楊慧， 姜潤秋， 郭睿， 時雨， 喬純， 錢思軒， 李建勇， 仇海榮

(1. 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科，江蘇 南京 210029； 2. 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210008)

急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)以 t(15;17)(q24;q21)易位形成PML-RARα融合基因為特征[1]，具有該融合基因的APL患者對全反式維甲酸及三氧化二砷均敏感，獨(dú)特的生物學(xué)和臨床特征使其成為急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)中一類高治愈性亞型。據(jù)報道，有98%的APL通過t(15;17)(q24;q21)平衡或插入易位形成PML-RARα融合基因，1%～2%的APL病例通過涉及RARα的其他融合表現(xiàn)為少見的APL亞型[2-3]。本研究報道3例臨床熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)檢測中容易漏診的一類少見隱匿插入易位APL病例，并對比4家不同公司基因探針對此型異常的檢測能力。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取3例經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)綜合診斷為APL的罕見插入PML-RARα易位患者。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審查，3例患者均已簽署知情同意書。

1.2 常規(guī)染色體核型分析

取骨髓液采用短期培養(yǎng)法制備染色體并采用R顯帶技術(shù)進(jìn)行核型分析。染色體異常按照《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN2016)》的相關(guān)規(guī)定識別和描述。

1.3 FISH檢測PML-RARα融合基因

雙色雙融合PML-RARα探針分別購自美國Abbott公司、英國Cytocell公司、武漢康錄公司、廣州安必平公司。除安必平探針采用紅色標(biāo)記RARα基因，綠色標(biāo)記PML基因外，其余探針均為紅色標(biāo)記PML基因，綠色標(biāo)記RARα基因。Abbott探針跨越大小為515 kb的PML基因座和大小為700 kb的RARα基因座。在Cytocell探針中，PML基因座和RARα基因座大小分別為325 kb和331 kb。安必平探針跨越的基因座是最大的，其PML基因座大小為578 kb，RARα基因座大小為1 000 kb。康錄探針跨越大小為330 kb的PML基因座和大小為320 kb的RARα基因座。FISH檢測步驟根據(jù)制造商提供的方案進(jìn)行，至少計數(shù)300個間期細(xì)胞。正常細(xì)胞信號為兩紅兩綠(2R2G)；出現(xiàn)黃色融合信號(F)表明發(fā)生易位，超過閾值(≥3%)，則判定PML-RARα融合基因檢測陽性，典型信號模式為一紅一綠兩融合(1R1G2F)。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測

對骨髓涂片進(jìn)行瑞氏染色、過氧化物酶染色和高碘酸-希夫染色，并在顯微鏡下檢查細(xì)胞形態(tài)。對于過氧化物酶染色，陽性結(jié)果是細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕色和黑色顆粒。對于高碘酸-希夫染色，細(xì)胞質(zhì)染成紅色表示陽性反應(yīng)，陽性反應(yīng)物呈顆粒狀、塊狀或彌漫性。

1.5 RT-PCR檢測PML-RARα融合基因

從骨髓樣本中分離細(xì)胞并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案提取總RNA。PML-RARα熒光定量PCR檢測采用基因擴(kuò)增儀StepOnePlusTMRT-PCR系統(tǒng)(美國ABI公司)，反應(yīng)體系包括8 μL反應(yīng)液和12 μL RNA，反應(yīng)條件：42 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min；共40個循環(huán)。擴(kuò)增曲線在40個循環(huán)前超過閾值被認(rèn)為PML-RARα融合基因為陽性。為進(jìn)一步量化樣本并了解實(shí)驗效率，使用1×103、1×104、1×105和1×106拷貝的ABL基因參考制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 免疫表型分析

通過流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)檢測新鮮的骨髓樣本，至少分析50 000個細(xì)胞。本研究所使用的抗體包括CD34、CD117、HLA-DR、CD13、CD33、CD11b、CD15、CD19、CD58、CD10、CD20、CD22、CD81、CD66c、CD38、CD64、CD14、CD56、CD11c、cMPO、cCD3、cCD79a、CD2、CD5、CD7、CD3、CD8、CD4、CD45。陰性對照采用相應(yīng)的同型對照抗體，陽性細(xì)胞群≥20%被定義為陽性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)及免疫表型特征

3例APL患者白血病細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征和免疫表型模式均較典型。經(jīng)瑞氏染色可見異常早幼粒細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)充滿大量的紫色顆粒，胞質(zhì)內(nèi)外部顏色不同，細(xì)胞核形狀不規(guī)則、扭曲或折疊。一些白血病細(xì)胞含有多個柴捆狀棒狀小體。異常早幼粒細(xì)胞的過氧化物酶染色為強(qiáng)陽性反應(yīng)，而高碘酸-希夫染色顯示出弱陽性反應(yīng)。CD34、CD117、HLA-DR、CD13、CD33、CD11b、CD11c、CD15和CD38等免疫表型標(biāo)志物檢測發(fā)現(xiàn)，3例病例均表現(xiàn)出典型的免疫表型，即患者不表達(dá)CD34、HLA-DR和CD11b，而表達(dá)CD13、CD33、CD117、CD38。

2.2 細(xì)胞及分子遺傳學(xué)結(jié)果

3例插入易位APL病例的常規(guī)染色體核型分析均表現(xiàn)為正常男性核型46，XY，而未能檢測到t(15;17)易位存在。FISH研究結(jié)果顯示，Abbott探針在此3例PML-RARα融合基因檢測均為陰性；Cytocell檢測到2例陽性，1例陰性；康錄和安必平探針3例均成功檢測到融合信號，詳見表1。所有FISH探針檢測到的融合信號均為微弱的融合信號，如圖1所示，箭頭所指分別為安必平及Cytocell探針?biāo)就换颊撸?7號RARα部分片段易位至15號PML處形成的弱融合信號。圖1中安必平PML-RARα探針顯示2R1G1F信號模式，箭頭所示的融合信號是17號染色體部分RARα片段(紅色)易位到15號染色體PML(綠色)處形成弱的PML-RARα融合信號；而Cytocell的PML-RARα探針顯示1R2G1F信號模式，箭頭所示融合信號由位于17號染色體的部分RARα片段(綠色)易位至位于15號染色體的PML(紅色)處形成弱的PML-RARα融合信號。而應(yīng)用RT-PCR方法在3例中均檢測到PML-RARα融合基因，如圖2所示，灰色箭頭指的是PML-RARα擴(kuò)增曲線。

表1 4種不同F(xiàn)ISH探針檢測插入性PML-RARα易位病例的比較

圖1 安必平及Cytocell探針檢測到弱PML-RARα融合(DAPI染色，×1 000)

圖2 健康人和3例APL患者PML-RARα融合基因的RT-PCR擴(kuò)增圖

3 討論

FISH技術(shù)對診斷經(jīng)典型t(15;17)易位形成的PML-RARα融合基因準(zhǔn)確性非常高，是臨床血液病診斷中的常用技術(shù)。然而，在檢測小片段隱匿PML-RARα易位時，F(xiàn)ISH出現(xiàn)了少有的假陰性情況，F(xiàn)ISH陰性的罕見病例文獻(xiàn)也偶見報道，Kim等[4]總結(jié)1995至2010年共計13例個案報道，均為常規(guī)核型分析未見t(15;17)，F(xiàn)ISH檢測PML-RARα陰性，而分子生物學(xué)方法如RT-PCR或RNA測序檢測到融合基因。由于PML-RARα融合基因的存在，此型患者對全反式維甲酸治療與經(jīng)典型t(15;17)患者具有相似的反應(yīng)和預(yù)后。表2為作者總結(jié)的1995至2021年文獻(xiàn)報道的20例此類少見病例[4-20]，均為染色體及FISH檢測陰性APL病例，其中用于檢測的FISH探針除2例所用探針未知，2例來自O(shè)ncor以外，其余16例均為Abbott探針。

表2 分子遺傳陽性而細(xì)胞遺傳(FISH及核型)檢測陰性的20例病例

初診APL患者FISH檢測失敗，除了RT-PCR[21]或測序技術(shù)有更高的敏感性以外，PML/RARα探針本身的設(shè)計是否會影響到檢測敏感性，值得進(jìn)一步探討。國外報道一組少見插入易位病例[22]采用Abbott及Cytocell探針對比研究發(fā)現(xiàn)，Abbott探針在一些隱匿性PML-RARα融合檢測中出現(xiàn)假陰性主要跟探針大小有關(guān)，Abbott探針大小和其標(biāo)記覆蓋面積是Cytocell的2倍左右，這使得小片段插入部分與被插染色體信號強(qiáng)度差異較大，大片段信號遮蓋住小片段信號，以致融合信號不可見。表2中總結(jié)的20例少見病例，16例使用的是Abbott探針，這一方面與其在國際上廣泛使用有關(guān)，另一方面與探針檢測的敏感性相關(guān)。從產(chǎn)生機(jī)制上來說，臨床少見的隱匿性PML-RARα融合，大多由插入易位引起，其中以ins(15;17)即17號小片段RARα成分插入至15號染色體PML處形成PML-RARα融合最為常見，而15號插入17號則相對少見[23-24]，本研究中例3即為這種罕見型。

FISH檢測中，探針的大小、覆蓋范圍以及熒光強(qiáng)度對異常的檢出率均有影響。Abbott探針：PML探針覆蓋了該基因兩側(cè)180 kb和335 kb，包含了所有PML的斷裂點(diǎn)區(qū)域；RARα探針覆蓋了該基因700 kb范圍，包含了所有RARA的斷裂點(diǎn)區(qū)域。Cytocell探針：PML探針覆蓋了該基因兩側(cè)151 kb和174 kb；RARα探針覆蓋了該基因兩側(cè)167 kb和164 kb。本文中例1、例2為RARα小片段插入至PML處形成融合基因。Abbott的PML探針片段比較長，紅色熒光強(qiáng)度比較強(qiáng)，小片段的RARα綠色熒光比較弱，插入后，綠色熒光被紅色熒光湮滅了，未能形成肉眼可見的黃色融合信號，故判為陰性結(jié)果。而Cytocell的PML探針片段比較小，紅色熒光強(qiáng)度比較弱，小片段的綠色RARα信號插入后，也能夠形成肉眼可見的黃色融合信號。康錄探針全長(PML330 kb，RARα320 kb)與Cytocell長度相仿，同理也能被識別。例3為PML小片段插入至RARα形成融合基因，Abbott探針判為陰性，其原因跟上述例1、例2分析的一致。康錄探針成功檢測到融合信號也是因為其設(shè)計的RARα僅為320 kb，因而未將插入而來的小片段PML完全湮滅。與康錄探針大小類似的Cytocell探針結(jié)果卻判為陰性，這可能跟另一個因素有關(guān)，即該探針設(shè)計的PML位點(diǎn)未能覆蓋例3中插入片段斷裂位點(diǎn)，導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性。至于安必平探針，從大小上來說，PML基因座大小578 kb，RARα1 000 kb，其探針設(shè)計總體長度與Abbott探針相似，但與此相反，在3例APL中均成功檢測到融合信號。這可能與影響檢測的第3個因素即熒光強(qiáng)度有關(guān)，雖然小片段插入信號被一定程度湮滅，但由于探針整體熒光強(qiáng)度偏強(qiáng)，因此小片段插入信號仍然保留了下來從而能被觀測到。

對于檢測APL中少見的隱匿插入PML-RARα易位病例，國產(chǎn)安必平及康錄探針因熒光強(qiáng)度強(qiáng)，檢測時表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢。但由于信號細(xì)弱，無論采用何種探針，若不仔細(xì)觀察都可能出現(xiàn)漏診的情況。本研究旨在提高對FISH方法檢測此類少見異常的認(rèn)識，以利于及時發(fā)現(xiàn)這部分隱匿易位病例。同時應(yīng)該意識到敏感性高的探針其特異性會有一定程度的下降，希望臨床及實(shí)驗室醫(yī)生認(rèn)識到診斷方法各有其局限性。由于方法學(xué)不同，RT-PCR及測序技術(shù)對此類插入易位檢測更為敏感。但各種檢測方法各有利弊，建議RT-PCR和FISH檢測綜合使用作為最實(shí)用、最敏感的診斷策略。