郭凱麗 袁盼盼 薛妙 王艷霞 劉繼平 王斌 王川 張?chǎng)卫?朱星枚**

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽(yáng) 712046；3.陜西省中醫(yī)藥管理局中藥藥效機(jī)制與物質(zhì)基礎(chǔ)重點(diǎn)研究室，陜西 咸陽(yáng) 712046；4.空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)與藥物分析學(xué)教研室，陜西 西安 710032

德爾塔病毒(delta virus)是新型冠狀病毒肺炎(Coronavirus disease 2019，COVID-19)的變異毒株，具有傳播力強(qiáng)、潛伏期短、病毒載量高等特點(diǎn)[1-3]，是陜西此次本土疫情的根源。與武漢新型冠狀病毒肺炎相比，德爾塔病毒對(duì)康復(fù)個(gè)體血清中抗體的敏感性降低了6倍，且抗德爾塔病毒疫苗有效性降低[4]。研究表明，德爾塔病毒變異株抗原位點(diǎn)發(fā)生了突變[5]，此突變可增強(qiáng)病毒感染性和融合性，同時(shí)促進(jìn)病毒復(fù)制[6-7]。目前針對(duì)新冠肺炎德爾塔病毒感染患者的密接、次密接人員尚無(wú)特效藥物，中醫(yī)藥是治療新冠肺炎德爾塔病毒輕癥患者的有效手段[8]。

宣肺化濁湯出自于《甘肅省中醫(yī)藥預(yù)防新冠肺炎方(2021版)》，由蜜麻黃、連翹、前胡、法半夏、麩炒蒼術(shù)、廣藿香、羌活、酒大黃、陳皮、黃芩10味中藥組成。此方宣肺透邪、清熱化濁，可用于新冠病毒密切接觸人員的預(yù)防，也可用于新冠肺炎德爾塔病毒輕癥患者的治療。目前宣肺化濁湯防治德爾塔病毒的作用機(jī)制尚不清楚，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)既能分析中藥作用，還能說(shuō)明微觀分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)間的互作關(guān)系[9]。因此本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討宣肺化濁湯各味中藥活性成分、靶點(diǎn)以及作用機(jī)制，為新冠肺炎輕癥患者應(yīng)用宣肺化濁湯防治德爾塔病毒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1本研究所用軟件及數(shù)據(jù)庫(kù) 見(jiàn)表1。

表1 本研究所用軟件及數(shù)據(jù)庫(kù)

1.2各藥物活性成分的獲取與篩選 設(shè)置口服利用度(OB30%)、類藥性(DL0.18)，在線查詢TCMSP，獲取蜜麻黃、連翹、前胡、法半夏、麩炒蒼術(shù)、廣藿香、羌活、酒大黃、陳皮、黃芩的活性成分。

1.3活性成分作用靶點(diǎn)的獲取 通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)獲得1.2中各成分的Canonical SMILES，導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)，刪除重復(fù)項(xiàng)獲得活性成分的作用靶點(diǎn)。

1.4德爾塔病毒作用靶點(diǎn)的獲取 以“delta virus”為關(guān)鍵詞，在線搜索GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)，刪除重復(fù)項(xiàng)獲得德爾塔病毒靶點(diǎn)。

1.5藥物成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)交集的獲取 將1.3與1.4中的靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny平臺(tái)，獲得藥物成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)交集。

1.6GO及KEGG富集分析 將1.5中交集靶點(diǎn)的official gene symbol輸入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，Select Identifier選擇“official gene symbol”，物種選擇“homo sapiens”，對(duì)作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析，在微生信平臺(tái)繪制排名靠前的GO過(guò)程和KEGG通路氣泡圖。

1.7蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 為深入研究宣肺化濁湯對(duì)新冠肺炎德爾塔變異病毒的潛在作用靶點(diǎn)，將1.5中所得靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為“Homo Sapiens”，獲取蛋白相互作用關(guān)系。將所得結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.8.2中，根據(jù)Degree值篩選靶點(diǎn)、通路，利用“Network Analyzer”進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

1.8靶點(diǎn)、通路相互作用的構(gòu)建與分析 將1.7中篩選獲得靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape中導(dǎo)出Excel，獲得靶點(diǎn)、通路作用關(guān)系表。

1.9分子對(duì)接驗(yàn)證 選擇宣肺化濁湯核心成分和核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。利用RCSB PDB網(wǎng)站輸出靶點(diǎn)mol2結(jié)構(gòu)，PubChem網(wǎng)站輸出活性成分的SDF文件，通過(guò) Autodocktool1.5.6 軟件進(jìn)行處理并轉(zhuǎn)變?yōu)镽CSB PDBQT 格式。借助 Autodocking vina v1.2.0分子對(duì)接。選取結(jié)合自由能最小的構(gòu)象，用Pymol、Discovery studio Client 進(jìn)行可視化及結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1宣肺化濁湯的主要活性成分信息 見(jiàn)表2。

表2 主要活性成分信息表

2.2宣肺化濁湯防治新冠肺炎德爾塔變異病毒的潛在靶點(diǎn) 將GeneCards等數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的靶點(diǎn)刪除重復(fù)項(xiàng)后得到宣肺化濁湯646個(gè)靶點(diǎn)、德爾塔變異病毒5583個(gè)靶點(diǎn)。兩者求交集共得到526個(gè)宣肺化濁湯對(duì)德爾塔變異病毒潛在作用的靶點(diǎn)(圖1)。

圖1 宣肺化濁湯活性成分及德爾塔變

2.3蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖 將2.2中所得526個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中，根據(jù)Degree值獲得53個(gè)宣肺化濁湯對(duì)德爾塔變異病毒作用的靶點(diǎn)(表3)，并獲得蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖2)。

表3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建核心靶點(diǎn)

圖2 宣肺化濁湯對(duì)新冠肺炎德爾塔變異病毒靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.4GO分析與KEGG富集分析 GO分析確定2255個(gè)條目(圖3)。

圖3 宣肺化濁湯靶點(diǎn)的GO富集分析

主要涉及2097條生物過(guò)程(Biological process,BP)，包括蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞老化以及對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)等；52條細(xì)胞組分(Cellular component,CC)，包括膜筏、質(zhì)膜筏、粘著斑等；106條分子功能(Molecular function,MF)，包括細(xì)胞-基質(zhì)粘附連接、磷酸酶結(jié)合、激素受體結(jié)合、蛋白酪氨酸激酶活性、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接配體調(diào)節(jié)的序列特異性 DNA 結(jié)合等。KEGG富集分析確定156個(gè)條目，主要包括癌癥中的蛋白聚糖通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通路、內(nèi)分泌抵抗通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化通路等(圖4)。

圖4 宣肺化濁湯靶點(diǎn)的KEGG富集分析

2.5“藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)-蛋白通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將藥物-活性成分-交集靶點(diǎn)-蛋白通路關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape3.8.2中，構(gòu)建“宣肺化濁湯-德爾塔變異病毒”的網(wǎng)絡(luò)圖(圖5)。其中紅色代表宣肺化濁湯、橙色代表組方中各藥物、黃色代表活性成分、綠色代表作用靶點(diǎn)、藍(lán)色代表通路。該網(wǎng)絡(luò)圖中黃芩、連翹、前胡、羌活、陳皮為宣肺化濁湯的關(guān)鍵作用藥物；naringenin、Onjixanthone I、bicuculline、acacetin、baicalein、pachypodol為主要活性成分。

圖5 “宣肺化濁湯-新冠肺炎德爾塔變異病毒”的“藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)-蛋白通路”網(wǎng)絡(luò)

2.6分子對(duì)接結(jié)果 將篩選后的主要活性成分與新冠肺炎德爾塔變異病毒主要靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。宣肺化濁湯中主要活性成分與主要靶點(diǎn)結(jié)合能均<-5.0 kJ·mol-1(表4)，其中GSK3B與TYRA：108、THRA：113、GLYA：84等氨基酸殘基之間存在范德華力；與PHEA：122、LEUA：80氨基酸殘基之間存在pi-烷基鍵；與VALA：40氨基酸殘基存在pi-σ鍵。PIK3R1與TYRA：106等氨基酸殘基存在范德華力；與VALA：108等氨基酸殘基存在pi-σ鍵。KIT與 PHEA：70等氨基酸殘基存在范德華力；與META：94等氨基酸殘基存在pi-s鍵；與LEUA：99等氨基酸殘基存在pi-烷基鍵。KDR與GLAY：41等氨基酸殘基存在范德華力；與PROB:165氨基酸殘基存在pi-陰離子鍵。MMP-9與META：247等氨基酸殘基存在范德華力；與GLUA：227等氨基酸殘基存在pi-陽(yáng)離子鍵；與METB：247等氨基酸殘基存在pi-烷基鍵等(圖 6)。

表4 結(jié)合能結(jié)果

3 討論

德爾塔變異株最早于2020年10月發(fā)現(xiàn)于印度，2021年5月被世界衛(wèi)生組織列為“受關(guān)注的對(duì)象”，其因強(qiáng)傳染性威脅全球健康。宣肺化濁湯是由甘肅省新冠肺炎疫情中醫(yī)藥救治專家組會(huì)同國(guó)家醫(yī)療救治指導(dǎo)組中醫(yī)藥專家針對(duì)德爾塔變異病毒感染患者的密接、次密接人員共同研究制定。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出39個(gè)宣肺化濁湯的主要活性成分，通過(guò)作用526個(gè)潛在靶點(diǎn)防治德爾塔病毒，說(shuō)明宣肺化濁湯治療新冠肺炎德爾塔病毒具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。其中黃芩、連翹、前胡、羌活、陳皮5味中藥中的6種成分：naringenin、Onjixanthone I、bicuculline、acacetin、baicalein、pachypodol可能是治療新冠肺炎德爾塔病毒的主要活性成分。研究表明，naringenin可促進(jìn)活化的肝星狀細(xì)胞凋亡，同時(shí)抑制肝細(xì)胞的凋亡，且naringenin可能通過(guò)下調(diào)MMP-9的表達(dá)改善缺血后BBB的功能，從而保護(hù)腦組織[10-13]。Onjixanthone I屬于蒽醌類化合物[14]，其通過(guò)抑制氧化損傷和逆轉(zhuǎn)AChE活性，減少學(xué)習(xí)缺陷和記憶喪失，緩解了對(duì)鉛誘導(dǎo)的乙酰膽堿酯酶功能障礙和認(rèn)知障礙的神經(jīng)保護(hù)作用[15-17]。bicuculline可下調(diào)MMP-9基因表達(dá)且抑制JAK2的活化從而抑制人肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲[18]。Acacetin 是一種存在于各種植物中的黃酮，可抑制 STAT3 激活的 DU145 前列腺癌細(xì)胞中的組成型和誘導(dǎo)型 STAT3 活化,以時(shí)間依賴性方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19-21]。baicalein可抑制肝癌細(xì)胞的增殖，降低肝癌細(xì)胞的能量代謝水平[22]。pachypodol具有抗氧化和細(xì)胞保護(hù)作用[23-24]。對(duì)宣肺化濁湯治療新冠肺炎德爾塔病毒的潛在作用靶點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)CDK2、 mTOR、ABL1、MAPK、EGFR、MAPK、Mcl-1、IL-2可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡、自噬等。GSK3B在非胰島素依賴型糖尿病中，其活性會(huì)異常升高。MMP-2、mTOR可在腫瘤相關(guān)組織中發(fā)揮作用。PTGS2是非甾體類藥物的作用靶點(diǎn)之一，與炎癥反應(yīng)相關(guān)。APP是一種跨膜糖蛋白，過(guò)度的APP干擾神經(jīng)元轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)單純性皰疹病毒導(dǎo)致的APP表達(dá)上調(diào)有很大意義[25]。

綜上所述，宣肺化濁湯中活性成分具有抗病毒、抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等作用，且其通過(guò)核心靶點(diǎn)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡、自噬，對(duì)新冠肺炎德爾塔病毒發(fā)揮潛在治療作用，本研究為后續(xù)防治新冠肺炎德爾塔病毒提供更多理論支持。