胡 琪，尚宇瀚，薛宏宇，馬 強(qiáng)

(1.大連理工大學(xué)化工學(xué)院藥學(xué)系，遼寧 大連 116024；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；3.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，遼寧 盤錦 124221)

傳統(tǒng)中醫(yī)藥是我國(guó)歷經(jīng)千年積累下來的文化瑰寶，是中華民族醫(yī)治疾病的實(shí)踐產(chǎn)物，已成為現(xiàn)代醫(yī)療體系中不可或缺的組成部分。中藥是中醫(yī)藥理論和實(shí)踐的結(jié)晶，在一些疑難雜癥的治療方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。作為中醫(yī)用藥的主要形式，中藥復(fù)方是由兩味或兩味以上不同用量的藥材按配伍規(guī)律組合而成，在疾病治療、康復(fù)保健等方面應(yīng)用廣泛。四逆湯作為經(jīng)典名方之一，最早收錄于東漢名醫(yī)張仲景所著的《傷寒論》。四逆湯由附子、干姜和炙甘草以3∶2∶3的配伍比例水煎而成，具有溫中祛寒、回陽救逆等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，四逆湯在治療心血管疾病[1-2]、肺損傷[3]、抗炎[4]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[5-6]等方面有一定的療效。

復(fù)雜多樣的化學(xué)成分是四逆湯等中藥復(fù)方藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。近年來，中藥復(fù)方水煎液的自沉淀現(xiàn)象受到關(guān)注，在多個(gè)經(jīng)典方劑中均已證實(shí)了自沉淀的存在[7-9]。在中藥復(fù)方煎煮過程中，不同種類的化學(xué)成分之間(如生物堿和有機(jī)酸[10-11]、生物堿和糖苷[12]、鞣質(zhì)和蛋白質(zhì)[13-14]等)可通過靜電力、氫鍵、疏水作用、π-π堆積等非共價(jià)相互作用自組裝形成復(fù)合物，進(jìn)而生成自沉淀[15]。在實(shí)際用藥中，病人一般僅服用上清液，沉淀物通常同藥渣一起被舍棄。但相關(guān)研究表明[16-19]，自沉淀部分也具有與上清液相似的化學(xué)成分，呈現(xiàn)相同甚至更為優(yōu)異的藥理活性。

分析表征自沉淀部分的化學(xué)物質(zhì)組成對(duì)于探索四逆湯中自沉淀的形成機(jī)制具有重要意義。然而，由于中藥成分復(fù)合物通常以非共價(jià)鍵形式結(jié)合，具有較弱的結(jié)合鍵能，使用常規(guī)技術(shù)手段很難表征完整復(fù)合物的形成，紫外可見光譜、紅外光譜、核磁共振波譜、X射線能譜[20-23]等方法只能得到相對(duì)有限的結(jié)構(gòu)信息而無法直接觀測(cè)復(fù)合物的存在。質(zhì)譜(mass spectrometry,MS)技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、分析速度快等優(yōu)勢(shì)，可用于表征分子間非共價(jià)相互作用[24-27]。冷噴霧電離質(zhì)譜(cold spray ionization-mass spectrometry,CSI-MS)是一種在低溫下操作的軟電離質(zhì)譜技術(shù)，最初用來表征自組裝的納米級(jí)金屬配合物[29]，后被應(yīng)用于分析不穩(wěn)定的有機(jī)物分子以及通過非共價(jià)相互作用形成的復(fù)合物[29-34]。

本課題組前期采用超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法分析四逆湯上清液和自沉淀的化學(xué)成分組成，揭示了自沉淀與上清液成分的總體一致性，并利用冷噴霧電離質(zhì)譜法考察甘草酸和3種烏頭類生物堿(烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿)形成的復(fù)合物，初步證實(shí)了四逆湯中酸堿非共價(jià)復(fù)合物的存在[35]。在此基礎(chǔ)上，本研究擬采用冷噴霧電離質(zhì)譜法進(jìn)一步表征甘草次酸/苯甲酰新烏頭原堿、甘草次酸/附子靈、甘草次酸/烏頭堿、甘草次酸/新烏頭堿、甘草次酸/次烏頭堿、甘草酸/苯甲酰新烏頭原堿、甘草酸/附子靈等7組酸堿復(fù)合物，并以甘草次酸/苯甲酰新烏頭原堿復(fù)合物為例，通過等溫滴定量熱以及計(jì)算化學(xué)方法探究復(fù)合物的非共價(jià)相互作用模式，為揭示四逆湯中自沉淀的形成機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)和實(shí)驗(yàn)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Q Exactive Focus四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；Auto-iTC等溫滴定量熱儀：美國(guó)TA儀器公司產(chǎn)品；XS104電子分析天平：瑞士Mettler Toledo 公司產(chǎn)品；Milli-Q超純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；Vortex-5渦旋混合儀：海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品。

甲醇：色譜純，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品；甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；甘草酸、烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品：成都格利普生物科技有限公司產(chǎn)品；苯甲酰新烏頭原堿和附子靈標(biāo)準(zhǔn)品：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司產(chǎn)品；所有標(biāo)準(zhǔn)品純度均≥98%。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別精密稱取各10 mg標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，除甘草酸用2 mL超純水溶解甲醇定容外，其余標(biāo)準(zhǔn)品均以甲醇溶解并定容至刻度，制得濃度均為1 000 mg/L的各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，-4 ℃下保存，備用。分別量取各0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，依次配制濃度比為1∶1的甘草次酸/苯甲酰新烏頭原堿、甘草次酸/附子靈、甘草次酸/烏頭堿、甘草次酸/新烏頭堿、甘草次酸/次烏頭堿、甘草酸/苯甲酰新烏頭原堿、甘草酸/附子靈混合溶液，渦旋充分混合后靜置，待分析。

1.3 冷噴霧電離裝置

本實(shí)驗(yàn)自行搭建冷噴霧電離裝置，以提供用于酸堿非共價(jià)復(fù)合物離子化的低溫環(huán)境，具體包括液氮冷卻部分和氣體管路部分，其裝置圖示于圖1。在加入液氮的不銹鋼容器底部放置冷凝管，管口一端連接氮?dú)怃撈?，另一端連接四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀的鞘氣入口，氣體管路配有閥門用于調(diào)節(jié)氮?dú)饬魉佟?/p>

圖1 冷噴霧電離裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of the cold spray ionization assembly

1.4 質(zhì)譜檢測(cè)條件

將冷噴霧電離裝置連接至四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀，以經(jīng)過冷凝裝置冷卻的氮?dú)庾鳛榍蕷饨尤胭|(zhì)譜儀。相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)為：輔助氣溫度50 ℃，輔助氣流速0.33 L/min，離子傳輸管電壓350 V，透鏡電壓55 V，噴霧電壓3.5 kV；一級(jí)掃描分辨率70 000，二級(jí)掃描分辨率35 000，質(zhì)量掃描范圍m/z300～3 000，掃描自動(dòng)增益控制2×105，最大離子注入時(shí)間100 ms，樣品溶液以蠕動(dòng)泵注入，進(jìn)樣流速10 μL/min，單次信號(hào)采集時(shí)間2 min。

1.5 等溫滴定量熱分析

精密稱取適量的甘草次酸和苯甲酰新烏頭原堿，首先在甘草次酸中預(yù)先加入少量的40%氫氧化鈉溶液，然后分別加入少量的二甲基亞砜溶液，超聲溶解，繼續(xù)加入適量的超純水，渦旋混勻，使甘草次酸溶液濃度為5 mmol/L，苯甲酰新烏頭原堿溶液濃度為1 mmol/L。實(shí)驗(yàn)中以苯甲酰新烏頭原堿溶液滴定甘草次酸溶液，滴定溫度25 ℃，每次20滴，轉(zhuǎn)速350 r/min。用ITC RUN軟件實(shí)時(shí)采集和保存樣品池中的熱量變化。使用儀器配置軟件對(duì)熱量變化曲線進(jìn)行分析，并得到Independent擬合模型及熱力學(xué)參數(shù)，根據(jù)ΔG=ΔH-TΔS計(jì)算得到吉布斯自由能ΔG。

1.6 計(jì)算化學(xué)方法

使用Molclus軟件[36]隨機(jī)生成甘草次酸/苯甲酰新烏頭原堿復(fù)合物結(jié)構(gòu)作為初始結(jié)構(gòu)集，使用MOPAC2016軟件[37]支持的PM6-DH+半經(jīng)驗(yàn)方法對(duì)生成的結(jié)構(gòu)進(jìn)行幾何優(yōu)化與初篩，通過ORCA軟件(5.0.2版本)[38]中內(nèi)置的B97-3c泛函對(duì)能量最低的復(fù)合物構(gòu)象進(jìn)行幾何優(yōu)化與頻率分析，并在wB97M-V/def2-TZVP理論水平下對(duì)優(yōu)化后的復(fù)合物構(gòu)象做counterpoise校正及分子間結(jié)合能計(jì)算。采用Multiwfn軟件[39]對(duì)優(yōu)化后的復(fù)合物構(gòu)象進(jìn)行波函數(shù)分析，使用VMD軟件(1.9.3版本)對(duì)復(fù)合物的非共價(jià)相互作用進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 一級(jí)質(zhì)譜分析

在正、負(fù)離子模式下，7組酸堿化合物混合溶液均可檢測(cè)到1∶1結(jié)合的非共價(jià)復(fù)合物質(zhì)譜峰，其一級(jí)質(zhì)譜分析結(jié)果列于表1，質(zhì)量偏差均小于4×10-6。由于各酸堿復(fù)合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、結(jié)合能力及離子化效率不同，對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度有所差異。其中，甘草次酸/苯甲酰新烏頭原堿、甘草次酸/附子靈、甘草酸/苯甲酰新烏頭原堿、甘草酸/附子靈等4組酸堿非共價(jià)復(fù)合物的信號(hào)強(qiáng)度較高。以甘草次酸/苯甲酰新烏頭原堿復(fù)合物為例，正離子模式下，可觀察到復(fù)合物的質(zhì)子化準(zhǔn)分子離子峰m/z1 060.632[M+H]+；負(fù)離子模式下，可觀察到復(fù)合物的去質(zhì)子化準(zhǔn)分子離子峰m/z1 058.621 7[M-H]-。

2.2 二級(jí)質(zhì)譜分析

為進(jìn)一步解析所觀察到的酸堿復(fù)合物結(jié)構(gòu)組成，分別在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析以證實(shí)酸堿復(fù)合物的形成。鑒于非共價(jià)復(fù)合物的結(jié)合作用力較弱，經(jīng)考察優(yōu)化，將碰撞能量設(shè)置為10 eV，在該碰撞能量下，能夠在二級(jí)質(zhì)譜圖中同時(shí)觀察到復(fù)合物的前體離子及其特征碎片離子。7組酸堿非共價(jià)復(fù)合物的二級(jí)質(zhì)譜圖示于圖2。

表1 7組酸堿非共價(jià)復(fù)合物的一級(jí)質(zhì)譜分析結(jié)果Table 1 MS analysis results of seven pairs of acid-base non-covalent complexes

圖2 正、負(fù)離子模式下，甘草次酸/苯甲酰新烏頭原堿(a,b)、甘草次酸/附子靈(c,d)、甘草次酸/烏頭堿(e,f)、甘草次酸/新烏頭堿(g,h)、甘草次酸/次烏頭堿(i,j)、甘草酸/苯甲酰新烏頭原堿(k,l)和甘草酸/附子靈(m,n)復(fù)合物的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 MS/MS spectra of the enoxolone/benzoylmesaconine (a,b),enoxolone/fuziline (c,d),enoxolone/aconitine (e,f),enoxolone/aconitine (g,h),enoxolone/hypaconitine (i,j),glycyrrhizic acid/benzoylmesaconine (k,l) and glycyrrhizic acid/fuziline (m,n) complexes in positive and negative ion modes

由圖2a，2b可見，在正離子模式下，甘草次酸/苯甲酰新烏頭原堿復(fù)合物前體離子經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離失去甘草次酸，生成質(zhì)子化的苯甲酰新烏頭原堿離子峰(m/z590.295 2)；在負(fù)離子模式下，其前體離子失去苯甲酰新烏頭原堿，得到去質(zhì)子化的甘草次酸特征峰(m/z469.332 4)。同理，在甘草次酸/附子靈、甘草次酸/烏頭堿、甘草次酸/新烏頭堿和甘草次酸/次烏頭堿的正離子模式二級(jí)質(zhì)譜圖中，可分別觀察到附子靈(m/z454.279 3)、烏頭堿(m/z646.322 1)、新烏頭堿(m/z632.306 2)和次烏頭堿(m/z616.310 7)的特征離子峰；在負(fù)離子模式下，各復(fù)合物前體離子經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離分別失去附子靈、烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿，均生成了甘草次酸特征離子峰。

甘草酸與苯甲酰新烏頭原堿和附子靈的酸堿非共價(jià)復(fù)合物也呈現(xiàn)類似的質(zhì)譜裂解規(guī)律。由圖2k，2l可見，在正離子模式下，甘草酸/苯甲酰新烏頭原堿復(fù)合物的質(zhì)子化準(zhǔn)分子離子(m/z1 412.700 3)經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離產(chǎn)生苯甲酰新烏頭原堿碎片離子峰(m/z590.295 2)；在負(fù)離子模式下，其復(fù)合物去質(zhì)子化準(zhǔn)分子離子(m/z1 410.685 8)產(chǎn)生甘草酸碎片離子峰(m/z821.396 5)。甘草酸/附子靈復(fù)合物在正、負(fù)離子模式下可分別生成附子靈(m/z454.279 6)和甘草酸(m/z821.397 5)特征碎片離子峰。

2.3 酸堿非共價(jià)復(fù)合物在不同濃度比例下的結(jié)合情況

為考察酸堿非共價(jià)復(fù)合物在不同濃度比例下的結(jié)合情況，本研究配制了一系列不同濃度比例(3∶1、2∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶2和1∶3)的甘草次酸/苯甲酰新烏頭原堿混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別分析正、負(fù)離子模式下的一級(jí)全掃描質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并比對(duì)確認(rèn)不同結(jié)合比的酸堿非共價(jià)復(fù)合物的質(zhì)荷比理論值。結(jié)果表明，除結(jié)合比為1∶1的信號(hào)峰外，在各濃度比例溶液的質(zhì)譜圖中均發(fā)現(xiàn)存在2∶1和1∶2的結(jié)合峰，具體情況列于表2。

表2 不同濃度比例下甘草次酸/苯甲酰新烏頭原堿復(fù)合物的結(jié)合比Table 2 Binding ratios of the enoxolone/benzoylmesaconine complex with different concentration ratios

考慮到不同濃度比例可能會(huì)影響復(fù)合物的結(jié)合比，在正、負(fù)離子模式下取各結(jié)合峰在穩(wěn)定0.5 min內(nèi)的平均強(qiáng)度作為參考，考察不同濃度比例對(duì)3種結(jié)合比質(zhì)譜峰相對(duì)強(qiáng)度的影響，結(jié)果示于圖3a，3b。在正離子模式下，結(jié)合比1∶1復(fù)合物的質(zhì)譜峰信號(hào)最強(qiáng)，而隨著溶液中苯甲酰新烏頭原堿濃度的升高，1∶2結(jié)合峰強(qiáng)度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，這一規(guī)律在負(fù)離子模式下更為明顯。在考察的濃度比例下，1∶1結(jié)合峰強(qiáng)度遠(yuǎn)高于2∶1和1∶2，苯甲酰新烏頭原堿濃度占比的增大會(huì)導(dǎo)致1∶2結(jié)合峰強(qiáng)度升高，而并未發(fā)現(xiàn)2∶1結(jié)合峰強(qiáng)度與濃度比例相關(guān)的規(guī)律。結(jié)果表明，甘草次酸/苯甲酰新烏頭原堿復(fù)合物存在1∶1、2∶1和1∶2的結(jié)合比例，且以1∶1為主要結(jié)合方式。

2.4 基于等溫滴定量熱法的熱力學(xué)分析

等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖4，向上的曲線表明在苯甲酰新烏頭原堿溶液滴定甘草次酸溶液過程中產(chǎn)生了大量的熱量，隨著滴定時(shí)間的推移，熱量逐漸減少直至趨于穩(wěn)定，說明酸堿化合物之間發(fā)生了相互作用并最終達(dá)到反應(yīng)終點(diǎn)。根據(jù)反應(yīng)溫度及模擬得到的熱力學(xué)參數(shù)計(jì)算吉布斯自由能ΔG=-26.02 kJ/mol，表明甘草次酸和苯甲酰新烏頭原堿之間反應(yīng)的自發(fā)性。從結(jié)合機(jī)制來看，焓變的貢獻(xiàn)主要來自范德華力和氫鍵等非共價(jià)相互作用，而熵變的貢獻(xiàn)主要取決于疏水相互作用以及構(gòu)象變化，實(shí)驗(yàn)中得到ΔH=-23.87 kJ/mol，-TΔS=-2.149 kJ/mol，說明與熵變相比，焓變對(duì)吉布斯自由能起主導(dǎo)作用，這反映了甘草次酸和苯甲酰新烏頭原堿的結(jié)合作用力可能主要源自范德華力與氫鍵的作用。

圖3 正(a)、負(fù)(b)離子模式下，不同濃度比例對(duì)甘草次酸/苯甲酰新烏頭原堿復(fù)合物各結(jié)合比質(zhì)譜峰相對(duì)豐度的影響Fig.3 Effect of concentration ratios on relative abundance of mass spectrometric peaks of the enoxolone/benzoylmesaconine complexes with different binding ratios in positive (a) and negative (b) ion modes

圖4 甘草次酸和苯甲酰新烏頭原堿相互作用的等溫滴定量熱分析Fig.4 Isothermal titration calorimetry analysis of the interaction between enoxolone and benzoylmesaconine

2.5 計(jì)算化學(xué)結(jié)果分析

為驗(yàn)證質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用計(jì)算化學(xué)方法研究酸堿復(fù)合物的可能構(gòu)象及形成機(jī)制。選取具有代表性的甘草次酸/苯甲酰新烏頭原堿復(fù)合物進(jìn)行幾何優(yōu)化與單點(diǎn)能計(jì)算。酸堿化合物間的結(jié)合能 (binding energy,Ebind)可反映所形成復(fù)合物的穩(wěn)定性，計(jì)算結(jié)果表明，該復(fù)合物在能量最低構(gòu)象下的Ebind=-132.34 kJ/mol，證明甘草次酸與苯甲酰新烏頭原堿之間存在非共價(jià)相互作用，可結(jié)合形成復(fù)合物。

注：紅色為分子間；黑色為分子內(nèi)圖5 甘草次酸/苯甲酰新烏頭原堿復(fù)合物的δg-sign(λ2)ρ圖Fig.5 δg-sign(λ2)ρ plot of the enoxolone/benzoylmesaconine complex

為進(jìn)一步探明甘草次酸與苯甲酰新烏頭原堿之間的相互作用類型，使用獨(dú)立梯度模型(independent gradient model，IGM)[40]對(duì)復(fù)合物進(jìn)行可視化分析，結(jié)果示于圖5、6。在圖5中，-0.02與0.02位置的峰分別對(duì)應(yīng)范德華引力與斥力，而-0.04位置的峰代表氫鍵作用，二者同時(shí)出現(xiàn)說明2種分子間存在范德華作用與氫鍵。從圖6可以看出，苯甲酰新烏頭原堿中苯甲?；噙B橋頭碳上H(H64)、相鄰橋頭碳上H(H70)、7號(hào)位羥基H(H73)與甘草次酸中羧基羰基O(O104)，苯甲酰新烏頭原堿中苯甲?；江h(huán)上H(H69)、15號(hào)位C-H(H79)與甘草次酸中環(huán)上羰基O(O103)形成氫鍵；同時(shí)，苯甲酰新烏頭原堿與甘草次酸骨架中C、H原子之間產(chǎn)生范德華引力或斥力(如C21-H155、C23-H155、H46-H129、H59-H135、H68-H130、H68-H131、H69-C117等)，這兩方面因素共同導(dǎo)致了復(fù)合物的形成。

注：等值面設(shè)定值0.012圖6 甘草次酸/苯甲酰新烏頭原堿復(fù)合物的幾何優(yōu)化結(jié)構(gòu)圖(a)和分子間δg等值面圖(b)Fig.6 Optimized geometry (a) and intermolecular δg isosurface (b) plots of the enoxolone/benzoylmesaconine complex

3 結(jié)論

本研究采用冷噴霧電離結(jié)合四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜對(duì)四逆湯中7組酸堿復(fù)合物進(jìn)行分析表征。通過一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜分析，證實(shí)了酸堿非共價(jià)復(fù)合物的形成，表明酸堿化合物間的非共價(jià)相互作用力在冷噴霧條件下可得到有效保持。等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)證實(shí)了酸堿化合物間反應(yīng)的自發(fā)性，并且焓變的貢獻(xiàn)大于熵變，表明范德華力和氫鍵等非共價(jià)相互作用是復(fù)合物形成的主要推動(dòng)力。計(jì)算化學(xué)結(jié)果進(jìn)一步顯示，酸堿化合物中的多個(gè)原子共同通過范德華力與氫鍵作用促使復(fù)合物的形成。本研究可為探究四逆湯等中藥復(fù)方水煎液中自沉淀的形成機(jī)制提供技術(shù)參考，為其進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。