.4 轉(zhuǎn)基因酵母的Cd耐受性分析

將轉(zhuǎn)基因酵母與空載體酵母經(jīng)25 μmol/L Cd 處理3 d 后，與對(duì)照組（0 μmol/L Cd）相比，轉(zhuǎn)入目的基因的酵母在含25 μmol/L Cd 的SD-Leu 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)活性較空載體酵母弱（圖8），表明OsPT1在一定程度上降低了酵母細(xì)胞對(duì)Cd 的耐受性。

圖8 OsPT1 對(duì)酵母Cd 敏感性的影響Fig.8 Effects of OsPT1 on the sensibility of Cd in yeast

3 討論

水稻在進(jìn)化和發(fā)育過程中，形成了一套應(yīng)對(duì)Cd脅迫的調(diào)控機(jī)制，這些調(diào)控機(jī)制的發(fā)揮依賴各種已知和未知的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子［28-29］。OsPT1 作為一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)磷酸鹽及重金屬As 方面具有重要作用。除此之外，OsPT1 對(duì)水稻莖和根毛的伸長(zhǎng)及分蘗等生長(zhǎng)發(fā)育也具有調(diào)控作用［18］。但對(duì)于其在重金屬Cd 脅迫下的功能未知。

本研究通過對(duì)OsPT1的順式作用元件進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該基因上游啟動(dòng)子區(qū)含有與光、厭氧、茉莉酸甲酯等環(huán)境和激素相關(guān)的元件，同時(shí)還含有防御與應(yīng)激反應(yīng)的相關(guān)元件，推測(cè)其可能參與多種非生物脅迫［30］，并受到激素的調(diào)節(jié)作用。有研究表明，蘋果酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MdALMT14 具有絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，可被磷酸化修飾以減少蘋果對(duì)Cd 的吸收［31］。本研究對(duì)OsPT1 磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，其含有14 個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，推測(cè)OsPT1 依賴這些位點(diǎn)的磷酸化修飾來調(diào)控蛋白質(zhì)活性，發(fā)揮生物學(xué)功能，介導(dǎo)對(duì)Cd 的吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)，但尚未有相關(guān)研究進(jìn)行報(bào)道。此外，系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示OsPT1 與禾本科植物高粱SbPT1、玉米（Zea mays）ZmPT1、大麥（Hordeum vulgare）HvPT1 及小麥（Triticum aestivum）TaPT1親緣關(guān)系較近，表明同一科物種的PT1 蛋白同源性更高。雖無這些蛋白在響應(yīng)重金屬脅迫過程中功能的相關(guān)報(bào)道，但對(duì)與OsPT1 親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的擬南芥（Arabidopsis thaliana）AtPT1 研究發(fā)現(xiàn)，AtPT1 也參與對(duì)As 的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)［32］，表明在植物中PT1 功能較為保守。

為進(jìn)一步探究OsPT1響應(yīng)Cd 脅迫的表達(dá)特性及功能，本研究通過RT-qPCR 分析了在100 μmol/L濃度Cd 處理下OsPT1的相對(duì)表達(dá)量，并構(gòu)建轉(zhuǎn)基因酵母研究OsPT1對(duì)酵母Cd 敏感性的影響。RTqPCR 分析發(fā)現(xiàn)，在Cd 處理1 h 和6 h 后，OsPT1在水稻所有組織中的表達(dá)量均上調(diào)，推測(cè)該基因可能參與水稻應(yīng)對(duì)Cd 脅迫的調(diào)控機(jī)制。前人研究發(fā)現(xiàn)，OsPT1的表達(dá)與其功能相適應(yīng)［33］，在添加As 后能顯著誘導(dǎo)OsPT1在根中的表達(dá)、降低在地上部分的表達(dá)，同時(shí)根中As 積累量顯著高于地上部分［19,21］。本研究發(fā)現(xiàn)，在Cd 處理后12 h，OsPT1在根中表達(dá)上調(diào)、在地上部分表達(dá)下調(diào)，與As 處理不同的表達(dá)模式也暗示OsPT1在水稻應(yīng)對(duì)Cd 脅迫中所發(fā)揮的調(diào)控機(jī)制與As 不同，進(jìn)一步推測(cè)OsPT1在水稻早期參與地上部分對(duì)Cd 的再分配，而在根部參與減少水稻對(duì)Cd 的吸收。此外，有研究表明，磷在植物中可通過提高Cd 脅迫下抗氧化酶的活性以增強(qiáng)植株對(duì)Cd 的耐受性［34］，OsPT1的表達(dá)在地上部上升，預(yù)示著在Cd 處理下水稻在地上部分積累了更多的磷，可能據(jù)此緩解Cd 的毒性；在Cd 處理后1 h 和6 h根中OsPT1的表達(dá)量無顯著變化，但在處理后12 h表達(dá)量卻下調(diào)，預(yù)示著水稻對(duì)磷酸鹽的吸收減少，這可能是Cd 導(dǎo)致植株生長(zhǎng)緩慢的原因之一。前人研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)OsPT1基因的磷吸收缺陷型酵母能夠恢復(fù)其生長(zhǎng)活性，表明OsPT1 在酵母中也發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)磷的功能［18］。而在本研究中，表達(dá)OsPT1的酵母對(duì)Cd 的耐受性有所減弱，可能預(yù)示著OsPT1 也具有轉(zhuǎn)運(yùn)Cd 的功能，通過將Cd 轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，降低了酵母菌株的生長(zhǎng)活性。此外，最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在對(duì)酵母補(bǔ)充磷酸鹽的過程中，Cd 對(duì)酵母的毒性顯著增強(qiáng)，且該研究認(rèn)為這一結(jié)果可能由于產(chǎn)生了更多的活性氧造成的［35］。而本研究中轉(zhuǎn)OsPT1的酵母顯示出對(duì)Cd 的耐受性減弱，也可能由于OsPT1 轉(zhuǎn)運(yùn)了更多的磷酸鹽至酵母細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致活性氧含量上升從而降低了酵母對(duì)Cd 的耐受性。目前已有多項(xiàng)研究表明，在施加外源磷的條件下，水稻植株積累了更多的Cd［36-38］，預(yù)示著水稻對(duì)Cd 與磷的轉(zhuǎn)運(yùn)存在著協(xié)同作用，然而造成該現(xiàn)象的具體作用機(jī)制尚不明確。本研究結(jié)果表明，OsPT1可能參與水稻對(duì)Cd脅迫的響應(yīng)機(jī)制，結(jié)合前人研究推測(cè)OsPT1 不僅參與對(duì)外源磷的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)也在水稻吸收Cd 的過程中發(fā)揮重要的功能。然而，這些機(jī)制均有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

本研究對(duì)OsPT1響應(yīng)重金屬Cd 脅迫的功能進(jìn)行了生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，并分析了Cd 脅迫下該基因的表達(dá)模式和功能，初步推測(cè)該基因可能在水稻抵御重金屬脅迫過程中發(fā)揮某種調(diào)控作用，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能提供參考，同時(shí)本研究也提出有關(guān)磷、Cd 共存時(shí)對(duì)水稻生長(zhǎng)影響的新見解。但對(duì)于OsPT1在這些過程中具體的調(diào)控作用尚不明確，因此后續(xù)可通過構(gòu)建水稻OsPT1的突變體植株和過表達(dá)植株，在Cd 脅迫處理下對(duì)水稻的表型特征及重金屬抵御相關(guān)的生物學(xué)功能進(jìn)行分析，以進(jìn)一步明確OsPT1在應(yīng)對(duì)重金屬過程中的功能機(jī)制。

4 結(jié)論

克隆獲得OsPT1，其CDS 序列全長(zhǎng)為1 584 bp，共編碼527 個(gè)氨基酸。OsPT1 蛋白質(zhì)定位在細(xì)胞質(zhì)膜上，與高粱SbPT1 親緣關(guān)系最近，分子量為57.46 kD，等電點(diǎn)為8.57，是一個(gè)穩(wěn)定的疏水性蛋白質(zhì)，含有許多與光、厭氧、茉莉酸甲酯等環(huán)境和激素響應(yīng)相關(guān)的調(diào)控元件；含有34 處潛在的磷酸化位點(diǎn)；OsPT1可一定程度降低酵母細(xì)胞對(duì)Cd 的耐受性。