駱長亮，張秋紅，孫林春

1蘇州大學附屬兒童醫(yī)院檢驗科，江蘇 蘇州 215000；2南京鼓樓醫(yī)院集團宿遷醫(yī)院檢驗科，江蘇 宿遷 223800；3南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院兒科研究所，江蘇 南京 210008

氧化應(yīng)激損傷是造成急性和慢性腎損傷的重要機制之一。人體正常的生物代謝會產(chǎn)生超氧陰離子自由基、過氧化氫等活性氧（reactive oxygen species，ROS），體內(nèi)完善的抗ROS 系統(tǒng)能及時將多余的ROS清除，較低水平的ROS對腎小管和微循環(huán)的生理調(diào)節(jié)有積極作用［1］；但是在受到各種病原體或炎癥因子刺激時，腎小管細胞中氧化還原狀態(tài)調(diào)控失衡，造成ROS 在腎組織蓄積、細胞膜損傷和超氧陰離子滲漏，最終導致腎損傷［2］。以氧化應(yīng)激為治療靶點已經(jīng)成為腎損傷治療的熱點。

Caspase-3 介導的線粒體途徑凋亡是經(jīng)典的細胞凋亡通路。有研究指出，氧化應(yīng)激損傷和caspase-3介導的線粒體途徑細胞凋亡存在關(guān)聯(lián)［3-4］。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，H2O2處理的人腎小管上皮細胞HK-2 中氧化應(yīng)激水平升高，細胞增殖受到抑制、細胞凋亡增多；而caspase-3抑制劑能降低H2O2處理后腎小管細胞ROS水平，對氧化應(yīng)激引起的細胞損傷有改善作用，說明腎小管上皮細胞的氧化應(yīng)激損傷具有caspase-3依賴性，抑制caspase-3途徑的細胞凋亡對ROS 引起的膿毒癥腎小管上皮細胞損傷有一定保護作用［5］。Kaleem 等［6］指出，caspase 的釋放受細胞中超氧陰離子濃度的調(diào)節(jié)。但是目前對腎小管上皮損傷中ROS 和caspase-3 途徑細胞凋亡的研究還較少，caspase-3 對ROS 的調(diào)控是直接起作用，還是引起了其他基因、蛋白或通路的變化？除了線粒體-caspase 途徑介導細胞凋亡，其他凋亡通路是否也參與其中？這些問題目前尚不清楚。

本研究擬利用芯片測序，對caspase-3抑制劑處理的氧化應(yīng)激狀態(tài)下腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)錄組進行分析，篩選caspase-3 抑制劑引起的差異表達基因（differentially expressed gene，DEG），對DEG進行GO分析和KEGG 富集分析，對篩選出的關(guān)鍵基因進行生物學驗證，深入探討和揭示caspase-3調(diào)控ROS損傷腎小管上皮細胞的機制。

1 材料和方法

1.1 材料

人腎小管上皮細胞HK-2（上海中科院典型培養(yǎng)物保藏中心）。Ac-DEVD-CHO（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、VigoFect 轉(zhuǎn)染試劑盒（北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司）、TRIzol 試劑盒（TaKaRa 公司，日本）、SuperReal PreMix Plus（北京天根生化科技有限公司）、MTT試劑盒（南京建成生物工程研究所）、細胞凋亡試劑盒（BD公司，美國）、Western blot 一抗（ABI 公司，美國）、Western blot 二抗（上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司）。熒光定量PCR 儀（ABI 公司，美國）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國），流式細胞儀（Beckman公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 芯片樣本制備

本研究利用H2O2誘導HK-2細胞建立氧化應(yīng)激狀態(tài)，通過酶生化法檢測HK-2 細胞內(nèi)的抗氧化指標的含量：超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和丙二醛（malonic dialdehyde，MDA），驗證模型是否成功。將對數(shù)生長期的人腎小管上皮細胞HK-2 接種在直徑90 mm的細胞培養(yǎng)皿，用終濃度為300 μmol/L 的H2O2處理6 h 后，隨機分為對照組（不做處理）和caspase-3抑制劑組（Ac-DEVD-CHO，15 μmol/L），各組設(shè)置3個獨立樣本，將樣本送公司完成測序及分析。

1.2.2 DEG的篩選

本次所用測序平臺為Illumina Hiseq 2500，100PE。用R 軟件Affy 包（Version：R3.4.0）的RMA法通過質(zhì)控標準過濾去除原始數(shù)據(jù)中的接頭序列、低質(zhì)量數(shù)據(jù)和未檢出堿基等無效數(shù)據(jù)，得到有效數(shù)據(jù)；將原始圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)。用R語言的Limma 包［7］分析各組基因表達，采用隨機方差t檢驗篩選差異基因，計算P值并多重檢驗進行校正，將校正后的P值由小到大排列，同時滿足|log2FC（fold change）|≥2 和校正P值＜0.05 的基因為差異表達基因。用完全鏈接聚類法（completelinkage clustering）對差異基因進行聚類分析，用pheatmap 包繪制熱圖，用ggplot2包做火山圖。

1.2.3 GO分析和KEGG通路富集分析

用DAVID數(shù)據(jù)庫［8］對篩選出的DEG進行GO通路［9］和KEGG通路［10］富集分析。當通路上的差異基因數(shù)＞2個，且矯正后的P＜0.05時，認為富集結(jié)果有統(tǒng)計學意義。

1.2.4 候選基因的定量PCR驗證

用TRIzol 試劑盒提取各組細胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，以其為模板，用熒光定量PCR 儀，用SuperReal PreMix Plus 進行定量PCR 反應(yīng)，20 μL 總體系中包含2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.6 μL，50×ROX Reference DyeⅡ2 μL，cDNA 2 μL，用滅菌去離子水補足體積。定量PCR 引物序列見表1。擴增程序為：95 ℃15 min；95 ℃10 s，55 ℃30 s，72 ℃32 s，共進行36 個循環(huán)；4 ℃10 min。以5 批獨立cDNA 為模板，每組設(shè)3 個復(fù)孔，以GAPDH 為內(nèi)參基因。根據(jù)內(nèi)參基因和候選基因的CT值，用ΔΔCT法進行基因表達的相對定量分析。

表1 定量PCR引物序列Table 1 Quantitative PCR primer sequences

1.2.5 CTNNB1表達載體轉(zhuǎn)染HK-2細胞

將HK-2 細胞接種到6 孔板中，以鋪滿板底40%密度為宜，用終濃度為300 μmol/L 的H2O2處理6 h 后，將細胞隨機分組：對照組（不做處理）、caspase-3 抑制劑組（Ac-DEVD-CHO，15 μmol/L）、CTNNB1 組［pcDNA3.1（+）-CTNNB1］、caspase-3 抑制劑+CTNNB1 組［Ac-DEVD-CHO，15 μmol/L+pcDNA3.1（+）-CTNNB1］以及caspase-3抑制劑+CTNNB1 NC 組［Ac-DEVD-CHO，15 μmol/L+pcDNA3.1（+）-CTNNB1 NC］。轉(zhuǎn)染前1 h更換新鮮培養(yǎng)基，用VigoFect轉(zhuǎn)染試劑盒，根據(jù)操作說明進行轉(zhuǎn)染，將細胞放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)，6 h后更換新鮮完全培養(yǎng)基。48 h后收集細胞檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.2.6 細胞增殖和凋亡檢測

將HK-2 細胞按1×103個/孔接種到96 孔板，根據(jù)不同分組給予相應(yīng)處理，在第0 h 和第48 h，向每孔各加入20 μL MTT 溶液，放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，取出用酶標儀檢測490 nm 的吸光度，換算成存活率，并以時間為橫坐標，存活率為縱坐標繪制細胞生長曲線。將HK-2 細胞制成1×105個/mL 懸液，并加入100 μL 至流式管中，分別加入20 μL Annexin-FITC 和PI 染料，避光孵育20 min 后，加入500 μL PBS，用渦旋儀震蕩混勻后，流式細胞儀檢測凋亡細胞百分數(shù)。

1.2.7 Western blot檢測

胰蛋白酶消化并收集各組HK-2 細胞，提取總蛋白，用BCA 蛋白定量后，加入1×上樣緩沖液煮沸蛋白5 min。先用80 V 恒壓電泳20 min，再120 V恒壓電泳90 min；用硝酸纖維素薄膜90 V 恒壓轉(zhuǎn)膜120 min。用5%脫脂奶粉封閉蛋白膜2 h，分別用1∶1 000稀釋的一抗4 ℃孵育過夜和用1∶500稀釋的二抗溶液室溫孵育45 min；洗膜后，用顯影劑顯影并用凝膠成像系統(tǒng)記錄分析蛋白條帶。

1.2.8 細胞ROS檢測胰蛋白酶消化并收集各組HK-2 細胞，將細胞制成1×105個/mL的單細胞懸液，向流式細胞管中加入100 μL 細胞懸液，再加入5 μmol/L DHE，室溫避光孵育30 min，用PBS 洗滌后，流式細胞儀檢測ROS。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析用SPSS 17.0軟件，服從正態(tài)分布的計量資料統(tǒng)一表示為均數(shù)±標準差（），兩組間比較用獨立樣本t檢驗，多組間比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 H2O2干預(yù)后HK-2 細胞SOD、CAT 和MDA 的表達變化

由圖1可見，H2O2處理后的HK-2細胞的SOD和CAT 水平分別為（23.07±1.62）kU/g 和（1.28±0.10）kU/g，較正常HK-2 細胞的SOD 和CAT 水平降低（P＜0.05），MDA 水平為（33.18±2.16）μmol/g，較正常HK-2 細胞升高（P＜0.05），說明H2O2干預(yù)成功誘導了細胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

圖1 H2O2干預(yù)后HK-2細胞SOD、CAT和MDA水平Figure 1 SOD，CAT and MDA levels of HK-2 cells after H2O2 intervention

2.2 差異基因篩選

統(tǒng)計結(jié)果如圖2 所示，在對照組和caspase-3 抑制劑組中共篩選出185 個DEG，聚類熱圖和火山圖見圖2A、B。篩選出的顯著性最高的前10位差異表達基因依次為FIS1、SOX18、EZR、SPARC、COL7A1、SNRPB、RPL5、MAP4、CEBPB和CTNNB1。

圖2 差異基因的聚類熱圖和火山圖Figure 2 Clustering heatmap and volcano map of DEG

2.3 差異基因的GO通路和KEGG通路富集分析

GO 注釋表明，DEG 的功能主要集中在細胞成分的形態(tài)發(fā)生、胚胎器官形態(tài)發(fā)生、細胞內(nèi)受體介導的通路、線粒體形態(tài)發(fā)生等生物學過程（biological process，BP），微管組織中心、細胞外基質(zhì)成分、膠原蛋白三聚體、核糖核蛋白復(fù)合物等細胞組分（cell constitutes，CC），以及結(jié)構(gòu)分子活性、氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性等分子功能（molecule function，MF）（表2）。KEGG通路富集分析顯著性排名前5的條目包括RAC1 信號通路、RNA 代謝通路、RhoA 信號通路、糖尿病途徑和細胞蛋白的凋亡裂解通路（表3）。

表2 排名前10的GO通路名稱Table 2 The top 10 GO entries

表3 排名前5的KEGG通路名稱Table 3 The top 5 KEGG pathway entries

2.4 候選基因的定量PCR驗證

由圖3可見，顯著性排名前10的DEG中，F(xiàn)IS1、EZR、COL7A1、RPL5、MAP4、CEBPB 和CTNNB1 mRNA 在對照組細胞中高表達（P均＜0.05），SNRPB mRNA 在對照組細胞中低表達（P＜0.05），與芯片結(jié)果一致。

圖3 定量PCR驗證候選基因的表達Figure 3 Quantitative PCR to verify the expression of candidate genes

2.5 CTNNB1 對caspase-3 抑制劑處理的氧化應(yīng)激狀態(tài)HK-2細胞增殖和凋亡的影響

由圖4A 可見，對照組、caspase-3 抑制劑組、CTNNB1組、caspase-3抑制劑+CTNNB1組和caspase-3抑制劑+CTNNB1 NC 組的細胞增殖率為分別（125.20±5.24）%、（166.21±3.85）%、（116.43±3.08）%、（140.27±7.31）%和（170.45±8.23）%。結(jié)果顯示，caspase-3 抑制劑組增殖率高于對照組（P＜0.05）；CTNNB1 組增殖率低于對照組（P＜0.05），caspase-3抑制劑+CTNNB1 組增殖率較caspase-3 抑制劑組低（P＜0.05），但仍高于對照組（P＜0.05）。

Caspase-3抑制劑組cleaved-caspase-3和cleaved-PARP 蛋白水平低于對照組（P＜0.05）；CTNNB1 組cleaved-caspase-3 和cleaved-PARP 蛋白水平高于對照 組（P＜0.05）；caspase-3 抑制劑+CTNNB1 組cleaved-caspase-3 和cleaved-PARP 蛋白水平均較caspase-3 抑制劑組高（P＜0.05），但低于對照組（P＜0.05）。對照組、caspase-3 抑制劑組、CTNNB1組、caspase-3 抑制劑+CTNNB1 組和caspase-3 抑制劑+CTNNB1 NC 組細胞的凋亡率分別為（16.35±2.45）%、（7.21±0.98）%、（22.24±1.21）%、（12.17±1.67）%和（6.90±0.48）%。caspase-3 抑制劑組凋亡率低于對照組（P＜0.05），CTNNB1 組凋亡率高于對照組（P＜0.05）；caspase-3 抑制劑+CTNNB1 組凋亡率高于caspase-3 組（P＜0.05），但低于對照組（P＜0.05，圖4B、C）。

圖4 各組細胞增殖和凋亡檢測Figure 4 Detection of proliferation and apoptosis in each group

2.6 CTNNB1 對caspase-3 抑制劑處理的氧化應(yīng)激狀態(tài)HK-2細胞ROS的影響

由圖5可見，對照組、caspase-3抑制劑組、CTNNB1 組、caspase-3 抑制劑+CTNNB1 組和caspase-3抑制劑+CTNNB1 NC 組細胞中ROS 平均熒光強度分別為1 615±112、1 212±69、1 798±85、1 476±101和1 179±76。caspase-3 抑制劑組ROS 水平較對照組降低（P＜0.05），CTNNB1組ROS水平較對照組升高（P＜0.05），caspase-3 抑制劑+CTNNB1 組細胞中ROS 水平較caspase-3 抑制劑組高（P＜0.05），但仍高于對照組（P＜0.05）。

圖5 各組細胞ROS檢測Figure 5 Detection of ROS in each group

3 討論

我們在對照組和caspase-3 抑制劑組中共篩選到185 個DEG，可見無論在caspase-3 抑制劑處理還是氧化應(yīng)激狀態(tài)下，腎小管上皮細胞內(nèi)時刻都在發(fā)生著大量復(fù)雜的生物學事件。KEGG 分析主要富集到的有RAC1 信號通路、RNA 代謝通路、RhoA 信號通路、糖尿病途徑和細胞蛋白的凋亡裂解通路。CTNNB1 基因的編碼產(chǎn)物——β-連環(huán)蛋白（β-catenin）是經(jīng)典Wnt 信號通路的核心組分，Wnt/β-catenin 通路是一條非常重要的信號通路，在人類諸多生理活動和病理過程中都有廣泛的調(diào)節(jié)作用。在結(jié)腸癌中，活化caspase-3 能特異性降解β-catenin，抑制Wnt/β-catenin 通路誘導的細胞凋亡［11］；而抑制Wnt/β-catenin 通路信號能加速H2O2誘導的成纖維細胞凋亡［12］。

H2O2誘導ROS依賴的信號轉(zhuǎn)導能抑制β-catenin下游轉(zhuǎn)錄因子的活性［13］。在惡性腫瘤中存在β-catenin 信號轉(zhuǎn)導和ROS 積累的復(fù)雜相互作用?？梢姡?catenin 和氧化應(yīng)激存在關(guān)聯(lián)。β-catenin 參與了RAC1信號通路和RhoA信號通路，過度激活的RACl 參與了氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)過程，而RhoA通路也能激活Nox4，通過產(chǎn)生ROS 產(chǎn)物引起氧化應(yīng)激，都從側(cè)面印證了β-catenin 與氧化應(yīng)激的關(guān)系。Wnt/β-catenin 通路與腎臟疾病的關(guān)系已經(jīng)有大量研究，Zhou 等［14］報道Wnt/β-catenin 能將氧化應(yīng)激與腎足細胞損傷和蛋白尿聯(lián)系起來。考慮到Wnt/β-catenin 通路在人類疾病中的重要作用、β-catenin 與氧化應(yīng)激的關(guān)系，以及芯片和定量PCR結(jié)果都證實了其在H2O2處理的HK-2細胞中異常表達，提示β-catenin可能參與氧化應(yīng)激狀態(tài)下腎小管細胞損傷，值得更多研究。

我們關(guān)注的重點是β-catenin 對ROS 和線粒體途徑的細胞凋亡之間的調(diào)控。用Ac-DEVD-CHO聯(lián)合H2O2處理HK-2 細胞，細胞中ROS 水平較對照組降低，提示H2O2誘導的氧化應(yīng)激具有一定的caspase-3依賴性，抑制caspase-3能部分減弱HK-2細胞的氧化應(yīng)激損傷。細胞生物行為檢測顯示，caspase-3抑制劑聯(lián)合H2O2處理的HK-2細胞增殖率較對照組升高，凋亡率降低，且凋亡蛋白水平降低，說明氧化應(yīng)激對腎小管細胞增殖和凋亡的作用具有caspase-3依賴性，caspase-3抑制劑能逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激對腎小管細胞的增殖和凋亡的效應(yīng)。用CTNNB1表達載體轉(zhuǎn)染細胞后，caspase-3抑制劑+CTNNB1組細胞增殖率較caspase-3 抑制劑組低（P＜0.05），說明β-catenin對caspase-3抑制劑促進氧化應(yīng)激狀態(tài)下腎小管上皮細胞增殖有抑制作用；而細胞凋亡率高于caspase-3抑制劑組，β-catenin能部分抵消caspase-3抑制劑對氧化應(yīng)激狀態(tài)下腎小管上皮細胞凋亡的抑制作用。caspase-3 抑制劑+CTNNB1 組細胞的ROS 水平較caspase-3 抑制劑組高（P＜0.05），表明caspase-3抑制劑能降低H2O2誘導的HK-2 細胞氧化應(yīng)激水平，而β-catenin 對這一效應(yīng)有一定逆轉(zhuǎn)作用。我們也觀察到，caspase-3抑制劑+CTNNB1組細胞的增殖能力減弱，而凋亡增強，但與對照組相比仍有差異，提示除了β-catenin，caspase-3 途徑對氧化應(yīng)激狀態(tài)下腎小管上皮的效應(yīng)可能還有其他作用途徑。

除了CTNNB1，我們還篩選到了其他一些基因可能與caspase-3途徑調(diào)控ROS，參與氧化應(yīng)激所致腎小管上皮損傷有關(guān)。線粒體分裂蛋白1（mitochondrial fission protein 1，F(xiàn)IS1）主要調(diào)控線粒體融合蛋白和視神經(jīng)萎縮蛋白。FIS1 主要定位在細胞線粒體外膜，能促進線粒體分裂，抑制線粒體融合，造成動力學平衡破壞，形成小球或小泡狀的異常形態(tài)結(jié)構(gòu)，線粒體嵴不清或消失，導致細胞的線粒體受損；呼吸鏈斷裂會導致鈣離子內(nèi)流和氧自由基形成，加重氧化應(yīng)激損傷［15］。降低大鼠肺泡巨噬細胞中線粒體的FIS1 水平，能抑制內(nèi)毒素所致的肺泡內(nèi)巨噬細胞凋亡，減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)［16］。雖然目前尚未見FIS1 在腎小管上皮氧化應(yīng)激的研究，但以上結(jié)果都提示FIS1 與氧化應(yīng)激狀態(tài)下的腎小管上皮細胞損傷有關(guān)。EZR基因編碼埃茲蛋白Ezrin，主要參與細胞骨架重組、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，并與細胞存活、黏附、遷移等有關(guān)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中有重要作用［17］。目前尚未見EZR 與氧化應(yīng)激或腎小管損傷的相關(guān)報道。有研究報道，糖體蛋白L5（ribosomal protein L5，RPL5）突變與先天性純紅細胞再生障礙性貧血有關(guān)，并會增加癌癥的發(fā)病風險［18］。小核核糖核蛋白肽B 和B1（small nuclear ribonucleoprotein polypeptides B and B1，SNRPB），負責參與對前mRNA 的選擇性剪接，通過剪接復(fù)合體的核心成分，調(diào)控細胞的增殖、凋亡和活性［19］。選擇性剪接能參與基因調(diào)控、細胞分化和內(nèi)環(huán)境平衡等，導致肌萎縮等的發(fā)生，其與腫瘤的關(guān)系受到較多關(guān)注，但是RPL5 和SNRPB 在膿毒癥腎損傷或與氧化應(yīng)激之間的關(guān)系均未見報道。微管相關(guān)蛋白4（microtubule-associated protein 4，MAP4）的C-末端的微管結(jié)合域磷酸化對細胞周期有重要的調(diào)控作用［20］。近來一些研究發(fā)現(xiàn)，MAP4 與腫瘤的過程有關(guān)［21-22］，但與腎小管氧化應(yīng)激損傷無報道。轉(zhuǎn)錄因子CCAAT 增強結(jié)合蛋白β（CCAAT enhancer-binding protein β，CEBPB）在多種人類實體腫瘤和血液腫瘤中表達異常，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［23-25］。CEBPB主要通過對胞外信號分子產(chǎn)生應(yīng)答，進而實現(xiàn)對靶基因水平的調(diào)節(jié)，是一種對細胞增殖、分化、凋亡、周期等過程有調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子；還參與炎癥、能量代謝等過程［26-27］。但目前也未見與氧化應(yīng)激的報道。這些新的差異基因的篩選和鑒定為后續(xù)深入探討caspase-3 調(diào)控ROS 損傷腎小管上皮細胞的機制提供目標靶點。

綜合以上，本研究通過基因芯片，篩選到185個在H2O2處理的腎小管上皮細胞和caspase-3 抑制劑結(jié)合H2O2處理的腎小管上皮細胞中差異表達的基因，對顯著性排名前10 的基因進行定量PCR 驗證，證實了FIS1、EZR、COL7A1、RPL5、MAP4、CEBPB、CTNNB1 和SNRPB mRNA 表達水平與芯片結(jié)果一致。利用CTNNB1 表達載體轉(zhuǎn)染細胞，結(jié)合細胞生物學行為分析，證明了氧化應(yīng)激對腎小管細胞的增殖和凋亡的作用具有caspase-3 依賴性，而CTNNB1可能參與了caspase-3 依賴的氧化應(yīng)激對腎小管上皮細胞的損傷作用。