孫學(xué)偉，何君花，姜新澤，何世軍，朱 磊，唐成亮，秦明珂，朱 進，楊 展*，吳玉龍*

1濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺 264003；2東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 南京 210002；3陸軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，重慶 400038；4東部戰(zhàn)區(qū)疾病預(yù)防控制中心傳染病防控二科，江蘇 南京 210002

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（enterotoxigenicEscherichia coli，ETEC）是引起腹瀉的主要致病菌之一［1］，嚴重威脅人體健康。目前臨床所用的藥物治療效果不佳且不良反應(yīng)多。益生菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群、減輕炎癥反應(yīng)等功能，可以緩解ETEC導(dǎo)致的腹瀉情況；但是不同益生菌治療ETEC所致腹瀉的具體機制并不清楚。

嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila，A.muciniphila）與宿主健康有著密切聯(lián)系，多項研究表明，A.muciniphila可以改善炎癥反應(yīng)和代謝綜合征的不良癥狀［2］，延緩代謝性疾病的發(fā)展進程［3］。因此，它也被認為是對宿主機體有益的潛在益生菌［4］。目前尚無關(guān)于A.muciniphila減緩ETEC 致小鼠腹瀉的具體研究。本研究采用灌胃方式給予小鼠A.muciniphila菌液連續(xù)5 d，之后同樣采取灌胃的方式給予ETEC菌液感染小鼠，觀察小鼠腹瀉情況，感染ETEC 后24 h 小鼠體內(nèi)炎癥因子的表達、腸道損傷情況和腸道菌群改變情況，探討A.muciniphila減輕ETEC致小鼠腹瀉的機制，為預(yù)防和減緩ETEC引起的腹瀉提供新的治療方案。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株A.muciniphila和ETEC 均來自中國工業(yè)微生物保藏中心（CICC）。4～6 周齡SPF 級C57BL/6 雄性小鼠24 只（北京斯貝福生物有限公司）。小鼠喂養(yǎng)在動物房，12 h 光照/12 h 黑暗循環(huán)，溫度控制在23 ℃，濕度控制在53%。本研究經(jīng)東部戰(zhàn)區(qū)疾病預(yù)防中心實驗動物倫理委員會審批（審批號2022015642），符合實驗室動物管理與使用準則。

1.2 方法

1.2.1A.muciniphila及ETEC的培養(yǎng)

A.muciniphila使用腦心浸液培養(yǎng)基（BD 公司，美國）培養(yǎng)，3.7 g/100 mL，高壓蒸汽滅絕法滅菌后，冷卻至55 ℃時向培養(yǎng)基中加入終濃度為6 g/L的蘇氨酸，37 ℃時加入A.muciniphila，使用厭氧箱進行培養(yǎng)48 h；ETEC 使用LB 培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫搖床中進行培養(yǎng)12 h。

1.2.2 腹瀉模型的構(gòu)建

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，通過ETEC的灌胃構(gòu)建腹瀉模型小鼠。培養(yǎng)ETEC 至吸光度為1.0，菌量約為1×109CFU/mL，直接灌胃小鼠。造模約12 h后觀察小鼠，造模成功的判斷標準為小鼠出現(xiàn)腹瀉、無力、厭食等癥狀。

1.2.3A.muciniphila對腹瀉模型小鼠的影響

將15只小鼠隨機分為3組，每組均為5只。PBS組，每天正常飲食；模型組，小鼠提前空腹6 h，之后灌胃ETEC 菌液，并在接下來24 h 內(nèi)觀察小鼠腹瀉情況、精神狀況；干預(yù)組，培養(yǎng)A.muciniphila至600 nm下吸光度約為1.0，菌量約為1×109CFU/mL。取菌液0.2 mL進行灌胃，連續(xù)灌胃5 d。之后小鼠空腹6 h，灌胃ETEC 菌液，接下來24 h 觀察小鼠腹瀉情況、精神狀況。造模結(jié)束后使用代謝籠收集各組小鼠糞便，頸椎脫臼處死小鼠收集結(jié)腸組織和血液。血液2 800 r/min 離心15 min，收集血清和部分結(jié)腸組織置于-80 ℃冰箱凍存。

1.2.4 腹瀉程度觀察

小鼠腹瀉程度的計算公式為：稀便率=一定時間內(nèi)所排稀便數(shù)/一定時間內(nèi)排便總數(shù)；腹瀉指數(shù)=稀便率×稀便級［5］。

1.2.5 ELISA檢測小鼠炎癥因子

取小鼠血清，按ELISA 試劑盒（RD 公司，美國）說明書檢測，使用酶標儀在450 nm 處測定吸光度，根據(jù)相應(yīng)標準曲線計算白細胞介素（interleukin，IL）-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6的含量。

1.2.6 qRT-PCR檢測小鼠結(jié)腸組織mRNA的表達

將凍存在-80 ℃冰箱的小鼠結(jié)腸組織取出，使用RNA 提取試劑盒（上海飛捷公司）從結(jié)腸組織中提取總RNA。各檢測指標的引物序列如下（表1）。使用PowerUp SYBR Green 試劑盒，反應(yīng)體系為2×SYBRGreenMasterMix10μL、ForwardPrimer2μL、Reverse Primer 2 μL、Template 2 μL、ddH2O 6 μL，用熒光定量PCR儀進行擴增。以β-actin為內(nèi)參，計算各mRNA相對表達水平。

表1 引物序列及名稱Table 1 Primer sequences and names

1.2.7 結(jié)腸組織病理切片觀察小鼠結(jié)腸組織的變化

造模結(jié)束后，將結(jié)腸取出并用PBS 沖洗掉結(jié)腸組織中的血液。之后使用4%多聚甲醛固定結(jié)腸組織，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片（4～5 μm）、二甲苯脫蠟、無水乙醇水合、HE染色固定，鏡下觀察結(jié)腸組織形態(tài)變化。

1.2.8 16S rRNA檢測小鼠腸道菌群的變化

將小鼠糞便從-80 ℃冰箱取出，用糞便DNA提取試劑盒（QIAamp公司，德國）提取小鼠糞便DNA，將糞便DNA標本進行16S rRNA基因V3～V4（341F～806R）區(qū)域的PCR 擴增。反應(yīng)體系包含2 × PCR Buffer 15 μL、上游引物1 μL（5 pmol/L）、下游引物1 μL（5 pmol/L）、模板DNA ≥1 μL（50 ng）、DNA Polymerase 0.6 μL（1.25 U/μL）、ddH2O補足至30 μL。PCR的反應(yīng)程序為94 ℃初始變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，26 個循環(huán)；72 ℃5 min。擴增產(chǎn)物使用磁珠純化，純化后的PCR 產(chǎn)物進行Illumina PE250 文庫構(gòu)建及測序。以上測序由上海歐易生物科技有限公司完成。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Prism 5.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用均數(shù)±標準差（）表示。使用單因素方差分析，用Newman-Keuls比較總差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ETEC感染后小鼠的表現(xiàn)

PBS組存活率為100%，而模型組24 h存活率明顯下降，僅為40%；干預(yù)組24 h 存活率是75%，與模型組相比，存活率明顯增加。感染ETEC 后小鼠表現(xiàn)出身體蜷縮成團、毛發(fā)光澤度降低、精神不振、行動遲緩、進食飲水頻率降低、大便稀疏、腹瀉情況增加等癥狀。干預(yù)組小鼠腹瀉率及腹瀉指數(shù)較模型組小鼠明顯降低（表2）。

表2 各組小鼠的腹瀉及存活情況Table 2 Diarrhea rate and survival rate of mice in each group

2.2 血清炎癥因子水平的變化

各組小鼠血清炎癥因子水平的檢測結(jié)果顯示，與PBS組相比，模型組小鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α濃度明顯升高，干預(yù)組較模型組IL-1β、IL-6 和TNF-α濃度明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 各組小鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平Figure 1 Levels of IL-Iβ，IL-6 and TNF-α in serum of mice in each group

2.3 結(jié)腸病理變化

小鼠結(jié)腸切片顯示，模型組結(jié)腸組織固有層腺體紊亂，杯狀細胞減少，并伴有炎性細胞浸潤，而干預(yù)組小鼠結(jié)腸組織內(nèi)黏膜肌層、固有層和黏膜柱狀上皮結(jié)構(gòu)完整，且結(jié)腸組織形態(tài)上與PBS 組沒有太大差異（圖2），說明A.muciniphila對小鼠的腸黏膜有一定的保護效果。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織的變化（×40）Figure 2 Changes in colon tissue of mice in each group（×40）

2.4 結(jié)腸組織炎癥因子mRNA表達的變化

與PBS組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織IL-1 mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA 水平顯著升高，而干預(yù)組小鼠各炎癥因子mRNA 水平較模型組小鼠明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

圖3 各組小鼠炎癥因子mRNA（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平的變化Figure 3 Changes of inflammatory factor mRNA（IL-1β，IL-6，TNF-α）levels of mice in each group

2.5 小鼠腸道菌群的變化

2.5.1 腸道菌群α多樣性指數(shù)

16S rRNA 腸道菌群高通量測序結(jié)果顯示模型組小鼠腸道菌群α多樣性明顯降低。與PBS 組相比，模型組小鼠菌群ACE 指數(shù)、Chao1 和Shannon 指數(shù)均明顯降低，而干預(yù)組小鼠明顯恢復(fù)了腸道菌群的α多樣性（圖4）。

圖4 各組小鼠腸道菌群α多樣性Figure 4 α Diversity of gut microbiota in each group mice

2.5.2 腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變

采用主坐標分析（PCoA）和非度量多維尺度分析（NMDS）確定PBS組、模型組以及干預(yù)組之間β多樣性的差異。結(jié)果顯示，PBS組、模型組和干預(yù)組之間腸道菌群區(qū)系存在顯著差異，PCoA分析和NMDS分型顯示各組小鼠之間均有明顯的聚類（圖5），表明A.muciniphila可以改變腸道微生物區(qū)系組成。

圖5 各組小鼠腸道菌群的β多樣性Figure 5 β Diversity of gut microbiota in each group mice

2.5.3A.muciniphila增加了腸道中有益菌的數(shù)量

分析各組小鼠門水平及屬水平細菌的組成，結(jié)果顯示模型組小鼠擬桿菌門與厚壁菌門的比例明顯增加，提示ETEC 使腸道菌群發(fā)生了改變。進一步分析各組小鼠腸道菌群中主要優(yōu)勢菌的數(shù)量，腸鼠桿菌（Muribaculaceae）、Mucispirillum、經(jīng)黏液真桿菌屬（Blautia）、擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）以及乳酸桿菌（Lactobacillus）在模型組小鼠中均明顯降低，而在干預(yù)組小鼠中的數(shù)量增加（圖6）。提示A.muciniphila可以增加其他有益菌的數(shù)量。

圖6 各組小鼠相關(guān)細菌的豐度Figure 6 Abundance of mouse related bacteria in each group

3 討論

ETEC 是一種常見的可以引起腹瀉的大腸桿菌，有研究發(fā)現(xiàn)其致病性與菌毛黏附素、耐熱腸毒素和不耐熱腸毒素有關(guān)［6-7］，但其致病的具體機制并不清楚。研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射ETEC K88能誘導(dǎo)雄性ICR小鼠的腸道炎癥，ETEC K88提高了小鼠回腸中部IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎細胞因子的表達［8-9］。另有研究發(fā)現(xiàn)ETEC降低了小鼠的體重和糞便水分含量，并破壞了空腸形態(tài)，且感染ETEC 后，小鼠空腸絨毛長度縮短，造成上皮糜爛［10-11］。本研究取小鼠結(jié)腸組織段檢測炎癥因子的表達，與之前的研究檢測腸段組織雖不同，但兩次炎癥因子檢測結(jié)果具有相似性。此外，本研究病理切片結(jié)果也顯示小鼠結(jié)腸部位有明顯的炎癥細胞浸潤、結(jié)腸黏膜發(fā)生紊亂等病理特征性反應(yīng)。

腸道菌群在維持人類健康中發(fā)揮著重要的作用，這些菌群與人體相互作用有利于食物的消化吸收、能量代謝，菌群的代謝產(chǎn)物有利于調(diào)節(jié)腸道局部和全身免疫應(yīng)答，阻止外來病原微生物的入侵，維持腸道穩(wěn)態(tài)［9］。有文獻報道腹瀉和營養(yǎng)不良均與腸道微生物菌群失調(diào)有關(guān)［12-13］。然而，腸道微生物菌群在ETEC 引起的腹瀉中的作用尚不清楚，通過16S rRNA菌群測序，本研究發(fā)現(xiàn)干預(yù)組與模型組小鼠的α多樣性明顯不同。提示給予小鼠A.muciniphila后可改善因ETEC引起的腸道菌群的α多樣性降低。此外，腸道菌群測序結(jié)果顯示Blautia、Alloprevotella、Mucispirillum、Muribaculaceae、Lactobacillus等體內(nèi)主要優(yōu)勢菌均發(fā)生了顯著變化。其中，Blautia作為腸道微生物區(qū)系的優(yōu)勢屬，在代謝性疾病、炎癥性疾病和生物轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著一定的作用［14］。Alloprevotella可以通過分解短鏈脂肪酸促進腸道分泌一種有助于控制機體血糖濃度的L 細胞，改善機體糖代謝紊亂［15］。有研究報道Lactobacillus能有效預(yù)防ETEC引起的腹瀉小鼠體重減輕和腸道損傷癥狀，減少炎癥因子的產(chǎn)生，增強腸道屏障功能［16］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)Lactobacillus對ETEC 感染性腹瀉的保護作用是通過多種途徑進行干預(yù)的，主要包括下調(diào)促炎細胞因子和上調(diào)抗炎細胞因子，增加水通道蛋白3（aquaporin3，AQP3），降低Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）和熱穩(wěn)定腸毒素（ST）的表達，調(diào)節(jié)腸道微生物菌群，增加短鏈脂肪酸的產(chǎn)生［17］。這些研究均強調(diào)Lactobacillus在緩解ETEC 引起的腹瀉方面可能起到有益的作用［18-19］，這些益生菌相對豐度的增加說明A.muciniphila可以通過增加其他益生菌的豐度，從而增加其益生作用，進而改善機體腸道損傷情況。

隨著近年來有關(guān)A.muciniphila的研究不斷增加，A.muciniphila已經(jīng)逐漸成為新的“明星益生菌”。這種潛在的益生菌可以在腸道細胞上進行定植［20］。A.muciniphila在寄主的代謝調(diào)節(jié)與免疫反應(yīng)中起著重要作用，且已被證明是一種有效的治療肥胖癥、2 型糖尿病、動脈粥樣硬化、自閉癥等相關(guān)胃腸功能障礙疾病的靶點［21］。A.muciniphila的主要代謝產(chǎn)物是短鏈脂肪酸，可以在結(jié)腸中被吸收，并作為結(jié)腸細胞的能量來源，它們還在各種類型的代謝紊亂中顯示出潛在的治療和抗炎作用［22-24］。Everard等［25］研究發(fā)現(xiàn)給予小鼠灌胃A.muciniphila后，小鼠體重和脂肪質(zhì)量增加得到減緩，血清甘油三酯和空腹血糖水平下降，胰島素敏感性增強。此外，口服A.muciniphila可以降低由高脂飲食引起的肥胖小鼠腸道屏障的通透性，嗜黏蛋白可使飼喂高脂飲食的肥胖小鼠和酒精性脂肪肝小鼠腸道內(nèi)層黏液厚度增加，增加杯狀細胞數(shù)量，上調(diào)緊密連接蛋白的表達，包括occludin、claudin、ZO-1、ZO-2和ZO-3［25-27］。

本實驗通過檢測炎癥因子的表達、病理切片的觀察以及16S rRNA 的腸道菌群測序可以觀察到A.muciniphila通過降低機體炎癥因子的表達以及增加腸道菌群中有益菌的豐度以減緩由ETEC引起的急性腹瀉。

本研究也存在一些不足，如選取的小鼠為6 周齡，有研究顯示A.muciniphila對不同年齡段宿主的代謝調(diào)節(jié)有不同的影響［28］，在此研究基礎(chǔ)上，應(yīng)繼續(xù)研究不同年齡段小鼠給予A.muciniphila后的腹瀉恢復(fù)情況。本研究只進行了動物實驗，并未進行細胞實驗，后續(xù)應(yīng)該進行體外實驗來驗證A.muciniphila對細胞水平的影響。

總的來說，本研究顯示A.muciniphila可以減輕由ETEC 引起的小鼠腹瀉。這為進一步研究益生菌對治療腸道炎癥提供了臨床參考。研究拓展了A.muciniphila的潛在益生功能，也為今后基于益生菌治療改善急性腹瀉提供了理論支撐。