王翠蓉，王義俊，張愛霞，韓 峰*

1南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 南京 210003；2南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 211166

腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，即使采用外科手術(shù)結(jié)合放化療的綜合治療手段，惡性膠質(zhì)瘤患者的平均生存時(shí)間也僅有13～15 個(gè)月［1］。惡性膠質(zhì)瘤的突出特征是侵襲性生長(zhǎng)和微血管增生并伴隨高度血管化。膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移均依賴于血管生成，且其惡性程度及預(yù)后與瘤體內(nèi)血管密度高度相關(guān)［2］。因此，抗血管生成已經(jīng)成為一種很有潛力的治療策略。目前臨床上膠質(zhì)瘤的治療多采用以靶向血管內(nèi)皮為主的藥物如貝伐單抗等，但大量的臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這類藥物無(wú)法延長(zhǎng)患者的總生存率，治療效果遠(yuǎn)不如預(yù)期［3-4］，提示腫瘤血管化機(jī)制的復(fù)雜性。血管擬態(tài)的發(fā)現(xiàn)為研究腫瘤血管化提供了新的視野。

1 膠質(zhì)瘤中的血管擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）

1999 年Maniotis 等［5］在對(duì)高侵襲性人眼葡萄膜黑色素瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤中存在過(guò)碘酸-希夫（periodic acid-Schiff staining，PAS）染色呈陽(yáng)性、內(nèi)皮特異性標(biāo)志CD34 染色呈陰性的血管樣管道，表明這些管道缺乏通常生成血管所必須的血管內(nèi)皮細(xì)胞，故推測(cè)其是腫瘤細(xì)胞通過(guò)自身變形和細(xì)胞外基質(zhì)重塑而形成。這是首次鑒定出不依賴于內(nèi)皮細(xì)胞而形成的腫瘤內(nèi)微循環(huán)結(jié)構(gòu)，是不同于經(jīng)典血管生成的腫瘤血供方式，被命名為VM。目前認(rèn)為VM 應(yīng)具有以下基本特征：①呈PAS 染色陽(yáng)性且內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志CD31 或CD34 染色陰性；②VM 通道由腫瘤細(xì)胞構(gòu)成而不是由內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成；③VM 通道內(nèi)有血液流通，可為腫瘤供血；④VM中的腫瘤細(xì)胞表達(dá)多能干細(xì)胞表型［6-7］。迄今發(fā)現(xiàn)腫瘤中有兩種不同類型的VM，即管型和圖案樣基質(zhì)型。管型VM是由模擬內(nèi)皮細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞形成的中空、有灌注的管型通道。而圖案樣基質(zhì)型VM不包含連續(xù)的管腔，且在形態(tài)上或拓?fù)鋵W(xué)上與經(jīng)典的血管幾乎無(wú)相似之處［8］。

2005年Yue等［9］首次報(bào)道在膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)圖案樣基質(zhì)型VM。2010 年El Hallani 等［10］報(bào)道了腦膠質(zhì)瘤中管型VM的存在。隨后根據(jù)臨床樣本的研究證實(shí)，腦膠質(zhì)瘤存在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)襯的血管且與VM相互連接。VM 與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別相關(guān)，并且與膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后及腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)都呈顯著相關(guān)性［11］。

2 腫瘤微環(huán)境與VM

腫瘤微環(huán)境（tumor micro-environment，TME）是指腫瘤細(xì)胞存在的周圍微環(huán)境，包括所有非癌宿主細(xì)胞如免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、炎性細(xì)胞等，以及非細(xì)胞成分如細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子、細(xì)胞外囊泡等［12］。TME 與正常的內(nèi)環(huán)境不同，具有缺氧、低pH、間質(zhì)高壓、血管高滲透性及炎癥反應(yīng)等特點(diǎn)。在腫瘤生長(zhǎng)的過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞和TME 的組成部分之間會(huì)發(fā)展出一種動(dòng)態(tài)的相互關(guān)系，以支持腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移，而這種動(dòng)態(tài)相互關(guān)系在VM 形成中也起著不可或缺的作用［13-14］。在以下的部分，將探討TME 是如何影響膠質(zhì)瘤VM 的形成。

2.1 缺氧參與介導(dǎo)VM

缺氧是腫瘤微環(huán)境最典型的特征，也是腫瘤細(xì)胞惡化的重要因素。腫瘤內(nèi)缺氧可激活多種信號(hào)通路，進(jìn)而引起腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、血管生成、免疫逃逸等一系列變化［15］。缺氧使腫瘤微環(huán)境中高度惡性的腫瘤細(xì)胞塑形性和分化潛能明顯提高，并選擇性表達(dá)某些血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因如血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-Cadherin）等參與VM 的形成。在缺氧條件下，缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF）包括HIF-1α和HIF-2α通過(guò)與啟動(dòng)子中的缺氧反應(yīng)元件（hypoxia response element，HRE）直接相互作用，顯著上調(diào)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中VE-Cadherin 的表達(dá)，促進(jìn)膠質(zhì)瘤VM 的形成。HIF-1α還可通過(guò)調(diào)控其下游靶基因血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的轉(zhuǎn)錄，影響VM 的形成［16］。此外，膠質(zhì)瘤中Beclin-1 與HIF-1α、VEGF 的表達(dá)呈正相關(guān)，沉默Beclin-1 可減輕缺氧誘導(dǎo)的VM形成［17］。

2.2 缺氧微環(huán)境促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞分化

腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）是一類具有自我更新、多向分化和觸發(fā)新腫瘤能力的極小細(xì)胞群。將CSC 與從腫瘤環(huán)境中提取的基質(zhì)細(xì)胞一起注射到小鼠體內(nèi)會(huì)形成更具侵襲性的腫瘤，這表明微環(huán)境具有顯著影響CSC 分化為不同細(xì)胞表型的潛力。膠質(zhì)瘤的特征是廣泛的組織缺氧，而影響膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（glioma stem cell，GSC）表型的最突出的非細(xì)胞自主因素之一是腫瘤微環(huán)境中缺氧的存在。研究表明，在缺氧條件下，CD133 的表達(dá)增加，提示周圍缺氧生態(tài)位增強(qiáng)了GSC 的干性［18］。

能夠形成VM的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出高度可塑性和胚胎樣表型，并有內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，提示CSC與VM 形成細(xì)胞之間密切相關(guān)。Ricci-Vitiani 等［19］和Wang等［20］首先證實(shí)GSC 在有利于內(nèi)皮細(xì)胞分化的條件下能夠轉(zhuǎn)分化為具有內(nèi)皮表型和功能的細(xì)胞，且參與腫瘤血管的形成。El Hallani等［10］的研究結(jié)果表明GSC 不僅可以表達(dá)與血管生成和內(nèi)皮相關(guān)的基因，而且一部分GSC還可分化為血管平滑肌樣細(xì)胞形成VM。Wu 等［21］則進(jìn)一步證明在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境下，GSC能形成VM管腔狀結(jié)構(gòu)，且高表達(dá)VM相關(guān)蛋白。將分離純化的GSC接種至免疫缺陷小鼠體內(nèi)可形成移植瘤，且瘤體內(nèi)觀察到大量VM 形成。目前的研究表明惡性膠質(zhì)瘤中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）不僅是GSC“干性”維持所必需的，而且是驅(qū)動(dòng)GSC 向周細(xì)胞轉(zhuǎn)分化形成VM 的關(guān)鍵分子。下調(diào)VEGFR2基因的表達(dá)或抑制其活性能夠阻斷GSC 向血管壁樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化及體外成管能力，從而抑制膠質(zhì)瘤VM 的形成［22］。還有研究結(jié)果顯示VEGF 可以刺激GSC 上調(diào)VEGFR2 的表達(dá)，使VM 的形成增多，VEGFR2 可通過(guò)介導(dǎo)GSC 遷移及轉(zhuǎn)分化等功能參與VM 的形成［23］。此外，GSC 自噬時(shí)通過(guò)活性氧調(diào)節(jié)VEGFR2的活化可促進(jìn)膠質(zhì)瘤VM的形成［21］。

GSC轉(zhuǎn)分化為內(nèi)皮樣細(xì)胞可能涉及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT），這在膠質(zhì)瘤的VM形成過(guò)程中也至關(guān)重要。在缺氧誘導(dǎo)的EMT 過(guò)程中，相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Twist 和Snail 的表達(dá)上調(diào)，而上皮細(xì)胞之間的緊密連接蛋白E-鈣黏蛋白下調(diào)，隨后GSC 表現(xiàn)出內(nèi)皮細(xì)胞的特征。有研究表明，缺氧可上調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中巨噬細(xì)胞遷移抑制因子和趨化因子受體4 型（chemokine receptor 4，CXCR4）并激活下游Akt 途徑增強(qiáng)EMT 以誘導(dǎo)VM形成［24］。

2.3 細(xì)胞外基質(zhì)重塑參與介導(dǎo)VM

腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）重塑是VM形成中的一個(gè)重要改變。高侵襲性黑色素瘤能產(chǎn)生黏連蛋白，膠原蛋白Ⅳ和Ⅵ以及纖維結(jié)合蛋白，而這些物質(zhì)構(gòu)成了VM 形成所需的細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境，說(shuō)明腫瘤ECM重塑參與了VM形成［25］。

每個(gè)組織的ECM 具有獨(dú)特的成分和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。成人腦組織的ECM富含透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素蛋白聚糖、層黏連蛋白和腱糖蛋白［26］。腱糖蛋白-C（tenascin-C，TNC）是腱糖蛋白家族中發(fā)現(xiàn)最早的一種重要ECM分子，在神經(jīng)組織中由星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)釋放。最新研究顯示TNC與膠質(zhì)瘤中VM形成有關(guān)，外源性TNC能刺激VM形成，敲低TNC則顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞在體外和體內(nèi)中的VM 形成，并減少細(xì)胞的侵襲和遷移［27］。

除此之外，高級(jí)別惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的表達(dá)明顯上調(diào)［28-29］。MMP 是一組能降解ECM 和基底膜蛋白的蛋白溶解酶家族分子，對(duì)ECM 重塑有著重要作用。大量研究表明MMP 在多種因子或環(huán)境的影響下過(guò)表達(dá)從而誘導(dǎo)腫瘤VM 的形成。與VM 形成相關(guān)的MMP 家族蛋白酶主要有MMP-2、MMP-9及膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1（membrane type 1-matrix metalloproteinase，MT1-MMP）。當(dāng)MT1-MMP被上游分子激活，可將MMP-2 的前體形式轉(zhuǎn)化為活性形式。有研究表明，B 細(xì)胞淋巴瘤2 在缺氧條件下可通過(guò)影響MMP-2 與MT1-MMP 進(jìn)而影響膠質(zhì)瘤VM的形成［16］。層黏連蛋白5γ2（laminin5γ2）是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，其γ2 鏈在基底膜構(gòu)建以及細(xì)胞黏附、遷移等方面有著重要作用。MT1-MMP和MMP-2均促進(jìn)laminin5γ2鏈裂解，進(jìn)而刺激腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和VM的形成［30］。Liu等［31］研究表明，組蛋白脫乙?；? 通過(guò)調(diào)控MMP-laminin5γ2 信號(hào)通路參與膠質(zhì)瘤VM形成。新近報(bào)道胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2 可通過(guò)增強(qiáng)腦膠質(zhì)瘤中CD144 和MMP-2的表達(dá)，促進(jìn)VM 的形成［32］。以上研究表明腫瘤細(xì)胞表達(dá)高水平的MMP 等物質(zhì)，降解層黏連蛋白，重塑ECM，為VM 網(wǎng)絡(luò)的形成提供空間。

2.4 腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞與VM

TME為腫瘤的生長(zhǎng)提供了“土壤”，而腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblast，CAF）則是TME 中基質(zhì)重塑的建筑師［33］。有研究發(fā)現(xiàn)，CAF可通過(guò)細(xì)胞間直接接觸、細(xì)胞因子分泌等作用，激活信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及免疫抑制［34］。此外，CAF 還可以促進(jìn)腫瘤中內(nèi)皮依賴性血管的形成。有文獻(xiàn)報(bào)道CAF 能促進(jìn)膽囊癌及肝癌中VM的形成［35-36］。而在膠質(zhì)瘤中，VM結(jié)構(gòu)能共同表達(dá)CAF 的標(biāo)志物α-SMA 和PDGFR［22］。這表明CAF 在促進(jìn)膠質(zhì)瘤VM 形成方面可能具有尚未被重視的功能。

2.5 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與VM

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophage，TAM）作為主要的腫瘤浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞，可刺激腫瘤血管生成。在膠質(zhì)瘤中，TAM數(shù)量占腫瘤細(xì)胞團(tuán)的30%，存在于實(shí)質(zhì)與血管周圍［37］。有研究表明大量的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)于膠質(zhì)瘤VM陽(yáng)性區(qū)域且TAM在體外能促進(jìn)膠質(zhì)瘤VM 的形成。Rong 等［38］研究表明TAM 通過(guò)上調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞COX-2 表達(dá)進(jìn)而激活前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）/EP1/PKC通路來(lái)促進(jìn)VM 的形成。此外，Zhang 等［39］發(fā)現(xiàn)TAM 還可以通過(guò)PKC 通路增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞IL-6 的分泌進(jìn)而促進(jìn)VM的形成。這些研究表明TAM通過(guò)不同促炎介質(zhì)參與誘導(dǎo)VM形成。

3 靶向膠質(zhì)瘤VM的治療策略

抗血管生成治療已經(jīng)作為膠質(zhì)瘤標(biāo)準(zhǔn)療法的輔助治療手段。目前臨床上使用的抗血管生成藥物主要以VEGF-VEGFR信號(hào)通路為靶點(diǎn)，包括貝伐單抗、舒尼替尼等，然而這種療法的益處是短暫的，并沒有考慮到腫瘤細(xì)胞形成VM的問題。這種療法不但無(wú)法完全阻斷腫瘤組織內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)供給，而且隨著血管密度降低，還會(huì)加劇腫瘤組織內(nèi)局部缺氧，進(jìn)而觸發(fā)VM 形成，導(dǎo)致抗血管生成耐藥［4，40］。因此，抑制VM 形成成為腫瘤血管靶向治療的新方向。本文在表1中總結(jié)了目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的一些具有抑制膠質(zhì)瘤VM形成的潛在藥物以及能同時(shí)抑制血管形成和VM形成的化合物。

表1 靶向膠質(zhì)瘤VM的潛在藥物Table 1 Potential drugs targeting VM in glioma

3.1 VM抑制劑

目前研究結(jié)果已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些針對(duì)上述膠質(zhì)瘤VM形成分子機(jī)制中的部分靶標(biāo)所產(chǎn)生的治療策略，包括應(yīng)用一些通路的抑制劑、對(duì)傳統(tǒng)藥物的改良等。YC-1 作為HIF-1α抑制劑已被發(fā)現(xiàn)能抑制膠質(zhì)瘤VM 的形成［16］。自噬抑制劑氯喹可通過(guò)調(diào)控VEGFR2的活化進(jìn)而在體內(nèi)外抑制GSC形成VM，且其與貝伐單抗合用能有效降低VM 形成，從而取得更好的抗腫瘤療效［21］。此外，通過(guò)對(duì)長(zhǎng)春瑞濱進(jìn)行藥劑學(xué)修飾，可促進(jìn)藥物透過(guò)血腦屏障，增強(qiáng)其抗腫瘤及抗VM形成的作用［41］。

3.2 血管生成和VM抑制劑

最理想的抗血管生成療法應(yīng)該能同時(shí)抑制血管生成和VM，雙管齊下發(fā)揮更好的療效。一些藥物之前已被發(fā)現(xiàn)具有良好的抗血管生成作用，最新研究發(fā)現(xiàn)其還具有良好的抗VM形成作用。如組蛋白去乙酰化酶抑制劑［42］、雷公藤紅素［43］、N6-異戊烯基腺苷（N6-isopentenyladenosine，iPA）［44］等。其中，iPA 抑制VM 形成的機(jī)制與抗血管生成機(jī)制不同，iPA 通過(guò)抑制RhoA/ROCK 信號(hào)，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維分解，從而抑制細(xì)胞遷移及VM形成；而其發(fā)揮抗血管生成作用主要是通過(guò)激活A(yù)MPK 通路。此外，Ke 等［45］研究發(fā)現(xiàn)體外合成人細(xì)胞外基質(zhì)蛋白Fibulin-3 的變體蛋白ZR30 可通過(guò)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的EGFR/Akt 和Notch1/Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞外MMP-2活化，發(fā)揮很好的抗膠質(zhì)瘤血管生成和VM的雙重作用。

4 總結(jié)與展望

VM的發(fā)現(xiàn)改變了以往人們對(duì)經(jīng)典腫瘤血供方式的認(rèn)知，使人們認(rèn)識(shí)到了腫瘤細(xì)胞一些新的生物學(xué)特性，也為腫瘤抗血管生成治療和預(yù)后判斷提供了極具潛在應(yīng)用價(jià)值的新思路、新方法。從目前研究來(lái)看，VM 形成是一個(gè)由多因素誘導(dǎo)、多分子參與、多條信號(hào)通路調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，其詳細(xì)的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，包括ECM的主要成分在重塑過(guò)程中是如何變化的？CAF 主要是通過(guò)什么機(jī)制影響膠質(zhì)瘤VM 的形成？這對(duì)尋找抑制VM 的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，篩選有效的具有VM抑制作用的藥物，提高膠質(zhì)瘤的療效具有重要意義。