耿佳偉，費(fèi)小明*，湯 郁，李海璐，王麗霞

1江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院血液科，2風(fēng)濕科，江蘇 鎮(zhèn)江 212000

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種漿細(xì)胞惡性腫瘤，在其發(fā)生和發(fā)展過程中，骨髓瘤細(xì)胞與骨髓微環(huán)境的相互作用起到非常重要的作用［1-2］。成骨細(xì)胞作為為骨髓微環(huán)境中的重要細(xì)胞成分之一，在MM中可出現(xiàn)明顯的異常［3］。MM患者成骨細(xì)胞的成骨活性下降，而破骨細(xì)胞活性亢進(jìn)是骨髓瘤患者骨骼病變的核心機(jī)制［4-6］。此外，如何糾正MM 患者的成骨細(xì)胞功能障礙，也是MM 領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。多西環(huán)素（doxycycline，DOX）是一種臨床上常用于抗菌治療的抗生素。本課題組先前發(fā)現(xiàn)DOX在體外有抗骨髓瘤細(xì)胞增殖的作用［7-8］。鑒于骨髓微環(huán)境中的成骨細(xì)胞在MM 中的重要作用，本研究擬探索DOX在體外對(duì)成骨細(xì)胞株MC3T3-E1成骨分化的影響及相應(yīng)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠前成骨細(xì)胞系（MC3T3-E1 細(xì)胞，中科院上海細(xì)胞庫）；α-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）（Gibco公司，美國）；多西環(huán)素（Sigma 公司，美國）；MEK 抑制劑U0126（MCE 公司，美國）；CCK-8試劑盒（同仁公司，日本）；PCR 引物（上海生工生物公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green 試劑盒（Takara 公司，日本）；引物委托上海生工生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。引物序列如下：OCN-F 5′-TGACGAGTTGGCTGACCA-3′，OCN-R 5′-AGGGTGCCTGGAGAGGAG-3′；Runx2-F 5′-TTGACCTTTGTCCCAATGC-3′，Runx2-R 5′-AGGTTGGAGGCACACATAGG-3′；β-actin-F 5′-CCTGGCACCCAGACAAAT-3′，β-actin-R 5′-GGGCCGGACTCGTCATAC-3′。兔抗人p-ERK1/2抗體、兔抗人p-MEK抗體、兔抗人GAPDH抗體等（CST公司，美國）；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、蛋白上樣緩沖液（5×）、預(yù)染Marker（杭州碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理

MC3T3-E1細(xì)胞用含有10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用于實(shí)驗(yàn)的DOX 濃度為5、10、20、40 mg/L，U0126 濃度為5、10 μmol/L。

1.2.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖

在96孔板中每孔接種50 μL的細(xì)胞懸液（1×105個(gè)/mL），將DOX 用培養(yǎng)液配制成所需的濃度，實(shí)驗(yàn)組孔加入50 μL藥物；對(duì)照組加入50 μL培養(yǎng)液。在渦旋振蕩器上輕輕搖勻，置于37 ℃培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)1、2、3 d后，取出96孔板，在每孔中加入10 μL CCK-8試劑，避光孵育約1 h，酶標(biāo)儀測(cè)量在450 nm波長處的吸光值并記錄。

1.2.3 Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)

收集細(xì)胞，于冰上裂解，提取總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。配制分離膠以及濃縮膠，按每個(gè)加樣孔約30 μg 蛋白量上樣。電泳后轉(zhuǎn)膜到孔徑為0.45 μm的PVDF膜上，封閉后將膜放入相應(yīng)的一抗中，在4 ℃環(huán)境中搖床孵育過夜。洗膜、搖床上孵育二抗，孵育結(jié)束洗膜、曝光。用Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.2.4 茜素紅染色檢測(cè)成骨

當(dāng)培養(yǎng)的MC3T3-E1 細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，消化并調(diào)整細(xì)胞濃度1×104個(gè)/mL 接種至12 孔板中的無菌爬片上，每孔培養(yǎng)體系為1 mL。培養(yǎng)過夜后，不同組別更換培養(yǎng)基，每孔加入1 mL 相應(yīng)培養(yǎng)基。設(shè)置陰性對(duì)照組（含完全培養(yǎng)基）、誘導(dǎo)組（成骨誘導(dǎo)液）、實(shí)驗(yàn)組（含DOX的成骨誘導(dǎo)液）。每3 d更換新鮮的各組培養(yǎng)基。誘導(dǎo)14、21 d時(shí)，經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min，茜素紅染色檢測(cè)成骨，日常光線下標(biāo)本拍照、倒置顯微鏡下鏡檢。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）檢測(cè)基因表達(dá)

收集細(xì)胞，冰上裂解，用TRIzol 提取細(xì)胞總RNA，酶標(biāo)儀上測(cè)定濃度。按照試劑盒說明配制逆轉(zhuǎn)錄體系，在PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；轉(zhuǎn)錄完后，將合成的cDNA 放在冰上冷卻。按SYBR Green 試劑盒說明書在冰上配制20 μL 反應(yīng)體系，加入8 連管中，在儀器中反應(yīng)，最后進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)分析用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行操作；用Image J軟件計(jì)算蛋白及茜素紅染色灰度值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，數(shù)據(jù)資料符合正態(tài)分布（S-W 檢驗(yàn)），用單因素方差分析方法對(duì)各實(shí)驗(yàn)組組間進(jìn)行兩兩比較（Dunnett-t檢驗(yàn)）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度DOX 對(duì)前成骨細(xì)胞MC3T3-E1 細(xì)胞增殖的影響

取生長狀態(tài)良好的MC3T3-E1 細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)分組處理1、2、3 d，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，5～40 mg/L 的DOX 對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞增殖沒有明顯的抑制作用（圖1）。

圖1 CCK-8法檢測(cè)DOX對(duì)前成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖的影響Figure 1 Effect of DOX on the proliferation of preosteoblastic MC3T3-E1 by CCK-8 assay

2.2 茜素紅染色檢測(cè)DOX 對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞成骨分化的影響

圖2 MC3T3-E1細(xì)胞成骨誘導(dǎo)14、21 d后茜素紅染色Figure 2 Alizarin red staining of MC3T3-E1 cells after osteogenic induction for 14，21 days

2.3 qPCR 檢測(cè)DOX 對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞相關(guān)成骨基因的影響

MC3T3-E1 細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)21 d 后，提取總RNA 后利用qPCR 檢測(cè)相關(guān)成骨基因OCN、Runx2的相對(duì)表達(dá)量。與陰性對(duì)照組對(duì)比，誘導(dǎo)組及10 mg/L DOX實(shí)驗(yàn)組，相關(guān)成骨基因均上調(diào)，說明成骨誘導(dǎo)成功，但誘導(dǎo)組與實(shí)驗(yàn)組間比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3），這提示在成骨誘導(dǎo)的21 d，有DOX與無DOX組的OCN和Runx2的mRNA水平無差異。

圖3 成骨誘導(dǎo)21 d后qPCR檢測(cè)相關(guān)成骨基因相對(duì)表達(dá)量Figure 3 Detection of osteogenic gene levels via qRCR after 21 days of osteogenic induction

2.4 DOX處理MC3T3-E1細(xì)胞后，N-cadherin、p-MEK、p-ERK蛋白的表達(dá)情況

用5、10 mg/L 的DOX 分別處理MC3T3-E1 細(xì)胞2 d，Western blot 法檢測(cè)N-cadherin 蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，不同濃度DOX 處理MC3T3-E1細(xì)胞2 d后，其N-cadherin蛋白表達(dá)下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4A）。結(jié)合DOX對(duì)細(xì)胞增殖和蛋白表達(dá)的影響，后續(xù)的成骨及Western blot 實(shí)驗(yàn)DOX 濃度均選用10 mg/L。隨后Western blot 法檢測(cè)p-MEK、p-ERK 蛋白水平后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，10 mg/L DOX處理2 d后p-MEK、p-ERK 蛋白表達(dá)上調(diào)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4B、C）。

圖4 不同濃度的DOX處理MC3T3-E1細(xì)胞2 d后Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況Figure 4 MC3T3-E1 cells were treated with different concentrations of DOX for 2 days and the expression of the indicated proteins was detected by Western blot

2.5 MEK 抑制劑U0126 處理MC3T3-E1 細(xì)胞，檢測(cè)N-cadherin蛋白及相關(guān)通路蛋白的表達(dá)情況

為了進(jìn)一步探究DOX 是否對(duì)MEK/ ERK 通路產(chǎn)生影響。用濃度為5、10 μmol/L的MEK的抑制劑U0126處理MC3T3-E1細(xì)胞2 d后，Western blot 檢測(cè)N-cadherin、p-ERK、p-MEK表達(dá)量。與對(duì)照組比較，不同濃度U0126 處理2 d 后N-cadherin 蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05，圖5A）；與此同時(shí)，p-MEK、p-ERK 蛋白表達(dá)下降，但5 μmol/L 的U0126 對(duì)p-ERK 的抑制作用更明顯（P＜0.05，圖5B、C），故后續(xù)實(shí)驗(yàn)U0126選用5 μmol/L。

圖5 用U0126處理MC3T3-E1細(xì)胞后Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況Figure 5 MC3T3-E1 cells were treated with U0126 for 2 days and the expression of the indicated proteins was detected by Western blot

2.6 U0126 聯(lián)合DOX 處理MC3T3-E1 細(xì)胞，檢測(cè)相關(guān)目的蛋白的表達(dá)情況

用5 μmol/L U0126聯(lián)合10 mg/L DOX處理MC3T3-E1細(xì)胞2 d，Western blot 法檢測(cè)N-cadherin、p-MEK 和p-ERK 蛋白的表達(dá)。與DOX 單獨(dú)處理組比較，聯(lián)合處理組N-cadherin 水平較DOX 單獨(dú)處理組升高，且聯(lián)合處理組p-MEK及p-ERK蛋白表達(dá)較單獨(dú)處理組降低（圖6）。

圖6 Western blot檢測(cè)U0126聯(lián)合DOX處理的MC3T3-E1細(xì)胞中相關(guān)目的蛋白表達(dá)Figure 6 Expression of the indicated proteins was detected by Western blot in MC3T3-E1 cells treated with U0126 combination with DOX

2.7 U0126 聯(lián)合DOX 處理MC3T3-E1 細(xì)胞，茜素紅檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的變化

隨后的實(shí)驗(yàn)探索使用U0126 抑制MEK/ERK 通路對(duì)DOX促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的作用有何影響。實(shí)驗(yàn)共分為5組：①陰性對(duì)照組，②陽性成骨對(duì)照組，③DOX 處理組，④U0126處理組，⑤DOX 聯(lián)合U0126 處理組。成骨誘導(dǎo)21 d 后，陽性成骨組出現(xiàn)較多的紅色鈣結(jié)節(jié)，成不規(guī)則片狀或散在分布；DOX+U0126 組，紅染率低于DOX 處理組，但高于U0126 處理組（P＜0.05，圖7）。這一結(jié)果提示，MEK/ERK 通路參與MC3T3-E1 細(xì)胞成骨分化的調(diào)節(jié)，而DOX通過MEK/ERK通路來調(diào)節(jié)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化。

圖7 茜素紅染色評(píng)估DOX聯(lián)合U0126處理對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的影響Figure 7 The effect of DOX and U0126 on osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells by alizarin red stain

3 討論

在MM 細(xì)胞與骨骼微環(huán)境的相互作用過程中，腫瘤細(xì)胞可引起微環(huán)境中多種細(xì)胞和非細(xì)胞成分異常，其中成骨細(xì)胞成骨功能和分化的受損尤其明顯［2，10］。即使MM患者經(jīng)有效治療后，成骨細(xì)胞等的異常仍然存在，并且這些異常與MM 細(xì)胞的耐藥和復(fù)發(fā)密切相關(guān)［4，6，11］。因此，成骨細(xì)胞的異常，不但與MM骨骼病變相關(guān)，也與MM細(xì)胞的生存、耐藥等有密切關(guān)系。正因?yàn)槿绱?，MM 骨骼病變的機(jī)制和干預(yù)方法是MM基礎(chǔ)和臨床研究的重要方向。

本研究結(jié)果提示DOX 促進(jìn)前成骨細(xì)胞株MC3T3-E1的體外成骨分化，并且對(duì)其N-cadherin的表達(dá)也有影響。既往研究報(bào)道DOX 有一定的抗實(shí)體腫瘤、抑制血管生成等作用［12-13］。另外，也有研究報(bào)道DOX 促進(jìn)人和大鼠成骨細(xì)胞的增生和礦物質(zhì)沉積，有正性成骨作用［14-15］，這與本研究結(jié)果類似。除了作用成骨細(xì)胞，DOX還可以通過其他機(jī)制來影響骨骼生成。例如動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DOX可以抑制基質(zhì)金屬蛋白酶，減輕骨關(guān)節(jié)炎［16］。此外，DOX 可以抑制大鼠的破骨細(xì)胞活性，有助于減少破骨細(xì)胞溶骨亢進(jìn)引起骨骼破壞［17］。在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移時(shí)，DOX可以抑制轉(zhuǎn)移灶局部破骨細(xì)胞活性及數(shù)量，改善溶骨性病變［18］。上述結(jié)果提示，DOX可以通過多種機(jī)制阻止骨骼破壞，是一個(gè)潛在的治療MM 骨骼病變的藥物。

Gomes 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，DOX 可以作用于Wnt 信號(hào)通路，進(jìn)而影響成骨細(xì)胞的分化。而本研究發(fā)現(xiàn)，DOX 也可通過MEK/ERK 信號(hào)通路影響MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，MEK/ERK信號(hào)通路參與成骨細(xì)胞的成骨分化的調(diào)節(jié)［19-21］，這與本研究觀察到DOX對(duì)MEK/ERK信號(hào)通路的影響及茜素紅染色的結(jié)果相一致。除了參與成骨分化調(diào)節(jié)之外，有研究報(bào)道MEK/ERK 信號(hào)通路對(duì)成骨細(xì)胞的黏附、遷移等細(xì)胞行為也有調(diào)節(jié)作用［22］。本研究還發(fā)現(xiàn)，DOX 可以下調(diào)MC3T3-E1 細(xì)胞株N-cadherin的表達(dá)，并且MEK/ERK 信號(hào)通路參與DOX 對(duì)N-cadherin 下調(diào)的作用。既往研究報(bào)道N-cadherin可以與Wnt受體結(jié)合，競爭性抑制Wnt/β-Catenin信號(hào)通路的激活，干擾成骨細(xì)胞的成骨分化［23］。有意思的是，N-cadherin 表達(dá)變化后，反過來還會(huì)對(duì)PI3K/Akt、MEK/ERK 和Wnt/β-catenin 信號(hào)通路產(chǎn)生影響［24-25］。所以，上述研究提示DOX處理MC3T3-E1細(xì)胞株后，可以通過MEK/ERK 通路下調(diào)N-cadherin表達(dá)，而N-cadherin水平變化后，反過來也可能參與對(duì)MEK/ERK信號(hào)通路的上調(diào)作用。

綜上所述，本研究以MC3T3-E1 細(xì)胞株為對(duì)象證實(shí)，DOX 可以促進(jìn)其成骨分化，并且下調(diào)其N-cadherin 蛋白水平。另外初步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，MEK/ERK 信號(hào)通路在DOX 對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞株成骨分化和N-cadherin 表達(dá)的影響中起到重要作用。這提示DOX不僅可以直接殺傷MM細(xì)胞［7-8］，還可能同時(shí)通過對(duì)骨微環(huán)境中成骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用影響MM的病理生理過程。DOX對(duì)骨微環(huán)境的影響有待進(jìn)一步深入研究。