高貝貝，黃子慧，陳思琪，曹麗敏，翁嘉晨，郭丹丹，陳 悅

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210014)

結(jié)核病是在世界范圍內(nèi)流行的傳染病，是單一傳染源導(dǎo)致死亡的主要原因之一，僅次于新型冠狀病毒肺炎(COVID -19)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)[1]估計，我國2020年新發(fā)結(jié)核病患者數(shù)為84.2萬，發(fā)病率為8.5%，居結(jié)核病高負擔(dān)國家的第二位；同時，受COVID -19的影響，基本結(jié)核病服務(wù)中斷，全球因結(jié)核病死亡的患者約增加10萬例。近年來，在COVID -19肆虐、結(jié)核分枝桿菌變異以及耐藥菌種增多等多種因素影響下，結(jié)核病發(fā)病率上升，治療難度加大，結(jié)核病的防治顯得尤為重要。

結(jié)核性潰瘍(tuberculous ulcer，TU)，又稱皮膚結(jié)核，是指結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌以及卡介苗侵犯機體局部組織，引起病灶周圍軟組織、皮下及皮膚壞死，最終液化破潰形成的創(chuàng)面，是臨床上最常見的一類特異感染性疾病。臨床主要表現(xiàn)為創(chuàng)周皮色暗紅，肉芽蒼白水腫，膿液稀薄，形成竇道或慢性潰瘍[2]。雖破潰口一般較小，但深層次多有潛行空腔，遷延難愈。目前TU的病因及發(fā)病機制不清，早期診斷困難，缺乏敏感和特異性高的診斷標志物，常與其他慢性創(chuàng)面混淆，發(fā)病周期長，纏綿難愈，嚴重影響患者日常生活，給TU的防治帶來極大的負擔(dān)。迄今為止，國內(nèi)外文獻對結(jié)核病的研究以肺結(jié)核為主，TU屬于肺外結(jié)核，其發(fā)病機制研究較少，以個案報道較為多見。因此，尋找TU病變發(fā)生的機制，找到精確的治療靶點，獲得良好預(yù)后，從根本上解決TU的問題已成為當(dāng)務(wù)之急。

高通量測序技術(shù)迅速發(fā)展，生物信息學(xué)分析逐步成為科研領(lǐng)域中重要的研究方法。該方法在識別可靠的功能差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs)及篩選疾病候選生物標志物方面顯示出了巨大的優(yōu)勢。本文通過對基因表達綜合數(shù)據(jù)庫及課題組前期基因測序數(shù)據(jù)集進行篩選，應(yīng)用多種生物信息技術(shù)進行基因分析，采用臨床試驗進行驗證，以期發(fā)現(xiàn)與TU高度相關(guān)的特異性指標，為TU的靶向研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集 選取課題組前期基因測序的相關(guān)數(shù)據(jù)集[3]，納入3例TU組織標本和3例TU旁正常組織標本，所有標本均經(jīng)過病理切片鑒定。研究從公共數(shù)據(jù)庫GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載肺外結(jié)核(extrapulmonary tuberculosis，EPTB)相關(guān)數(shù)據(jù)集GSE83456，其平臺為GPL10558(Illumina HumanHT-12 V4.0 Expression BeadChip)。其中納入GSE83456數(shù)據(jù)集47例EPTB血標本和61例健康人體對照(healthy controls，HC)的血標本。GEO芯片樣本數(shù)據(jù)均下載以供進一步分析。

1.2 差異基因的篩選和京都基因與基因組百科全書(KEGG)/基因本體論(GO)富集分析 用R語言(版本：4.1.2)對基因測序及GSE83456的數(shù)據(jù)列進行處理。采用LIMMA軟件包比較試驗組和正常對照組之間的差異，識別DEGs，對于具有重復(fù)基因符號的探針，使用平均值作為唯一表達值。兩組設(shè)定P值<0.05和|logfc|>1為篩選條件，篩選獲得DEGs。用維恩圖將基因測序的DEGs和GSE83456的DEGs相交，篩選與該病相關(guān)的靶基因。通過使用R語言中的‘clusterProfiler’包對交集基因進行富集分析，然后使用“ggplot2”包進行可視化。設(shè)定P值<0.05為篩選條件，分別篩選出明顯富集的GO分析，以及KEGG相關(guān)富集通路分析。

1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 使用檢索工具檢索相互作用基因(STRING)在線數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org；version11.5)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)。PPI可以揭示疾病發(fā)生發(fā)展的機制。在此項研究中，使用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建相交基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，得分>0.4的交互作用被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。Cytoscape(版本：3.9.0)是一個開源軟件平臺，用于可視化復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)并將其與任何類型的屬性數(shù)據(jù)集成。CytoHubba是一個用于發(fā)現(xiàn)PPI網(wǎng)絡(luò)中樞基因的Cytoscape插件。使用CytoHubba插件中的最大相關(guān)準則(MCC)對相交基因進行MCC評分，并將評分按照從高到低的順序排列，順序越高，基因的紅色越深。

1.4 基因組富集分析(GSEA) GSEA是一種計算方法，用于確定一組先驗定義的基因是否在兩種生物狀態(tài)(如表型)之間存在差異。使用GSEA(4.2.1)確定GBP1參與淋巴結(jié)結(jié)核病潛在的生物學(xué)機制。通過進行1 000次基因組排列獲得標準化的富集分數(shù)(NES)。在當(dāng)前的研究中探索特征[h.all.v7.5.1.symbols.gmt(Hallmarks)]基因組。設(shè)定P值<0.05，錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05為篩選條件，以量化統(tǒng)計上的顯著富集。

1.5 臨床試驗驗證

1.5.1 試驗材料及儀器 包括TRIzolTM LS Reagent(美國Thermo Fisher Scientific公司)，DEPC水，500 mL BR 0.1%(上海源葉生物科技有限公司),PrimScript RT Master Mix(日本TaKaRa公司)，ChamQ SYBR qPCR Master Mix(南京Vazyme公司),引物(上海生工生物公司),高速低溫離心機(德國Hettich公司),IMS-25全自動雪花制冰機(常熟雪科公司)，超微量分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)，T100梯度PCR儀(購自美國BIORAD公司)，全自動熒光PCR分析儀(瑞士Roche公司)。

1.5.2 納入及排除標準 納入標準：(1)符合TU中西醫(yī)診斷標準的患者；(2)潰瘍面積4～25 cm2；(3)患者未接受抗結(jié)核及免疫學(xué)治療；(4)患者一般臨床資料完整且同意參加本次研究并簽署知情同意書。排除標準：(1)合并有造血系統(tǒng)、肝、腎及心腦血管等嚴重原發(fā)性疾病及繼發(fā)疾病者；(2)免疫功能受損者，如人類免疫缺陷病毒(HIV)感染、白血病、淋巴瘤或全身性惡性疾病等；(3)正在接受免疫抑制治療的患者，如使用糖皮質(zhì)激素、烷化劑、抗代謝藥物以及放射治療等；(4)活動性肺結(jié)核患者[4]。

1.5.3 研究對象 選擇2021年7月—2022年3月在南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院瘰疬科就診的60例TU患者為研究對象，所有患者均經(jīng)過病理診斷確診，其中男性23例，女性37例，年齡23～72歲，平均年齡(39.2±8.9)歲。同期選取本院健康體檢者60例作為對照組，其中男性26例，女性34例，年齡25～67歲，平均年齡(41.7±11.4)歲。受試者自愿參加此項研究并已簽署同意書，本研究已獲得南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理科的批準，符合世界醫(yī)學(xué)會赫爾辛基宣言。

1.5.4 血標本采集 采集所有HC及TU患者治療前和治療2周后清晨空腹靜脈血3 mL，置于離心管中，4℃ 3 000×g，離心10 min，之后轉(zhuǎn)移上清至新離心管中，保存在-80℃冰箱備用。

1.5.5 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測 按照試劑說明書對血清進行提取，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后將cDNA產(chǎn)物進行10倍稀釋，并使用qPCR試劑盒進行實時熒光定量qRT-PCR分析。每個樣品設(shè)1個復(fù)孔，重復(fù)三次試驗。qRT-PCR對所有受試者TU及HC血清中GBP1的表達水平進行檢測。qRT-PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，60℃退火與延伸30 s，共計40個循環(huán)。采用2-△△Ct對檢測數(shù)據(jù)進行相對定量分析，通過內(nèi)參基因GAPDH的Ct值對靶基因GBP1的相對表達水平進行歸一化處理，并利用GraphPad Prism(8.0.1)對試驗結(jié)果進行處理。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計分析 統(tǒng)計分析均由R語言(版本：4.1.2)軟件及GraphPad Prism(8.0.1)軟件進行。t檢驗用于檢驗兩組之間的差異，P值為雙側(cè)，P≤0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EPTB中DEGs的鑒定 從TU患者組織的基因表達序列中篩選出2 490個差異基因，其中1 276個基因上調(diào)，1 214個基因下調(diào)，繪制相應(yīng)的火山圖(見圖1A)和熱圖(見圖1B)。此外，從EPTB患者血液基因表達序列中篩選出79個差異基因，其中69個基因上調(diào)，10個下調(diào),繪制相應(yīng)的火山圖(見圖1C)和熱圖(見圖1D)。設(shè)置P<0.05和|logFC|>1為選擇標準?；驕y序序列與GSE83456的交叉點分別為：CXCL10、SLAMF8、C1QB、WARS、IDO1、ANKRD22、CARD17、LAP3、GBP1、ETV7、APOL6、GBP3、TRIM22、RTP4、OAS1、SAMD9L、P2RY14、DDX60、XAF1(見表2)，繪制相應(yīng)的韋恩圖(見圖1E)和圈圖(見圖1F)。

注：A為基因測序中DEGs的火山圖；B為基因測序中DEGs的熱圖；C為GSE83456中DEGs的火山圖；D為GSE83456中DEGs的熱圖；E為顯示基因測序和GSE83456中差異基因交集的韋恩圖；F為顯示交集基因在染色體上相應(yīng)位置的圈圖。

2.2 差異基因的富集分析 富集分析用于分析DEGs的生物學(xué)功能，對19個交集DEGs進行GO和KEGG途徑富集分析(見圖2)。GO分析結(jié)果表明，DEGs在抗病毒免疫反應(yīng)、單核細胞趨化性調(diào)節(jié)、干擾素-β相關(guān)信號通路中顯著富集，主要集中在生物學(xué)功能(BP)上。KEGG途徑分析表明，交集GEGs在NOD樣受體信號通路、感染性疾病方面顯著富集。

表2 基因測序和GSE83456中DEGs的交集候選靶基因

注：A為GO功能富集柱形圖；B為GO功能富集圈圖；C為KEGG的通路富集分析氣泡圖。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及相應(yīng)生物標志物的選擇 使用String Online數(shù)據(jù)庫對19個交叉基因進行分析，獲得19個交叉基因的相互作用數(shù)據(jù)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖3A)。統(tǒng)計基因的連接節(jié)點數(shù)并進行可視化(見圖3B)，將數(shù)據(jù)作為節(jié)點導(dǎo)出供進一步分析。導(dǎo)出的數(shù)據(jù)采用Cytoscape軟件進行可視化處理，并使用cytoHubba插件分析MCC的HUB基因(見圖3C)，其中GBP1的連接節(jié)點數(shù)及MCC評分均處于核心地位。根據(jù)GBP1的表達量，將GSE83456的樣本分為兩組：GBP1低表達組和GBP1高表達組，然后采用GSEA對兩組數(shù)據(jù)進行分析(見圖3D)。再對GSE83456樣本中的EPTB組和HC組進行GSEA分析(見圖3E)。GSEA結(jié)果顯示，高表達GBP1組血標本中顯著富集的途徑與EPTB組基本一致。免疫系統(tǒng)相關(guān)途徑如白細胞介素(IL)-6/JAK/STAT3和干擾素-γ(INF-γ)反應(yīng)等與EPTB高度相關(guān)。

注：A為19個交集基因的相互作用；B為PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因的連接節(jié)點數(shù)；C為19個交集基因中HUB基因的相互作用，顏色越紅，MCC評分越高；D為GSE83456中GBP1高表達組和低表達組中Hallmarks基因集的GSEA；E為GSE83456中EPTB組和HC組中Hallmarks基因集的GSEA。

2.4 qRT-PCR檢測血清中GBP1的mRNA表達水平 qRT-PCR檢測TU患者及HC血清中GBP1的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TU患者血清內(nèi)GBP1的表達水平較HC中高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.007，見圖4A)。治療2周后，TU患者血清內(nèi)GBP1的表達水平較治療前明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，見圖4B)。

注：A為qRT-PCR方法檢測GBP1在TU患者及HC血清中mRNA的相對表達量；B為qRT-PCR方法檢測GBP1在TU患者治療前及治療2周后血清中mRNA的相對表達量。

3 討論

目前臨床上報道的結(jié)核病以肺結(jié)核為主，TU屬于EPTB，較為少見。加上臨床上多藥耐受性結(jié)核分枝桿菌層出不窮，TU又常易與其他慢性創(chuàng)面混淆導(dǎo)致誤診漏診，給TU的防治帶來極大的負擔(dān)，探索其潛在的發(fā)病機制和治療指標是當(dāng)務(wù)之急。

本研究從TU組織基因測序及GEO數(shù)據(jù)庫提取EPTB的原始數(shù)據(jù)著手，使用生物信息學(xué)分析分別挖掘TU組織與TU旁正常組織的差異基因，以及EPTB血液與HC血液之間的DEGs?？偣埠Y選出19個交集的DEGs，均為上調(diào)基因。對比這些DEGs在組織和血液中的表達水平，發(fā)現(xiàn)組織中的差異表達普遍較血液更為明顯。據(jù)相關(guān)文獻[5]報道，超過半數(shù)的EPTB患者可引起病灶周圍軟組織、皮下及皮膚的損傷，最終導(dǎo)致TU的形成。TU形成后，結(jié)核分枝桿菌在病灶組織中聚集，通過直接蔓延的方式繼續(xù)侵犯周圍軟組織，擴大感染范圍，而血液是結(jié)核分枝桿菌傳播的一個途徑，并在全身擴散，推測可能是因為結(jié)核分枝桿菌在血液中相較于局部組織含量較低，故因感染引發(fā)的變化不明顯。

GO分析結(jié)果顯示，DEGs主要富集在抗病毒免疫反應(yīng)、單核細胞趨化性調(diào)節(jié)、干擾素-β(IFN-β)等方面。單核細胞的趨化性是指單核細胞移行至炎癥區(qū)域或其他趨化刺激物處執(zhí)行功能，趨化因子在單核細胞趨化的過程中行使調(diào)節(jié)作用[6]。在結(jié)核病中，趨化因子可趨化單核細胞向被結(jié)核分枝桿菌感染的部位聚集，參與機體的慢性炎癥反應(yīng)及肉芽腫的形成[7]。IFN-β屬于Ⅰ型干擾素家族，常在臨床上應(yīng)用于調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤生長和抗病毒等方面[8-9]。Ⅰ型干擾素會促進慢性細菌感染，據(jù)相關(guān)文獻[10-11]報道，IFN-β在結(jié)核分枝桿菌感染期間會抑制宿主抗菌免疫反應(yīng)并促進發(fā)病機制。

KEGG富集分析顯示，DEGs主要富集在NOD樣受體信號通路、感染性疾病等信號通路上。NOD樣受體(Nucleotide binding oligomerization domain-like receptors，NLR)為模式識別受體，由介導(dǎo)配體蛋白的C端亮氨酸富集重復(fù)結(jié)構(gòu)域(Leucine-rich repeat domain，LRRs)、具有ATP酶結(jié)構(gòu)域的中心核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Nucleotide-binding domain，NBD)和結(jié)合下游分子的N端結(jié)構(gòu)域組成[12]。NOD樣受體是結(jié)核分枝桿菌激活機體促炎反應(yīng)的微生物傳感器。通過其LRR結(jié)構(gòu)域感知細菌，從而激活NF-κB和MAPK等信號通路，啟動機體炎癥反應(yīng)。同時，NOD樣受體會激活巨噬細胞及其他免疫細胞，將其招募到感染部位參與慢性炎癥的形成。NOD1樣受體可以促進趨化因子的產(chǎn)生和中性粒細胞的募集，NOD2樣受體可以調(diào)節(jié)人類巨噬細胞中結(jié)核分枝桿菌的促炎反應(yīng)和宿主反應(yīng)[13-15]。

對交集基因進行蛋白相互作用分析，篩選出關(guān)鍵基因GBP1。GBP1又稱鳥苷酸結(jié)合蛋白，是一種在INF-γ刺激下大量表達的基因，屬于GTPase家族，在巨噬細胞等多種細胞類型中表達，并在炎癥組織中上調(diào)[16]。GBP1的高表達可增加結(jié)核分枝桿菌感染后細胞因子IL-1β的釋放，保護結(jié)核分枝桿菌在細胞內(nèi)存活。GBP1為脂多糖(LPS)的傳感器，可作為一種模式識別受體與LPS直接相連，從而激活炎性小體，觸發(fā)機體炎性反應(yīng)[17]。同時，GBP1具有抗血管生成活性，一方面通過抑制VEGF-A的表達直接抑制血管的生成，另一方面通過誘導(dǎo)血管抑制細胞因子/趨化因子的釋放如CXCL9-11的表達間接抑制血管生成[18-19]。而血管新生與創(chuàng)面的愈合息息相關(guān)，是愈合過程中的重要機制，更是創(chuàng)面修復(fù)愈合的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

通過GSEA富集分析對GSE83456芯片進行驗證，發(fā)現(xiàn)高表達GBP1組血標本中顯著富集的途徑與EPTB組基本一致。隨后，通過qRT-PCR驗證人體血液中GBP1的表達水平，證實GBP1在TU患者的血清中高表達并在TU患者接受治療2周后明顯下降。據(jù)此推測，TU的創(chuàng)面久不愈合，與GBP1促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生、結(jié)核分枝桿菌感染及抑制機體血管的形成密不可分。抑制GBP1可能加速TU創(chuàng)面的愈合，減輕患者痛苦，提高患者的生存質(zhì)量。

綜上所述，本研究揭示GBP1在TU的發(fā)病機制中發(fā)揮了重要作用，有可能成為TU的藥物靶點和診斷標志物。但是，由于慢性創(chuàng)面久不愈合時，都有著類似的炎性過程，以GBP1能否作為區(qū)別TU與其他慢性創(chuàng)面的指標，尚待進一步驗證。本研究對TU的分子生物學(xué)有了新的認識，也為將來研究TU新的生物標志物及作用機制提供了新思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。