花 穎，劉文世，鄭冬冬，張 偉，黃 榮，李曉飛*

1南通大學附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，江蘇 南通 226001；2廈門市第五醫(yī)院心血管內(nèi)科，福建 廈門 361101

先天性心臟病（congenital heart disease，CHD）是最常見的先天性疾病，在世界范圍內(nèi)影響1%的新生嬰兒［1］。肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是成人CHD的嚴重并發(fā)癥，發(fā)生率為5%～10%［2］。PAH的診斷常被延誤，從CHD患者開始出現(xiàn)癥狀到確診為PAH 大約需要6 年時間［3］。盡管通過肺血管擴張劑治療降低了死亡風險，但CHD-PAH的病死率仍然很高［4］。目前，診斷及評估PAH嚴重程度的金標準是右心導(dǎo)管術(shù)，但基層醫(yī)院難以開展，且為有創(chuàng)檢查、費用較高，無法用于PAH患者的長期隨訪及反復(fù)評估。臨床上常通過超聲心動圖測得的三尖瓣反流速度來估算肺動脈收縮壓（pulmonary artery systolic pressure，PASP）。但是，三尖瓣反流速度峰值有時難以測量（無三尖瓣關(guān)閉不全），而且估算的PASP 常不準確。由于CHD-PAH 病因復(fù)雜，且疾病最終影響多個系統(tǒng)，目前尚未發(fā)現(xiàn)理想的生物學標志物。迄今為止，僅B 型腦鈉肽（B-type natriuretic peptide，BNP）/N 端腦鈉肽前體（NT-proBNP）被廣泛用于CHD-PAH 患者的風險評估，但其受年齡、性別、心功能分級等因素影響，診斷特異度不高。因此急需一些微創(chuàng)、客觀、高效的生物標志物用于CHD-PAH 患者的早期診斷及嚴重程度的評估。

白介素-32（interleukin-32，IL-32）是一種新型促炎性細胞因子，其mRNA 選擇性剪接可產(chǎn)生9 種不同亞型：IL-32α、IL-32β、IL-32γ、IL-32δ、IL-32ε、IL-32ζ、IL-32η、IL-32θ和IL-32sm。其中IL-32α含量最高，而IL-32γ的生物活性最強［5］。既往研究表明，IL-32在宿主抵抗病原體、炎癥性疾病及癌癥的發(fā)病機制中起著至關(guān)重要的作用。IL-32 參與多種疾病過程，包括慢性阻塞性肺病、克羅恩病、牛皮癬、類風濕關(guān)節(jié)炎和Wegener肉芽腫病等疾病。也有研究發(fā)現(xiàn)，IL-32 與多種心血管疾病密切相關(guān)，如動脈粥樣硬化、冠狀動脈疾病和心力衰竭。令人感興趣的是，IL-32 被證實在特發(fā)性肺動脈高壓（idiopathic PAH，IPAH）肺叢狀病變的異常內(nèi)皮細胞中表達增加［6］。最近一項包含18 例系統(tǒng)性硬化癥相關(guān)肺動脈高壓患者和15 例IPAH 患者的研究指出，血清IL-32 可能是篩查WHO 第Ⅰ類PAH 患者的有用生物標志物［7］。盡管在肺組織學方面相似，但CHD相關(guān)PAH 在心臟解剖、病理生理和臨床結(jié)局等方面與其他病因引起的PAH 明顯不同，因此IL-32 能否作為CHD-PAH 患者的生物標志物還有待進一步研究。

1 對象和方法

1.1 對象

研究組納入2018年9月—2021年5月收住南通大學附屬醫(yī)院行右心導(dǎo)管術(shù)的CHD患者共85例，其中包括66 例房間隔缺損（atrial septal defect，ASD），17例動脈導(dǎo)管未閉（patent ductus arteriosus，PDA）以及2 例室間隔缺損（ventricular septal defect，VSD）。納入標準：①年齡＞18歲；②診斷為CHD。排除標準：①其他原因?qū)е碌姆胃邏海╬ulmonary hypertension，PH）；②其他原因引起的PAH；③全麻手術(shù)；④嚴重的肝腎功能不全；⑤感染性疾病；⑥惡性腫瘤；⑦其他可能影響血清IL-32 水平的疾病；⑧PAH 靶向藥物治療。根據(jù)當前指南，PH 定義為靜息狀態(tài)下，平均肺動脈壓（PAPm）≥25 mmHg［8］，最近第六屆世界肺動脈高壓專題討論會提出了更低的閾值20 mmHg［9］，基于此，本研究根據(jù)右心導(dǎo)管術(shù)測得的PAPm將其分成4組：無PAH組（PAPm≤20 mmHg）24 例，灰色區(qū)間組（21 mmHg＜PAPm＜25 mmHg）28 例，輕度組（25 mmHg≤PAPm＜35 mmHg）20例，中重度組（PAPm≥35 mmHg）13 例。對照組納入于南通大學附屬醫(yī)院體檢的健康成人共30 例，納入標準：①年齡＞18 歲；②超聲心動圖測得的PASP 在正常范圍之內(nèi)。排除標準：①診斷為CHD；②嚴重肝腎功能不全；③感染性疾??；④惡性腫瘤；⑤其他可能影響血清IL-32 水平的疾??；⑥合并其他可能引起PH或PAH的情況。本研究已獲得南通大學附屬醫(yī)院倫理委員會的批準（編號：2016-52），受試者或其家屬均已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集

收集研究組CHD 患者的一般資料，主要包括：年齡、性別、身高、體重、現(xiàn)病史、既往史，入院后完善血常規(guī)、肝腎功能、血糖、血氣分析、類風濕因子、血沉、心肌標志物、心電圖、超聲心動圖、全胸片或胸部CT等輔助檢查，記錄導(dǎo)管術(shù)測得的血流動力學參數(shù)。對照組主要收集年齡、性別、身高、體重、血常規(guī)、血生化、超聲心動圖等信息。

1.2.2 標本測定

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測各組血清IL-32 的水平，化學發(fā)光微粒子免疫分析法（CMIA）測定試驗組血漿BNP的水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，Graphpad Prism 5 軟件繪圖。檢驗數(shù)據(jù)的正態(tài)分布性，若近似或符合正態(tài)分布，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，兩組間數(shù)據(jù)的比較采用獨立樣本t檢驗，多組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析（ANOVA）。非正態(tài)分布的連續(xù)變量用中位數(shù)（四分位數(shù)）［M（P25，P75）］表示，兩組間數(shù)據(jù)的比較采用Mann-WhitneyU檢驗，多組間數(shù)據(jù)的比較采用Kruskal-Wallis 檢驗。計數(shù)資料以相應(yīng)例數(shù)或比例表示，采用χ2檢驗或Fisher 精確概率法檢驗。Spearman 秩相關(guān)分析用于變量之間的相關(guān)性分析。MedCalc統(tǒng)計軟件19.6.3 版用于繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，使用Hanley和McNeil 方法比較曲線下面積（area under curve，AUC）的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料對比

各組紅細胞分布寬度、氧分壓、BNP、PAPm、PASP以及肺血管阻力（pulmonary vascular resistance，PVR）的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而各組在性別構(gòu)成、年齡、BMI、缺損類型、肌酐等方面無顯著差異（P＞0.05，表1）。

表1 各組臨床資料比較Table 1 Comparison of clinical data among various groups

2.2 各組間血清IL-32的比較

中重度組［87.3（46.5，132.4）pg/mL］、輕度組［66.1（34.2，124.5）pg/mL］和灰色區(qū)間組［77.9（34.7，112.3）pg/mL］的血清IL-32 水平較無PAH 組［37.9（16.5，52.9）pg/mL］及對照組［31.5（17.7，38.7）pg/mL］顯著升高，中重度組、輕度組與灰色區(qū)間組以及無PAH組與對照組之間的血清IL-32水平無顯著差異（圖1）。根據(jù)肺體循環(huán)血流量比（Qp/Qs）大小，將實驗組重新分組為分流量大的CHD 組（Qp/Qs ≥1.5）及分流量小的CHD 組（Qp/Qs ＜1.5），發(fā)現(xiàn)分流量大的CHD 組血清IL-32 水平［75.5（37.4，114.0）pg/mL］顯著高于分流量小的CHD組［43.6（31.0，59.6）pg/mL］（圖2）。

圖1 5組間IL-32水平分析Figure 1 Analysis of IL-32 levels in the five groups

圖2 CHD（Qp/Qs≥1.5）血清IL-32水平高于CHD（Qp/Qs＜1.5）Figure 2 CHD（Qp/Qs≥1.5）serum IL-32 level is higher than CHD（Qp/Qs＜1.5）

2.3 相關(guān)性分析

CHD患者血清IL-32水平與PAPm、PASP、Qp/Qs 顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)依次分別為0377、0.286、0.266，P＜0.05，圖3～5），而與BNP、PVR、混合血氧飽和度（SvO2）無顯著相關(guān)性。Qp/Qs和PVR顯著負相關(guān)（相關(guān)系數(shù)-0.489，P＜0.001，圖6）；而與PAPm、PASP無顯著相關(guān)性。

圖3 血清IL-32水平與PAPm正相關(guān)Figure 3 Serum IL-32 level is positively correlated with PAPm

圖4 血清IL-32水平與PASP正相關(guān)Figure 4 Serum IL-32 level is positively correlated with PASP

圖5 血清IL-32水平與Qp/Qs正相關(guān)Figure 5 Serum IL-32 level is positively correlated with Qp/Qs

圖6 Qp/Qs和PVR負相關(guān)Figure 6 PVR is negatively correlated with Qp/Qs

2.4 ROC曲線

為了研究IL-32早期診斷CHD-PAH 的價值，我們將灰色區(qū)間組并入PAH 組，即PAH 閾值定義為PAPm＞20 mmHg，ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)當BNP 截斷值取11.3 pg/mL 時，診斷PAH 的靈敏度為93%，特異度為50%，陽性預(yù)測值（PPV）為83%，陰性預(yù)測值（NPV）為75%；當IL-32 截斷值取58.49 pg/mL 時，診斷PAH 的靈敏度為62%，特異度為92%，PPV 為95%，NPV 為49%。IL-32 診斷PAH 的效能不劣于BNP（IL-32，AUC=0.778；BNP，AUC=0.765；P=0.86）。盡管BNP 聯(lián)合IL-32 的AUC 與單獨使用BNP 的AUC 無統(tǒng)計學差異（P=0.09），但其具有更高的靈敏度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值（表2、圖7）。

圖7 血清IL-32、血漿BNP及聯(lián)合診斷PAH的ROC曲線分析Figure 7 ROC curve analysis of serum IL-32，plasma BNP，and combined PAH diagnosis

表2 血清IL-32、血漿BNP及聯(lián)合診斷PAH的ROC曲線分析Table 2 ROC curve analysis of serum IL-32，plasma BNP，and combined PAH diagnosis

3 討論

越來越多的證據(jù)表明炎癥在PAH 中起著重要作用。某些細胞因子和趨化因子的循環(huán)水平升高，如IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-18、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、γ-干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）、CXC 趨化因子配體10（CXC chemokine ligand-10，CXCL10），部分與疾病的嚴重程度或患者生存率相關(guān)［10-13］。在血管和PAH叢狀病變附近存在炎癥細胞浸潤，包括T和B淋巴細胞、細胞毒性T細胞、輔助性T細胞、自然殺傷細胞、單核細胞、巨噬細胞、肥大細胞和樹突細胞［14］。盡管人們一致認為炎癥和免疫機制在PAH 的病理生理學中發(fā)揮作用，但對炎癥是否導(dǎo)致血管病變或炎癥細胞和免疫細胞如何導(dǎo)致重塑肺血管的閉塞或生成知之甚少。既往研究表明，IL-32是內(nèi)皮細胞功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑［15］，而內(nèi)皮細胞功能障礙在PAH疾病進展中起著至關(guān)重要的作用。最近研究也發(fā)現(xiàn)，IL-32 具有血管生成特性，已在IPAH 肺叢狀病變的異常內(nèi)皮細胞中鑒定出IL-32，并且它可能參與了這些異常內(nèi)皮細胞的激活與增殖，過度增生的內(nèi)皮細胞可能有助于肺動脈重塑，導(dǎo)致血管腔閉塞，IL-32被認為是聯(lián)系內(nèi)皮細胞生物學中炎癥和血管生成的紐帶［6］。

本研究發(fā)現(xiàn)，中重度及輕度PAH 患者的血清IL-32 水平高于無PAH 的CHD 患者。IL-32 在多種免疫細胞（如自然殺傷細胞、T 細胞、單核細胞、巨噬細胞）和非免疫細胞（如內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞）中表達，其產(chǎn)生受不同的細胞因子（如IL-1β、IL-2、IL-18、TNF-α、INF-γ）誘導(dǎo)［16］。它也可以刺激多種促炎性細胞因子的生成，包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8，部分是通過NF-κB 或p38 MAPK途徑實現(xiàn)的［17］。而這些細胞、細胞因子以及信號通路［18］均與PAH密切相關(guān)。

自第一屆世界肺動脈高壓專題討論會（WSPH）以來，PAH 被定義為靜息狀態(tài)下PAPm≥25 mmHg，其在某種程度上是根據(jù)經(jīng)驗所得。來自正常受試者的最新數(shù)據(jù)顯示，正常PAPm為（14.0±3.3）mmHg，PAPm＞20 mmHg 高于平均值2 個標準差，其高于正常上限（高于第97.5百分位），該定義是基于科學的方法。許多肺血管疾病與PAPm升高相關(guān)，PAPm在21～24 mmHg，則處于疾病進展的風險之中，最近已有多個報道提出將20 mmHg 作為PAPm 正常值的上限［9，19］。本研究發(fā)現(xiàn)灰色區(qū)間組的CHD患者血清IL-32 水平高于無PAH 組的CHD 患者，表明IL-32在疾病早期就出現(xiàn)變化，血清IL-32 可能有利于CHD-PAH的早期診斷及干預(yù)治療。

血流動力學參數(shù)是診斷及評估PAH 的關(guān)鍵指標。本研究發(fā)現(xiàn)，血清IL-32水平與PAPm、PASP 呈正相關(guān)，這與Di Benedetto 等［7］的研究結(jié)論相似，提示IL-32可能參與了疾病進程，血清IL-32具有評估CHD-PAH患者嚴重程度的潛力。CHD-PAH通常繼發(fā)于左向右分流型缺損，常見缺損主要包括VSD、ASD和PDA，肺血流量的增多被認為是CHD肺血管重塑的重要觸發(fā)因素［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，分流量大的CHD 患者（Qp/Qs≥1.5）血清IL-32 水平高于分流量小的CHD 患者（Qp/Qs ＜1.5），且其與Qp/Qs 呈正相關(guān)，表明血清IL-32 可能具有評估CHD 患者血流動力學負荷的潛力。

將灰色區(qū)間組并入PAH組，即PAH閾值定義為PAPm＞20 mmHg，以探討IL-32 用于CHD-PAH 早期診斷的價值。ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)，當IL-32 截斷值取58.49 pg/mL 時，診斷PAH 的靈敏度為62%，特異度高達92%。越來越多的證據(jù)表明，多種生物標志物聯(lián)合有利于獲取疾病更準確的信息，因此我們進一步研究了IL-32 聯(lián)合BNP 診斷PAH 的價值，發(fā)現(xiàn)IL-32 診斷PAH 的效能不劣于BNP，盡管BNP 聯(lián)合IL-32的AUC與單獨使用BNP的AUC無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），但其具有更高的靈敏度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值。

本研究還存在一些局限性。首先，這是一項單中心研究，需要擴大樣本量。其次，本研究所用試劑盒能夠識別IL-32 的3 種主要亞型（α、β和γ），但不能細分，后續(xù)的研究需探討不同亞型在CHD-PAH中的含量及作用。