張邢松，沈 蓉，朱興華，繆小兵

南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院（南通市腫瘤醫(yī)院）病理科，江蘇 南通 226361

子宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤，也是女性癌癥死亡的主要原因之一，尤其是在發(fā)展中國家和地區(qū)［1］。子宮頸鱗狀細(xì)胞癌（cervical squamous cell carcinoma，CSCC）是子宮頸癌最常見的組織學(xué)亞型［2］。泛素化是一種重要的蛋白翻譯后修飾，通過嚴(yán)格且精準(zhǔn)地調(diào)控蛋白質(zhì)穩(wěn)定性來維持激活信號(hào)與抑制信號(hào)之間的平衡，參與多種生命活動(dòng)。泛素化需要E1 泛素激活酶（E1 ubiquitin-activating enzymes，簡(jiǎn)稱E1）、E2 泛素結(jié)合酶（E2 ubiquitin-conjugating enzymes，簡(jiǎn)稱E2）以及E3 泛素連接酶（E3 ubiquitin ligases，簡(jiǎn)稱E3）的協(xié)同作用。E1 激活泛素后將泛素傳遞給E2；E3負(fù)責(zé)底物的特異性識(shí)別，可將結(jié)合E2 的泛素連接到靶蛋白上［3-4］。Casitas B 細(xì)胞淋巴瘤（Casitas B-lineage lymphoma，Cbl）蛋白是E3 大家族中的重要成員，由c-Cbl（又稱RNF55）、Cbl-b（又稱RNF56）和Cbl-c（又稱Cbl-3、RNF57）組成。有研究報(bào)道，Cbl 蛋白家族成員在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但因各家族成員之間的結(jié)構(gòu)差異，其在腫瘤中發(fā)揮的作用也不同［5-8］。目前，Cbl 蛋白家族在CSCC中的表達(dá)及意義仍不清楚。本研究利用免疫組化法檢測(cè)c-Cbl、Cbl-b 和Cbl-c 在114 例CSCC 中的表達(dá)情況，分析Cbl 蛋白家族在CSCC 中的作用及臨床意義。

1 材料和方法

1.1 材料

收集2008年6月—2014年8月南通市腫瘤醫(yī)院病理科確診的CSCC 石蠟標(biāo)本114 例?；颊吣挲g29～75 歲，中位年齡55 歲。114 例患者中無脈管侵犯95例，有脈管侵犯19例。腫瘤高～中分化49例，低分化65 例。浸潤(rùn)深度＜1/3 纖維肌層47 例，1/3～2/3纖維肌層30 例，＞2/3 纖維肌層37 例。腫瘤最大徑＜4 cm 104 例，≥4 cm 10 例。無盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移100例，有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14 例。FIGO 分期Ⅰ～ⅡA 期100 例，ⅡB～Ⅲ期14例。入選病例樣本均為手術(shù)標(biāo)本，患者術(shù)前均未接受放、化療。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（通腫倫審2021-086）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化

免疫組化染色采用EnVision 法，具體操作步驟按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。c-Cbl 抗體（貨號(hào)25818-1-AP，稀釋度1∶200）、Cbl-b 抗體（貨號(hào)12781-1-AP，稀釋度1∶50）（Proteintech 公司，美國）；Cbl-c 抗體（貨號(hào)sc-390648，稀釋度1∶100）（Santa Cruz Biotechnology公司，美國）；二抗及DAB（Dako 公司，丹麥）。用已知陽性組織作陽性對(duì)照，PBS 代替一抗作陰性對(duì)照。

1.2.2 免疫組化結(jié)果判讀

免疫組化判讀采用組織化學(xué)評(píng)分法（histochemistry score，H-score）。按著色強(qiáng)度：無著色計(jì)0分，弱著色計(jì)1 分，中等著色計(jì)2 分，強(qiáng)著色計(jì)3 分。H-score=3 ×強(qiáng)著色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)+2×中等著色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)+1×弱著色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。H-score 范圍為0～300［9］。采用X-tile軟件確定c-Cbl、Cbl-b以及Cbl-c高、低表達(dá)最佳截?cái)嘀担簩-score ＜40定義為c-Cbl低表達(dá)，H-score ≥40 定義為c-Cbl 高表達(dá)；H-score ＜70 定義為Cbl-b 和Cbl-c 低表達(dá)，H-score ≥70 定義為Cbl-b和Cbl-c高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0 對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。c-Cbl、Cbl-b 以及Cbl-c 在CSCC 癌組織和癌旁鱗狀上皮表達(dá)的H-Score 采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。c-Cbl、Cbl-b 以及Cbl-c 表達(dá)與CSCC患者臨床病理特征的關(guān)系采用Pearsonχ2檢驗(yàn)或Fisher 精確概率法檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，log-rank 法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。單因素和多因素預(yù)后分析采用Cox 風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 c-Cbl、Cbl-b 以及Cbl-c 在CSCC 中的表達(dá)及其與患者臨床病理特征的關(guān)系

c-Cbl、Cbl-b以及Cbl-c主要定位于細(xì)胞質(zhì)，偶可定位于細(xì)胞核。114 例CSCC 患者中，c-Cbl 高表達(dá)87 例，低表達(dá)27 例；Cbl-b 高表達(dá)69 例，低表達(dá)45 例；Cbl-c 高表達(dá)55 例，低表達(dá)59 例。c-Cbl 在癌組織和癌旁鱗狀上皮H-score 分別為143.80±8.76、95.13 ± 6.54，其在癌組織中的表達(dá)高于癌旁鱗狀上皮（P＜0.001）；Cbl-b 在癌組織和癌旁鱗狀上皮H-score 分別為83.95±5.28、93.54±3.91，其在癌和癌旁鱗狀上皮中的表達(dá)無顯著差異（P=0.146）；Cbl-c 在癌組織和癌旁鱗狀上皮H-score 分別為83.62 ± 6.34、36.54 ± 4.64，其在癌組織中的表達(dá)高于癌旁鱗狀上皮（P＜0.001，圖1）。c-Cbl 表達(dá)與腫瘤分化（P=0.040）以及腫瘤最大徑（P=0.011）相關(guān)，其在高～中分化以及最大徑＜4 cm 腫瘤中表達(dá)較高；但c-Cbl 表達(dá)與患者年齡、脈管侵犯、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及FIGO 分期均無關(guān)（P均＞0.05）。Cbl-b表達(dá)與浸潤(rùn)深度（P=0.045）相關(guān)，其在浸潤(rùn)深度＞2/3纖維肌層患者中表達(dá)較高；但Cbl-b 表達(dá)與患者年齡、脈管侵犯、腫瘤分化、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及FIGO 分期均無關(guān)（P均＞0.05）。Cbl-c表達(dá)與腫瘤分化（P=0.012）相關(guān)，其在低分化腫瘤中表達(dá)較高；但Cbl-c表達(dá)與患者年齡、脈管侵犯、浸潤(rùn)深度、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及FIGO 分期均無關(guān)（P均＞0.05，表1）。

表1 c-Cbl、Cbl-b和Cbl-c表達(dá)與CSCC患者臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Relationship between expression levels of c-Cbl，Cbl-b，Cbl-c and clinicopathological features of CSCC specimens

圖1 Cbl蛋白家族在CSCC中的表達(dá)情況Figure 1 Expression of CBL protein family in CSCC

2.2 c-Cbl、Cbl-b 以及Cbl-c 表達(dá)與CSCC 患者預(yù)后的關(guān)系

至末次隨訪，中位隨訪時(shí)間106個(gè)月（24～155個(gè)月），隨訪期內(nèi)18 例患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展，16 例患者死亡。Kaplan-Meier 生存分析顯示：c-Cbl 高表達(dá)患者的無瘤生存期（disease free survival，DFS）和總生存期（overall survival，OS）比低表達(dá)患者延長(zhǎng)（P均＜0.05，圖2A、B）；Cbl-b以及Cbl-c表達(dá)與患者的DFS 和OS 均無關(guān)（P均＞0.05，圖2C～F）。Cox單因素回歸分析顯示：浸潤(rùn)深度（P=0.037）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.010）、FIGO 分期（P=0.010）以及c-Cbl 表達(dá)（P=0.022）與DFS相關(guān)；浸潤(rùn)深度（P=0.007）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.004）、FIGO 分期（P=0.004）以及c-Cbl表達(dá)（P=0.041）與OS相關(guān)。將單因素分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素納入Cox 多因素回歸分析，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是FIGO 分期的參考指標(biāo)之一，不再納入多因素分析。Cox多因素分析顯示：FIGO分期（P=0.048）以及c-Cbl表達(dá)（P=0.042）是影響DFS的獨(dú)立預(yù)后因素；FIGO 分期（P=0.034）是影響OS 的獨(dú)立預(yù)后因素；c-Cbl 表達(dá)是影響OS 的相關(guān)因素，但不是OS 的獨(dú)立預(yù)后因素（P=0.096，表2）。

圖2 CSCC中Cbl蛋白家族表達(dá)的Kaplan-Meier生存曲線Figure 2 Kaplan-Meier survival curves of patients with CSCC according to CBL protein family expression status

表2 Cox單因素和多因素回歸模型分析CSCC患者DFS和OSTable 2 Univariate and multivariate Cox regression analysis of prognostic factors for DFS and OS

3 討論

Cbl 蛋白是E3 大家族中的重要成員，由c-Cbl、Cbl-b和Cbl-c組成。Cbl家族3個(gè)成員均含有1個(gè)高度保守的N 端酪氨酸激酶結(jié)合（tyrosine kinasebinding，TKB）結(jié)構(gòu)域、1 個(gè)連接區(qū)（linker region）以及1 個(gè)環(huán)指（ring finger，RF）結(jié)構(gòu)域。TKB 結(jié)構(gòu)域由1 個(gè)四螺旋束、1 個(gè)鈣結(jié)合EF-hand 和1 個(gè)變體SH2結(jié)構(gòu)域組成，可介導(dǎo)Cbl 蛋白與底物上的磷酸化酪氨酸殘基之間的相互作用；RF結(jié)構(gòu)域具有E3活性，可介導(dǎo)泛素從E2轉(zhuǎn)移到底物；連接區(qū)含有保守的酪氨酸，對(duì)于調(diào)節(jié)E3 活性至關(guān)重要［6，10-11］。Cbl 家族3個(gè)成員的C端保守性較低，包含富含脯氨酸（proline-rich，PR）結(jié)構(gòu)域，可介導(dǎo)與SH3結(jié)構(gòu)域蛋白的相互作用。c-Cbl 與Cbl-b 結(jié)構(gòu)域幾乎相同，C 端均含有PR結(jié)構(gòu)域以及泛素相關(guān)（ubiquitin associated，UBA）結(jié)構(gòu)域。與c-Cbl 和Cbl-b 不同，Cbl-c 的C 端缺乏UBA 結(jié)構(gòu)域，且PR 結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度較短［5］。Cbl 蛋白的主要功能是調(diào)節(jié)受體和非受體酪氨酸激酶，該過程與免疫受體（T 細(xì)胞受體、B 細(xì)胞受體以及Fc 受體）信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。有研究報(bào)道，Cbl 蛋白可通過泛素化依賴的降解途徑負(fù)性調(diào)節(jié)受體和非受體酪氨酸激酶。正常情況下，Cbl 蛋白以非活性狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中，其催化RF 結(jié)構(gòu)域被N 端TKB 結(jié)構(gòu)域掩蓋。當(dāng)受到刺激時(shí)，Cbl 被招募到活化的受體酪氨酸激酶中，導(dǎo)致廣泛的酪氨酸磷酸化，誘導(dǎo)構(gòu)象變化以激活其E3活性［12］。

有研究報(bào)道，c-Cbl 和Cbl-b 可通過抑制CD8+T細(xì)胞的活化和自然殺傷細(xì)胞的免疫抑制功能阻斷免疫系統(tǒng)的抗腫瘤活性，從而加速腫瘤進(jìn)展［13］。在乳腺癌中，Cbl-b 可通過抑制Smad3 核轉(zhuǎn)位，抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)通路下游抑癌基因的轉(zhuǎn)錄，繼而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力［14］。有研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Cbl-b 可促進(jìn)Cbl-b 與胰島素樣生長(zhǎng)因子1 受體（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R）的相互作用，并誘導(dǎo)IGF-1R 的泛素化降解以及IGF-1R 信號(hào)失活，進(jìn)而抑制多藥耐藥胃癌和乳腺癌細(xì)胞的增殖［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，c-Cbl和Cbl-c在CSCC癌組織中的表達(dá)高于癌旁鱗狀上皮，與其作為原癌基因的身份相符，表明c-Cbl和Cbl-c在CSCC發(fā)生中可能起促進(jìn)作用。本研究未發(fā)現(xiàn)Cbl-b在癌和癌旁鱗狀上皮中的表達(dá)有顯著差異。目前研究認(rèn)為，Cbl 表達(dá)異常與腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)。因此，c-Cbl 和Cbl-c 在CSCC 癌組織中高表達(dá)可能介導(dǎo)CSCC 細(xì)胞增殖。Jing 等［16］報(bào)道，c-Cbl 在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中表達(dá)較高，且c-Cbl 表達(dá)與WHO 分級(jí)以及Karnofsky 功能狀態(tài)評(píng)分相關(guān)。Liu 等［17］報(bào)道，在乳腺癌中，Cbl-b 表達(dá)與激素受體以及HER2 狀態(tài)等無關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，c-Cbl在高～中分化以及最大徑＜4 cm腫瘤中表達(dá)較高；Cbl-b 在浸潤(rùn)深度＞2/3 纖維肌層患者中表達(dá)較高；Cbl-c在低分化腫瘤中表達(dá)較高。目前，關(guān)于Cbl蛋白對(duì)腫瘤預(yù)后價(jià)值的報(bào)道尚少。Luo 等［18］報(bào)道，在脊索瘤中，c-Cbl以及Cbl-b高表達(dá)患者的OS和無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）較低表達(dá)患者顯著縮短。而Kumaradevan 等［8］報(bào)道，c-Cbl高表達(dá)結(jié)直腸癌患者的OS 較低表達(dá)患者顯著延長(zhǎng)。Liu 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，Cbl-b 高表達(dá)乳腺癌患者的OS 和DFS 較低表達(dá)患者延長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)，c-Cbl高表達(dá)CSCC 患者比低表達(dá)患者的DFS 和OS 延長(zhǎng)（P均＜0.05）；Cox 單因素和多因素分析顯示：c-Cbl表達(dá)是影響DFS 的獨(dú)立預(yù)后因素；c-Cbl 表達(dá)是影響OS 的相關(guān)因素，但不是OS 的獨(dú)立預(yù)后因素。需要注意的是，“c-Cbl 在腫瘤組織中高表達(dá)”似乎與“c-Cbl 高表達(dá)患者預(yù)后好”不符。我們推測(cè)，在早期階段c-Cbl 作為原癌基因可促進(jìn)腫瘤發(fā)生，隨后c-Cbl 可能通過調(diào)控某些特定信號(hào)通路調(diào)控腫瘤發(fā)展，其具體機(jī)制有待后續(xù)深入研究。本研究未發(fā)現(xiàn)Cbl-b 和Cbl-c 表達(dá)與患者DFS 和OS 有顯著相關(guān)性（P均＞0.05）。因此，本研究提示，c-Cbl 可能成為CSCC 的重要預(yù)后預(yù)測(cè)因子，檢測(cè)c-Cbl 的表達(dá)狀態(tài)可為預(yù)測(cè)CSCC患者的預(yù)后提供參考。