孫博，馬思彤，宋佳，王暉，苗海江，楊兆勇，趙晨*

1(國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院，北京，100037)2(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春，130118) 3(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015)4(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京，100050)

全球范圍內(nèi)，植物病害直接或間接造成的經(jīng)濟(jì)損失約400億美元/年，嚴(yán)重影響全球作物、水果的生產(chǎn)及糧食安全[1]，植物病害中最常見的類型是真菌病害(約占70%～80%)[2]?；瘜W(xué)防霉劑是當(dāng)前防治植物真菌病害的主要手段，但由于化學(xué)農(nóng)藥在減輕植物病害的同時(shí)會(huì)對(duì)人類健康、環(huán)境和生物多樣性產(chǎn)生不利影響，因此，越來越多的研究表明，生物源防霉劑是極具潛力的選擇之一[3]。

波拉霉素(polaramycin)是由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所和中國(guó)農(nóng)科院生物防治研究所首次發(fā)現(xiàn)的一種新型農(nóng)用天然抗菌化合物[4]，由波拉霉素A和B 2個(gè)組分組成，是從吸水鏈霉菌LP-93(StreptomyceshygroscopicusLP-93)發(fā)酵培養(yǎng)物中分離得到的具有很強(qiáng)抗真菌活性的多羥基大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[5]，其中波拉霉素A占比超過90%[6]。波拉霉素除對(duì)酵母菌、絲狀真菌和革蘭氏陽性菌有抑制作用外，特別是對(duì)許多引起植物病害的真菌具有較高的抑制活性[7]，是一類廣譜抗真菌抗生素。

目前，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的檢測(cè)方法主要以HPLC[8]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9]以及免疫分析方法[10]為主。由于現(xiàn)階段關(guān)于波拉霉素檢測(cè)方法的相關(guān)報(bào)道較少，且沒有基于HPLC法開發(fā)的測(cè)定、分離純化發(fā)酵液中波拉霉素的方法，因此，為了推進(jìn)波拉霉素生物合成的相關(guān)研究，應(yīng)對(duì)菌株改造、發(fā)酵條件優(yōu)化等大量樣品檢測(cè)及產(chǎn)物分離純化工作，需要一種可準(zhǔn)確定量且相對(duì)快速的檢測(cè)方法及有效的分離鑒定方法。

本研究建立了吸水鏈霉菌發(fā)酵液中波拉霉素A含量的HPLC檢測(cè)方法，并利用高效制備色譜儀(high performance preparative chromatography, HPPC)從發(fā)酵培養(yǎng)物中分離純化得到了較高純度波拉霉素A溶液，并通過超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-high performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometer, UPLC-Q-TOF)獲得了其質(zhì)譜圖，為波拉霉素的應(yīng)用研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

波拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品、波拉霉素B標(biāo)準(zhǔn)品(純度均>90%)，實(shí)驗(yàn)室自制；乙腈、甲醇(均為色譜純)，德國(guó)Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UltiMate 3000超高效液相色譜儀，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；1290-6545超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀、PrepHT XDB-C18色譜柱(21.2 mm×250 mm，7 μm)，美國(guó)安捷倫科技有限公司；COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，日本Nacai Tesque公司；Prostar高效制備色譜儀，美國(guó)Varian公司。

1.3 波拉霉素A檢測(cè)方法的建立

1.3.1 色譜條件

色譜柱：COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ反相柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相∶V(乙腈)∶V(水)=45∶55；進(jìn)樣量10 μL；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

波拉霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取波拉霉素適量，用流動(dòng)相溶解配制成質(zhì)量濃度為1 g/L的儲(chǔ)備液。分別精密量取該儲(chǔ)備液適量，用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為2.5、5、25、50、125、250、500 mg/L的波拉霉素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，置4 ℃冰箱備用。

1.3.3 發(fā)酵液樣品處理方法

取2 mL發(fā)酵液，加入4 mL色譜純級(jí)別的甲醇溶液，充分振蕩混勻后，置4 ℃冰箱避光放置24 h，12 000 r/min，4 ℃冷凍離心10 min，取上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾[11-12]。

1.3.4 最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定

使用高效液相色譜二極管陣列檢測(cè)器(diode array detector, DAD)紫外全波長(zhǎng)檢測(cè)功能，對(duì)波拉霉素A、B色譜峰進(jìn)行190～400 nm掃描[13]，測(cè)定其最大吸收波長(zhǎng)。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

對(duì)波拉霉素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.1方法進(jìn)行測(cè)定，以波拉霉素A的峰面積(y)對(duì)其質(zhì)量濃度(x, g/L)進(jìn)行線性回歸運(yùn)算，求得線性回歸方程，既為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 檢出限(limit of detection, LOD)和定量限(limit of quantitation, LOQ)的測(cè)定

按1.3.1方法測(cè)定發(fā)酵液樣品中波拉霉素A質(zhì)量濃度和信噪比(S/N)，并使用空白樣品溶液稀釋，以3倍信噪比(S/N≥3)所對(duì)應(yīng)的波拉霉素A質(zhì)量濃度為檢測(cè)限，以10倍信噪比(S/N≥10)所對(duì)應(yīng)的波拉霉素A質(zhì)量濃度為最低定量限[14]。

1.3.7 加標(biāo)回收率的測(cè)定

按照1.3.3方法制備發(fā)酵液樣品，采用樣品加標(biāo)的方法，向樣品中分別加入1倍、2倍、10倍定量限濃度3個(gè)水平的波拉霉素A標(biāo)準(zhǔn)品(GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》)，重復(fù)測(cè)定3次，加標(biāo)回收率的計(jì)算如公式(1)所示[15]：

(1)

式中：Cs為加標(biāo)試樣測(cè)定質(zhì)量濃度，mg/L；C0為未加標(biāo)試樣測(cè)定質(zhì)量濃度，mg/L；CT為理論加標(biāo)質(zhì)量濃度，mg/L。

1.3.8 方法的精密度

將處理好的不同批次且波拉霉素A質(zhì)量濃度不同的3個(gè)樣品，每個(gè)樣品連續(xù)測(cè)定11次，計(jì)算方法的精密度，方法的精密度用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)表示。

1.3.9 波拉霉素A的分離純化

取發(fā)酵培養(yǎng)液1 000 mL，加無水草酸調(diào)pH至4～4.5，離心棄上清液，用凍干機(jī)將沉淀物干燥過夜。干燥的固體粉末用95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇浸泡，避光靜置24 h，期間每隔8 h振蕩混勻1次，離心收集上清液，45 ℃，200 r/min，減壓濃縮至只余水，將水不溶物用乙酸乙酯洗滌2次后，加1倍體積乙腈復(fù)溶，獲得濃縮發(fā)酵培養(yǎng)液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，使用HPPC分離濾液，獲得波拉霉素A純化收集液，重復(fù)3次，并利用1.3.1方法測(cè)定濃縮發(fā)酵培養(yǎng)液和純化收集液中波拉霉素A的質(zhì)量濃度，計(jì)算純度[16]和純化得率[17]。

HPPC條件：色譜柱：PrepHT XDB-C18[(21.2 mm×250 mm，7 μm)；流動(dòng)相：V(乙腈)∶V(水)=45∶55)]；進(jìn)樣量3 mL；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。純度和純度得率的計(jì)算如公式(2)和公式(3)所示：

(2)

(3)

式中：Ai為目標(biāo)物色譜峰面積，mAU·min；At為總色譜峰面積，mAU·min；CA集為純化收集液波拉霉素A質(zhì)量濃度，mg/L；VA集為純化收集液體積，mL；CA縮為濃縮發(fā)酵培養(yǎng)液波拉霉素A質(zhì)量濃度，mg/L；VA縮為濃縮發(fā)酵培養(yǎng)液體積，mL。

1.3.10 UPLC-Q-TOF的質(zhì)譜條件

正離子(Dual AJS ESI+)模式，離子源溫度350 ℃，毛細(xì)管電壓4 000 V，干燥氣流速11 L/min，鞘氣溫度250 ℃，鞘氣流速11 L/min，霧化氣壓力55 psi。一級(jí)母離子掃描范圍m/z為800～1 200，二級(jí)質(zhì)譜使用Targeted-MS/MS模式，選擇1 090.699 6m/z作為母離子，質(zhì)量精度誤差±50 ppm，碎片離子掃描范圍m/z為100～1 200，碰撞能為70 eV。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法專屬性考察

將一定質(zhì)量濃度的波拉霉素混標(biāo)溶液、波拉霉素B標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品和空白樣品，按1.3.1方法操作，獲得波拉霉素混標(biāo)溶液色譜圖(圖1-A)、波拉霉素B標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(圖1-B)、樣品色譜圖(圖1-C)和空白樣品色譜圖(圖1-D)?？梢?，波拉霉素A、B的保留時(shí)間分別約為14.1、16.1 min(圖1)，最大吸收波長(zhǎng)均為220 nm(圖2)，發(fā)酵培養(yǎng)基中的物質(zhì)不干擾波拉霉素A和B的測(cè)定。

2.2 波拉霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

按1.3.5的方法測(cè)定波拉霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為y=0.035 18x+0.086 84,r2=0.999 8。結(jié)果表明，波拉霉素在2.5～500 mg/L線性關(guān)系良好。檢出限為1 mg/L，定量限為2.5 mg/L。

A-波拉霉素混標(biāo)溶液；B-波拉霉素B標(biāo)準(zhǔn)品溶液；C-樣品溶液；D-空白樣品溶液圖1 波拉霉素混合標(biāo)準(zhǔn)品、波拉霉素B標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和空白樣品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standard of polaramycin, standard of polaramycin A, sample, and blank sample

圖2 波拉霉素190～400 nm吸收曲線Fig.2 190～400 nm wavelength absorption curve of polaramycin

2.3 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

表1為回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果，加標(biāo)回收率在90.53%～101.96%。該方法的回收率符合要求。

2.4 精密度

本實(shí)驗(yàn)通過3組濃度樣品考察了方法的精密度，由表2可知，RSD最高為1.65%，<2%，精密度良好。

表1 樣品中波拉霉素的加標(biāo)回收率(n=3)Table 1 Adding standard recoveries of polaramycin in samples(n=3)

表2 樣品中波拉霉素的精密度(n=11)Table 2 Precision of polaramycin in samples (n=11)

2.5 波拉霉素A的分離純化與鑒定

通過1.3.9的分離方法，獲得了含波拉霉素的濃縮發(fā)酵培養(yǎng)液，并通過HPPC收集得到了波拉霉素A純化收集液45 mL，按1.3.1方法操作，測(cè)定獲得濃縮發(fā)酵培養(yǎng)液色譜圖(圖3-A)和波拉霉素A純化收集液色譜圖(圖3-B)，按2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得濃縮發(fā)酵培養(yǎng)液和純化收集液中波拉霉素A質(zhì)量濃度分別為(654.96±50.28)、(33.97±5.01) mg/L，純化得率為(71.84±5.95)%，純化收集液中波拉霉素A的純度為(87.52±7.12)%。

按1.3.10的方法，用UPLC-Q-TOF對(duì)波拉霉素A純化收集液進(jìn)行測(cè)定，得到波拉霉素A純化收集液總離子流色譜圖(圖4)，一級(jí)質(zhì)譜(圖5-A，保留時(shí)間=13.841 min)下產(chǎn)生顯著的m/z1 090.716 0[M+H]+分子離子峰，根據(jù)響應(yīng)值和質(zhì)荷比推斷該純化收集液中主成分為波拉霉素A，質(zhì)量精度誤差為15 ppm，二級(jí)質(zhì)譜(圖5-B，保留時(shí)間=13.869 min)下波拉霉素A分子離子在70 eV碰撞能下進(jìn)一步裂解，產(chǎn)生二級(jí)碎片離子m/z306.295 9[M+H-C36H63O18]+、664.534 4[M+H-C17H29O12]+、1 010.701 3[M+H-H2O-OH-COOH]+、1 028.712 4[M+H-OH-COOH]+、1 046.723 2[M+H-COOH]+。

A-波拉霉素濃縮發(fā)酵培養(yǎng)液；B-波拉霉素A純化收集液圖3 濃縮發(fā)酵培養(yǎng)液、波拉霉素A的純化收集液 的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of concentrated fermentation broth and purified fraction of polaramycin A

圖4 波拉霉素A純化收集液總離子流色譜圖Fig.4 Total ion current chromatogram of purified fraction of polaramycin A

A-一級(jí)質(zhì)譜圖；B-二級(jí)質(zhì)譜圖圖5 波拉霉素A純化收集液一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.5 MS and MS/MS spectra of purified fraction of polaramycin A

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了吸水鏈霉菌發(fā)酵液波拉霉素A的HPLC檢測(cè)和純化方法，結(jié)果表明，波拉霉素A和波拉霉素B均在220 nm附近有最大吸收，保留時(shí)間分別為14.1、16.1 min左右，分離度較好，峰形較好，基本無拖尾，培養(yǎng)基組分不干擾實(shí)驗(yàn)測(cè)定。首次對(duì)檢測(cè)波拉霉素A所建立的分析方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，采用外標(biāo)法測(cè)定波拉霉素A的含量操作簡(jiǎn)單，線性關(guān)系良好結(jié)果準(zhǔn)確，回收率高，重復(fù)性好。該方法是測(cè)定吸水鏈霉菌發(fā)酵液中波拉霉素A的簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確方法。將液相色譜條件應(yīng)用于HPPC及UPLC-Q-TOF，從吸水鏈霉菌發(fā)酵液中分離純化得到了較高純度的波拉霉素A溶液，并獲得了波拉霉素A的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖，為該天然產(chǎn)物的分離純化提供了參考。