田 禎，莊皓冉，江楚雯，尹 靖，韋曉瑩，張枝林，史 琳，張 育，沈維干

揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225000

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見(jiàn)的原發(fā)性肝癌，全球每年HCC 患者死亡人數(shù)超過(guò)80 萬(wàn)［1］。HCC 的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多步驟的過(guò)程，涉及眾多基因和相關(guān)信號(hào)通路。研究表明，Hippo 信號(hào)通路中的上游因子通過(guò)一系列激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)轉(zhuǎn)錄激活下游終末效應(yīng)分子Yes 相關(guān)蛋白（yes-associated protein，YAP）和具有PDZ 結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共活化因子（transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ），進(jìn)而調(diào)控下游影響細(xì)胞增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）以及腫瘤轉(zhuǎn)移等相關(guān)基因的表達(dá)，從而在肝癌的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［2］。真核細(xì)胞翻譯延伸因子1α（EEF1A）的兩個(gè)亞型EEF1A1和EEF1A2，通過(guò)促進(jìn)氨?；鵷RNA 與核糖體A 位點(diǎn)的結(jié)合，在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中對(duì)新生多肽的延伸發(fā)揮重要作用［3］。EEF1A1 為廣泛表達(dá)的蛋白，而EEF1A2 的表達(dá)具有組織特異性。研究發(fā)現(xiàn)，EEF1A2 在多種腫瘤（包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌等）中高表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［3-4］；EEF1A2 在肝癌組織中高表達(dá)，并可通過(guò)EEF1A2/PI3K/AKT 信號(hào)軸調(diào)控肝癌的發(fā)生和發(fā)展［5-6］，但是有關(guān)EEF1A2 在肝癌發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的作用方式及其機(jī)制仍然有待進(jìn)一步研究。研究發(fā)現(xiàn)YAP在肝癌組織中高表達(dá)，并與肝癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［7-9］，然而，目前尚不清楚YAP 能否通過(guò)調(diào)控EEF1A2的表達(dá)影響肝癌的發(fā)生和發(fā)展。

本研究通過(guò)YAP 和EEF1A2 干擾表達(dá)和過(guò)表達(dá)，建立不同遷移能力的肝癌細(xì)胞模型，闡明YAP通過(guò)調(diào)控EEF1A2促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC7721、Hep3B、HCCLM3、SK-HEP1 和HEK293T 細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清（Gibco 公司，美國(guó)）；100×青霉素/鏈霉素雙抗、RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量檢測(cè)試劑盒、蛋白上樣緩沖液、超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（蘇州新賽美生物公司）；pLent-U6-Puro載體（ViGene Biosciences 公司，美國(guó)）；pMD2.G 和psPAX2（Addgene 公司，美國(guó)）；TRIzol（Invitrogen 公司，美國(guó)）；Lenti-Pac慢病毒包裝試劑盒（GeneCopoeia公司，美國(guó)）；Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室（Corning公司，美國(guó)）；HiScript Q RT SuperMix for qPCR 和AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（南京諾唯贊生物公司）；兔抗人EEF1A2 多克隆抗體（上海愛(ài)必信生物公司）；小鼠抗人E-Cadherin 單克隆抗體（BD 公司，美國(guó)）；兔抗人YAP/TAZ、YAP、Snail 單克隆抗體以及HRP標(biāo)記的抗兔IgG和抗小鼠IgG以及染色質(zhì)靶向酶切檢測(cè)（cleavage under targets and release using nuclease，CUT&RUN）試劑盒（CST公司，美國(guó)）；小鼠抗GAPDH 單克隆抗體（上海康成生物公司）；表達(dá)YAP 的腺病毒、表達(dá)EEF1A2 的腺病毒以及對(duì)照腺病毒（山東維真生物科技有限公司）；靶向YAP、EEF1A2 的寡核苷酸引物、對(duì)照引物以及定量PCR引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

所有細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM 高塘培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 慢病毒載體的構(gòu)建、包裝和穩(wěn)定株的篩選

合成靶向YAP（正義鏈序列5′-GATCCGCTGGTCAGAGATACTTCTTAATTCAAGAGATTAGAAGTATCTCTGACCAGCTTTTTTA-3′；反義鏈序列5′-CGCGTAAAAAAGCTGGTCAGAGATACTTCTTAATCTCTTGAATTAAGAAGTATCTCTGACCGCG-3′）和EEF1A2（正義鏈序列5′-GATCCTTCACCTCCCAGGTCATCATCCTCGAGGATGATGACCTGGGAGGTGAATTTTTA-3′；反義鏈序列5′-CGCGTAAAAATTCACCTCCCAGGTCATCATCCTCGAGGATGATGACCTGGGAGGTGAAG-3′）的寡核苷酸引物以及對(duì)照引物（正義鏈序列5′-GATCCTGGTTTACATGTCGACTAATTCAAGAGATTAGTCGACATGTAAACCATTTTTTA-3′；反義鏈序列：5′-CGCGTAAAAAATGGTTTACATGTCGACTAATCTCTTGAATTAGTCGACATGTAAACCACG-3′）；分別克隆到pLent-U6-Puro 載體的BamHⅠ和MluⅠ位點(diǎn)間，經(jīng)測(cè)序成功后，與pMD2.G和psPAX2 共轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞進(jìn)行慢病毒的包裝，轉(zhuǎn)染60 h 后收集細(xì)胞上清并用0.45 μm 的濾器過(guò)濾；使用慢病毒液分別感染SMMC7721 和SK-HEP1肝癌細(xì)胞后，采用嘌呤霉素篩選14 d獲得穩(wěn)定細(xì)胞株。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR（real-time quantitative PCR，RTqPCR）檢測(cè)相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平

TRIzol 試劑盒提取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞的總RNA 后，采用HiScript Q RT SuperMix for qPCR試劑盒和AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 試劑盒分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qPCR。qPCR反應(yīng)條件：95 ℃5 min 預(yù)變性；95 ℃10 s，60 ℃34 s，40 個(gè)循環(huán)。EEF1A2 的上游引物序列為5′-GGACCATTGAGAA GTTCGAGA-3′，下游引物序列為5′-AGCACCCAGGCATACTTGAA-3′；Snail 的上游引物序列為5′-AATCGGAAGCCTAACTACAGCG-3′，下游引物序列為5′-GT CCCAGATGAGCATTGGCA-3′；E-cadherin的上游引物序列為5′-CAAGTGACC ACCTTAGAG-3′，下游引物序列為5′-GAATTTGCAATCCTGCTT-3′；GAPDH 上游引物序列為5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物序列為5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。使用LightCycler?96 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以GAPDH為內(nèi)參，按照2-ΔΔCt方法計(jì)算出目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 Western blot檢測(cè)相關(guān)基因的蛋白表達(dá)水平

采用RIPA 裂解液提取各組細(xì)胞中的總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量、變性后進(jìn)行SDS-PAGE，樣品轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，采用5%的脫脂奶粉封閉后與相應(yīng)的一抗于4 ℃孵育過(guò)夜；加入相應(yīng)二抗室溫孵育后，滴加ECL 發(fā)光液，于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀成像。

1.2.5 細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)按文獻(xiàn)［10］的方法進(jìn)行，簡(jiǎn)要過(guò)程如下：選擇血清饑餓過(guò)夜后的各組細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液；細(xì)胞計(jì)數(shù)后，用不含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基將SMMC-7721 細(xì)胞調(diào)整為1.5×105個(gè)/mL，SK-HEP1細(xì)胞調(diào)整為1.0×105個(gè)/mL；分別取200 μL 的上述細(xì)胞懸液接種到預(yù)先鋪有Matrigel 或未鋪Matrigel的Transwell 小室中，然后將Transwell 小室放入含600 μL完全培養(yǎng)基的Transwell下室中，于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出Transwell 小室置于4%多聚甲醛固定液中室溫固定后，用棉簽拭去小室內(nèi)側(cè)的細(xì)胞，采用結(jié)晶紫染液染色遷移和侵襲的細(xì)胞，于倒置相差顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 CUT&RUN-qPCR實(shí)驗(yàn)

CUT&RUN 試劑盒為美國(guó)CST 公司產(chǎn)品，按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)操作。簡(jiǎn)要過(guò)程如下：SMMC7721 細(xì)胞與磁珠孵育后，加入兔抗人YAP單克隆抗體與細(xì)胞中YAP 結(jié)合，與二抗孵育后加入Protein A/G-Tn5 轉(zhuǎn)座體與抗體結(jié)合后，再加入Mg2+激活轉(zhuǎn)座體，使得DNA 片段化，提取DNA 進(jìn)行qPCR 驗(yàn)證，qPCR 上游引物序列為5′-CATGGTGCGCCCAGGAG-3′，下游引物序列為5′-GGCCTCAGGGTGGAAATCTG-3′。分別計(jì)算YAP 抗體和IgG 富集后擴(kuò)增的DNA 占輸入染色質(zhì)的比值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用YAP 抗體富集的DNA 與IgG 富集的DNA 的倍數(shù)表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用軟件SPSS19.0和Excel 2013對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 YAP和EEF1A2對(duì)不同遷移能力的肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

通過(guò)查閱癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//gepia.cancerpku.cn/index.html）分析EEF1A2 在肝癌組織以及癌旁組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示EEF1A2 在肝癌組織中的mRNA 水平顯著高于癌旁組織（P＜0.01，圖1A）。Western blot 法檢測(cè)不同遷移能力的肝癌細(xì)胞系（低遷移能力的HepG2、SMMC7721 和Hep3B 細(xì)胞系以及高遷移能力的HCCLM3和SK-HEP1細(xì)胞系）中YAP/TAZ和EEF1A2 的表達(dá)，結(jié)果顯示YAP/TAZ 和EEF1A2在高遷移能力的肝癌細(xì)胞HCCLM3 和SK-HEP1 中的表達(dá)均高于低遷移能力的肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC7721 和Hep3B（圖1B），該結(jié)果表明YAP/TAZ 和EEF1A2 的表達(dá)可能與肝癌細(xì)胞的遷移能力相關(guān)。

為了研究YAP和EEF1A2對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響，本研究制備干擾YAP 表達(dá)和干擾EEF1A2 表達(dá)的重組慢病毒以及對(duì)照慢病毒，分別感染低遷移能力的SMMC-7721 細(xì)胞和高遷移能力的SK-HEP1細(xì)胞，采用嘌呤霉素篩選2周后，建立了穩(wěn)定干擾表達(dá)細(xì)胞模型；其次，通過(guò)在SMMC7721和SK-HEP1 細(xì)胞中分別感染表達(dá)YAP、EEF1A2 的腺病毒，構(gòu)建了YAP 和EEF1A2 過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞模型；采用Western blot 方法進(jìn)行基因表達(dá)鑒定，結(jié)果如圖1C、D 可見(jiàn)，與干擾對(duì)照組（NC1）相比，敲低YAP（KD-YAP）和EEF1A2（KD-EEF1A2）均顯著降低SMMC-7721 細(xì)胞和SK-HEP1 細(xì)胞中YAP 和EEF1A2 表達(dá)；與過(guò)表達(dá)對(duì)照組（NC2）相比，過(guò)表達(dá)YAP（OE-YAP）和EEF1A2（OE-EEF1A2）均顯著上調(diào)細(xì)胞中YAP 和EEF1A2 表達(dá)。該結(jié)果表明，本研究成功建立了YAP和EEF1A2干擾和過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞模型，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

圖1 EEF1A2和YAP在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)Figure 1 Expression of EEF1A2 and YAP in HCC cell lines

基于YAP和EEF1A2在肝癌中高表達(dá)［5-9］，本研究進(jìn)一步利用Transwell 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)觀察干擾YAP 和EEF1A2 表達(dá)對(duì)低遷移能力的SMMC7721細(xì)胞和高遷移能力的SK-HEP1細(xì)胞遷移和侵襲的影響。結(jié)果顯示，與各自對(duì)照組細(xì)胞相比，干擾YAP 表達(dá)和干擾EEF1A2 表達(dá)均可以顯著抑制SMMC7721 細(xì)胞和SK-HEP1 細(xì)胞的遷移和侵襲（圖2A、B，YAP 干擾表達(dá)細(xì)胞與各自對(duì)照組遷移和侵襲的相對(duì)細(xì)胞比例：SMMC7721 細(xì)胞為0.663 ± 0.110vs.1.002 ± 0.067 和0.603 ± 0.156vs.1.004 ± 0.117；SK-HEP1 細(xì)胞為0.665 ± 0.153vs.1.003 ± 0.094 和0.637 ± 0.147vs.1.007 ± 0.125。干擾EEF1A2表達(dá)細(xì)胞與各自對(duì)照組遷移和侵襲的相對(duì)細(xì)胞比例：SMMC7721 細(xì)胞為0.563 ± 0.131vs.1.006 ± 0.088 和0.561 ± 0.102vs.1.004 ± 0.065；SK-HEP1 細(xì)胞為0.549 ± 0.132vs.1.002 ± 0.117 和0.479 ± 0.162vs.1.001 ± 0.127；P＜0.05）。該結(jié)果表明，YAP 和EEF1A2 在肝癌細(xì)胞遷移和侵襲過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

圖2 干擾YAP和EEF1A2表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響Figure 2 Effect of YAP and EEF1A2 knockdown on the migration and invasion of HCC cells

2.2 YAP 對(duì)肝癌細(xì)胞中EEF1A2 及EMT 相關(guān)基因表達(dá)的影響

本課題組前期建立了Hippo通路下游效應(yīng)分子YAP 和TAZ 干擾表達(dá)的SMMC7721 細(xì)胞模型，并通過(guò)RNA 測(cè)序（RNA-sequencing，RNA-seq）對(duì)干擾YAP、TAZ 和空載對(duì)照的SMMC7721 細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析［11］。本研究進(jìn)而對(duì)干擾YAP 和TAZ 所得的差異表達(dá)基因取交集，發(fā)現(xiàn)有432個(gè)重疊基因（圖3A）；基因功能富集分析顯示，這些重疊基因參與調(diào)控細(xì)胞遷移、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞增殖（圖3B），其中包括EEF1A2 以及與EMT 相關(guān)的SNAIL 和CDH1 等。為了證實(shí)YAP對(duì)EEF1A2、SNAIL和CDH1表達(dá)的影響，我們首先采用RT-qPCR 驗(yàn)證了YAP 對(duì)SMMC7721 細(xì)胞中EEF1A2、Snail（SNAIL 的表達(dá)產(chǎn)物）和E-cadherin（E-CAD，CDH1的表達(dá)產(chǎn)物）mRNA水平的影響，檢測(cè)結(jié)果與RNA-seq結(jié)果相一致，YAP干擾表達(dá)可以下調(diào)EEF1A2 和Snail 的mRNA 水平，上調(diào)E-CAD 的mRNA 水平（圖3C，YAP 干擾和過(guò)表達(dá)的SMMC7721 細(xì)胞與各自對(duì)照組細(xì)胞中EEF1A2、E-cadherin 和Snail 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量：EEF1A2為0.521±0.150vs.1.001±0.083和1.482±0.182vs.1.053 ± 0.093；E-cadherin 為1.651 ± 0.192vs.1.002 ± 0.113 和0.522 ± 0.202vs.1.113±0.103；Snail為0.581 ± 0.173vs.1.013±0.103 和1.723±0.282vs.1.016 ± 0.073，P＜0.05）；其次，應(yīng)用建立的YAP 干擾和過(guò)表達(dá)的SMMC-7721 和SK-HEP1 肝癌細(xì)胞模型，通過(guò)Western blot 方法檢測(cè)了YAP 干擾和過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞中EEF1A2、Snail 以及E-CAD 蛋白表達(dá)水平的影響，檢測(cè)結(jié)果與RT-qPCR 驗(yàn)證結(jié)果相一致，干擾YAP 表達(dá)可以下調(diào)EEF1A2 和Snail，上調(diào)E-CAD，而YAP 過(guò)表達(dá)則可以上調(diào)EEF1A2 和Snail，下調(diào)E-CAD（圖3D、E）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，YAP可以調(diào)控肝癌細(xì)胞中EEF1A2的表達(dá)。為了探究YAP 是否通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控EEF1A2 的表達(dá)，進(jìn)一步開(kāi)展了CUT&RUN 結(jié)合qPCR 實(shí)驗(yàn)，由圖3F 可見(jiàn)，EEF1A2基因的啟動(dòng)子序列可以被抗YAP的單克隆抗體富集（細(xì)胞中EEF1A2 啟動(dòng)子的Anti-YAP 與IgG的相對(duì)富集量為6.501±1.250vs.1.001±0.101，P＜0.01），該結(jié)果證實(shí)YAP 可以與EEF1A2 基因的啟動(dòng)子序列結(jié)合，促進(jìn)EEF1A2的表達(dá)。此外，本研究進(jìn)一步采用Western blot 方法檢測(cè)了EEF1A2 干擾和過(guò)表達(dá)對(duì)SMMC-7721 和SK-HEP1 細(xì)胞中EMT相關(guān)的Snail 和E-CAD 表達(dá)的影響，結(jié)果顯示干擾EEF1A2 可以下調(diào)細(xì)胞中Snail、上調(diào)E-CAD 的水平，而EEF1A2 過(guò)表達(dá)則可以上調(diào)細(xì)胞中Snail、下調(diào)E-CAD（圖3G、H），該結(jié)果表明EEF1A2可以調(diào)控肝癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程。

圖3 YAP可以調(diào)控肝癌細(xì)胞中EEF1A2的表達(dá)Figure 3 YAP regulated the expression of EEF1A2 in HCC cells

2.3 YAP通過(guò)EEF1A2調(diào)控肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲

為了研究YAP是否可以通過(guò)促進(jìn)EEF1A2表達(dá)進(jìn)一步調(diào)控肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲，本研究分別在干擾YAP 表達(dá)的SMMC7721 和SK-HEP1 細(xì)胞中 聯(lián)合過(guò)表達(dá)EEF1A2、在YAP 過(guò)表達(dá)的SMMC7721 和SK-HEP1 細(xì)胞中聯(lián)合干擾EEF1A2 表達(dá)后，利用Transwell 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)觀察了細(xì)胞遷移和侵襲能力的改變。Transwell 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖4 可見(jiàn)，與干擾YAP 表達(dá)細(xì)胞組相比，EEF1A2 過(guò)表達(dá)可以顯著促進(jìn)干擾YAP 表達(dá)的SMMC-7721和SK-HEP1細(xì)胞的遷移和侵襲（在干擾YAP表達(dá)的細(xì)胞中過(guò)表達(dá)EEF1A2與干擾YAP表達(dá)細(xì)胞組遷移和侵襲的相對(duì)細(xì)胞比例：SMMC7721 細(xì)胞為1.450±0.181vs.1.002±0.112 和1.374±0.224vs.1.004 ± 0.059；SK-HEP1 細(xì)胞為1.411 ± 0.157vs.1.003 ± 0.101 和1.419 ± 0.224vs.1.001 ± 0.105；與YAP 過(guò)表達(dá)細(xì)胞組相比，干擾EEF1A2 表達(dá)可以顯著抑制YAP 過(guò)表達(dá)的SMMC-7721 和SK-HEP1 細(xì)胞的遷移和侵襲（在過(guò)表達(dá)YAP 的細(xì)胞中干擾EEF1A2表達(dá)后與YAP過(guò)表達(dá)細(xì)胞組遷移和侵襲的相對(duì)細(xì)胞比例：SMMC7721 細(xì)胞為1.246 ± 0.133vs.1.519 ± 0.221 和1.312 ± 0.163vs.1.538 ± 0.201；SK-HEP1 細(xì)胞為1.318 ± 0.155vs.1.631 ± 0.213 和1.250 ± 0.217vs.1.683 ± 0.211，P＜0.05）。該研究結(jié)果提示YAP可以通過(guò)上調(diào)EEF1A2而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

圖4 YAP通過(guò)EEF1A2調(diào)控肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲Figure 4 YAP regulated the migration and invasion of HCC cells through EEF1A2

3 討論

人類(lèi)的EEF1A主要通過(guò)與氨?；鵷RNA結(jié)合并將其攜帶到核糖體上，在蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程中對(duì)新生多肽的延伸發(fā)揮重要調(diào)控作用。在EEF1A 的兩個(gè)亞型中，EEF1A1 在人類(lèi)組織中廣泛表達(dá)，而EEF1A2 表達(dá)僅限于心臟、骨骼肌、大腦等組織，具有明顯的組織特異性［12］。人類(lèi)的EEF1A2基因定位于20q13，研究表明，EEF1A2 在卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌以及肝癌等多種腫瘤中高表達(dá)，并與這些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及患者的生存期密切相關(guān)［3-6，13-15］。盡管有研究顯示，EEF1A2可以通過(guò)激活PI3K/AKT 信號(hào)通路，調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重塑，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，并證實(shí)EEF1A2/PI3K/AKT 信號(hào)軸在肝癌的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［4-6］，但是有關(guān)EEF1A2 的自身表達(dá)調(diào)控以及相關(guān)作用機(jī)制尚不明確。

本研究首先通過(guò)查閱TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)，分析了EEF1A2 在肝癌以及癌旁組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示EEF1A2 在肝癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，提示EEF1A2可能參與調(diào)控肝癌的發(fā)生和發(fā)展。其次，本研究采用Western blot方法檢測(cè)了不同遷移能力的肝癌細(xì)胞系（低遷移能力的HepG2、SMMC7721和Hep3B 以及高遷移能力的HCCLM3 和SK-HEP1細(xì)胞）中YAP和EEF1A2的表達(dá)差異，結(jié)果顯示YAP和EEF1A2在高遷移能力的肝癌細(xì)胞中表達(dá)高于低遷移能力的肝癌細(xì)胞，提示YAP 和EEF1A2 的表達(dá)可能與肝癌細(xì)胞的遷移能力相關(guān)。有關(guān)YAP 干擾表達(dá)和過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲影響的研究已經(jīng)有相當(dāng)多研究報(bào)道［16-20］，本研究重點(diǎn)圍繞YAP能否通過(guò)調(diào)控EEF1A2的表達(dá)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲開(kāi)展了進(jìn)一步探究?；赮AP和EEF1A2在肝癌組織中高表達(dá)［5-9］，本研究首先選擇低遷移能力的肝癌細(xì)胞SMMC-7721 和高遷移能力的肝癌細(xì)胞SK-HEP1為研究對(duì)象，建立了慢病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定敲低YAP 和敲低EEF1A2 的細(xì)胞模型，采用Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)了干擾YAP 和EEF1A2 表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響，結(jié)果表明干擾YAP和EEF1A2表達(dá)均可以顯著降低肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

課題組前期分別建立了穩(wěn)定敲低YAP 和敲低TAZ 的SMMC7721 細(xì)胞模型，采用RNA-seq 分析了敲低YAP和敲低TAZ的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄組的改變，通過(guò)對(duì)二者差異表達(dá)基因取交集，發(fā)現(xiàn)兩組差異表達(dá)基因的重疊基因中，除了已經(jīng)被證明受YAP/TAZ調(diào)控的與EMT 相關(guān)的Snail 和E-CAD 外［11，16，21］，還包括EEF1A2。本研究采用RT-qPCR和Western blot方法檢測(cè)顯示、干擾YAP表達(dá)可以下調(diào)EEF1A2，而YAP過(guò)表達(dá)則可以上調(diào)EEF1A2，提示YAP 可以調(diào)控EEF1A2 的表達(dá)?；贖ippo 通路的下游效應(yīng)分子YAP 作為轉(zhuǎn)錄共活化因子可以調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［19，22］，本研究進(jìn)一步利用CUT&RUN-qPCR 實(shí)驗(yàn)證實(shí)了YAP 可以與EEF1A2 基因的啟動(dòng)子序列結(jié)合。CUT&RUN 實(shí)驗(yàn)主要用于驗(yàn)證及探尋特定蛋白質(zhì)和DNA 的特定序列的直接相互作用，應(yīng)用于研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及組蛋白修飾調(diào)控。與傳統(tǒng)的染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（chromatin immunoprecipitation，ChIP）相比，該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在所需要的細(xì)胞樣品量低、無(wú)需交聯(lián)、超聲打斷、背景信號(hào)低和重復(fù)性好等，近年來(lái)已經(jīng)被研究者廣泛使用［23］。上述研究結(jié)果表明，YAP可以通過(guò)與EEF1A2 的啟動(dòng)子結(jié)合而調(diào)控EEF1A2 的表達(dá)。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示，EEF1A2 可以上調(diào)SMMC-7721 和SK-HEP1 細(xì)胞中EMT 相關(guān)的Snail、下調(diào)E-CAD，該結(jié)果提示EEF1A2 可能通過(guò)調(diào)控肝癌細(xì)胞中EMT 相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。為了探究YAP 能否通過(guò)調(diào)控EEF1A2 的表達(dá)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲，本研究通過(guò)在YAP 干擾和過(guò)表達(dá)的SMMC7721 和SK-HEP1肝癌細(xì)胞中分別聯(lián)合過(guò)表達(dá)EEF1A2或干擾EEF1A2 表達(dá)后，采用Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞遷移和侵襲的改變，明確了YAP 可以通過(guò)EEF1A2促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，EEF1A2在肝癌組織中高表達(dá)，YAP 和EEF1A2 與肝癌細(xì)胞的遷移能力相關(guān)；YAP 可以與EEF1A2 基因的啟動(dòng)子序列結(jié)合，調(diào)控EEF1A2的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。本研究結(jié)果可以進(jìn)一步完善我們對(duì)YAP 和EEF1A2 參與肝癌轉(zhuǎn)移調(diào)控的理解，有可能為抗肝癌轉(zhuǎn)移提供新的治療靶標(biāo)。