謝 潔，易可可，高文靜，劉 浩，李家練，黃澤建，劉梅英，余青霓，王涵文，江 游，戴新華，方 向

(1.中國計(jì)量科學(xué)研究院前沿計(jì)量科學(xué)中心，國家市場監(jiān)管技術(shù)創(chuàng)新中心(質(zhì)譜)，北京 100029；2.常州磐諾儀器有限公司，江蘇 常州 213163；3.安徽礪沐醫(yī)療器械有限公司，安徽 六安 237001)

維生素D(Vitamin D,VD)對于人體健康至關(guān)重要，缺乏VD會導(dǎo)致兒童佝僂病，成人骨質(zhì)減少、骨質(zhì)疏松和骨折等癥狀，而且還與癌癥[1-2]、心血管疾病[3-4]、糖尿病[5]等多種疾病相關(guān)。因此，分析評估人體VD水平至關(guān)重要[6]。VD在肝臟中主要轉(zhuǎn)化為25-羥基維生素D(25-hydroxy vitamin D,25OHD)，因?yàn)槠浜扛哂谄渌x物，且半衰期為2～3周，相對穩(wěn)定，所以25OHD2和25OHD3被認(rèn)為是評價(jià)人體VD水平的可靠指標(biāo)[7]。臨床上，血液循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的25OHD濃度大于20 g/L即為正常[8-11]。由于VD缺乏癥在全世界各年齡組中普遍存在[12]，對VD及其代謝物的分析需求急劇增加，準(zhǔn)確測量人血清中25OHD含量具有重要意義。

在25OHD臨床分析中，液-液萃取[13]操作簡便、結(jié)果較穩(wěn)定，是常用的前處理方法，除此之外，還有固相萃取[14]、分散液-液微萃取[15]等方法。25OHD的檢測方法主要有免疫法、高效液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)。其中，LC-MS/MS具有高準(zhǔn)確度、高靈敏度和高特異性的特點(diǎn)，是國際公認(rèn)的測定25OHD的“金標(biāo)準(zhǔn)”[16-22]。目前，LC-MS/MS主要基于三重四極桿(QqQ)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，該技術(shù)和產(chǎn)品被國外儀器廠商壟斷，并形成系列專利保護(hù)，給國產(chǎn)質(zhì)譜儀器的發(fā)展造成極大阻礙。近年來，杭州聚光科技公司和天津國科公司均開發(fā)了擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的三重四極桿質(zhì)譜技術(shù)和裝置。其中，杭州聚光科技公司研制的Expec-5210型三重四極桿質(zhì)譜儀已用于農(nóng)獸藥殘留、真菌毒素、環(huán)境污染物和臨床標(biāo)記物等樣本的分析[23]；天津國科公司研制的面向臨床檢驗(yàn)的LC-HTQ 2020型液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀已用于人血清中VD檢測，能夠滿足VD臨床檢測的要求[24]。這兩家公司自主研制的儀器先后在2022年和2021年獲批醫(yī)療器械注冊證，對打破國外儀器廠商對國內(nèi)醫(yī)療質(zhì)譜儀器的壟斷，降低醫(yī)療成本支出，推動國產(chǎn)質(zhì)譜儀器的發(fā)展起到積極作用。

離子阱質(zhì)譜具有構(gòu)造簡單、靈敏度高的特點(diǎn)，但存在線性范圍窄、空間電荷效應(yīng)等問題[25-26]，因此，限制了其分析復(fù)雜基質(zhì)樣本中痕量物質(zhì)。為解決該問題，中國計(jì)量科學(xué)研究院-國家市場監(jiān)管技術(shù)創(chuàng)新中心(質(zhì)譜)研發(fā)了一種新型的四極桿-線形離子阱質(zhì)譜裝置與技術(shù)[27]。與三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜的四極桿1-碰撞池-四極桿3的軸向耦聯(lián)技術(shù)不同，該裝置為四極桿-線形離子阱直接軸向耦聯(lián)設(shè)計(jì)，即用單個(gè)線形離子阱代替三重四極桿后端的碰撞池-四極桿3，在保持準(zhǔn)確定量的基礎(chǔ)上精簡了質(zhì)量分析器結(jié)構(gòu)，同時(shí)具有離子阱質(zhì)量分析器的高靈敏度優(yōu)勢，其結(jié)構(gòu)原理示于圖1。該技術(shù)分析原理是通過四極桿篩選目標(biāo)母離子，在線形離子阱中實(shí)現(xiàn)母離子存儲、碎裂，子離子富集、掃描，有效降低了復(fù)雜基質(zhì)中高豐度雜質(zhì)離子對痕量或超痕量目標(biāo)離子的空間電荷干擾，顯著提高了離子阱分析復(fù)雜基質(zhì)樣本的定量能力。在此技術(shù)的基礎(chǔ)上，本團(tuán)隊(duì)研制了QLIT-6610MD液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)的產(chǎn)品樣機(jī)。

本研究采用四極桿-線形離子阱液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測量血清中25OHD，結(jié)合國產(chǎn)試劑盒，建立同位素稀釋質(zhì)譜定量分析方法。經(jīng)方法確證后，開展批量實(shí)際臨床樣本的定量分析研究，并與商品化的三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀的測量結(jié)果進(jìn)行對比，以期為臨床質(zhì)譜分析提供一種新的儀器方案，助力國產(chǎn)質(zhì)譜技術(shù)和應(yīng)用的快速發(fā)展。

圖1 四極桿-線形離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀的結(jié)構(gòu)原理[27]Fig.1 Structural principle of quadrupole-linear ion trap tandem mass spectrometer[27]

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

QLIT-6610MD液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)：安徽礪沐醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；AB 4500MD液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)：美國AB Sciex公司產(chǎn)品；YS EXACT 9900MD高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)、英盛C18色譜柱：山東英盛生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；AL204電子分析天平：瑞士Mettler Toledo公司產(chǎn)品；5804R型高速冷凍離心機(jī)、微量可調(diào)移液器：德國Eppendorf公司產(chǎn)品；KB-5010型渦旋儀：海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；N-EVAP 112MA氮吹儀：美國Organomation公司產(chǎn)品；PM4-1300TD型超聲儀：英國PRIMA公司產(chǎn)品；DGG-9146A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精密試驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；冰箱：韓國LG公司產(chǎn)品；Milli-Q型純水儀：美國Millipore公司產(chǎn)品；0.22 μm尼龍微孔濾膜：天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品； Kinetex C18色譜柱：廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

25OHD2、25OHD3、d6-25OHD2和d3-25OHD3標(biāo)準(zhǔn)品：純度均大于99.9%，德國Dr. Ehrenstorfler GmbH公司產(chǎn)品；25-羥基維生素D測定試劑盒(高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，注冊證號：魯械注準(zhǔn)20212400136)：山東英盛生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈、甲酸、超純水：均為質(zhì)譜級，美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；甲酸銨、乙酸銨、氟化銨：均為質(zhì)譜級，美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。

1.2 溶液配制

1.2.1血清樣本保存與使用 混合人血清樣本量不小于500 μL，并于-80 ℃儲存。為保證樣品在運(yùn)輸過程中的穩(wěn)定性，采用干冰運(yùn)輸，使用前在室溫下平衡1 h。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 準(zhǔn)確稱取1.00 mg 25OHD2或25OHD3標(biāo)準(zhǔn)品，加入0.5 mL甲醇溶解，振蕩混勻。用甲醇稀釋成0.01、0.05、0.1、0.125、0.25、0.5、1、2 mg/L標(biāo)準(zhǔn)品工作液，于-20 ℃避光儲存，可穩(wěn)定保存1個(gè)月。

準(zhǔn)確稱取1.00 mg d6-25OHD2或d3-25OHD3標(biāo)準(zhǔn)品，加入1 mL甲醇溶解，振蕩混勻。用甲醇稀釋成10 mg/L內(nèi)標(biāo)基礎(chǔ)工作液和1 mg/L內(nèi)標(biāo)工作液，于—20 ℃避光儲存，可穩(wěn)定保存3個(gè)月。

1.3 樣品前處理

采用山東英盛生物技術(shù)有限公司“25-羥基維生素D測定試劑盒(高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法)”進(jìn)行樣品前處理，所用的提取液、衍生液、終止液、洗脫液和復(fù)溶液等試劑均由該試劑盒提供。也可以根據(jù)實(shí)際條件采用其他市售有證試劑盒或?qū)嶒?yàn)室自建方法。

取100 μL血清至96孔提取板中，依次加入100 μL提取液A、150 μL內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋振蕩混勻1 min，將上述液體全部轉(zhuǎn)移至96孔過濾板中(配96孔收集板)，靜置5 min。隨后加入1.5 mL提取液C，靜置5 min，洗脫液收集于96孔收集板中，于室溫下氮?dú)獯蹈?流量2 mL/min，約5 min)。將60 μL衍生液加入吹干后的殘?jiān)?，蓋上96孔硅膠墊，50 ℃反應(yīng)30 min，待冷卻后加入40 μL終止液，振蕩1 min，氮?dú)獯蹈?，每孔加?00 μL復(fù)溶液，振蕩混勻2 min。將全部液體轉(zhuǎn)移至96孔進(jìn)樣板中，覆上鋁箔封膜，待測。校準(zhǔn)品、質(zhì)控品的制備過程與樣品一致。

1.4 LC-MS/MS條件

1.4.1QLIT-6610MD 色譜條件： 英盛C18色譜柱(3.0 μm×50 mm×2.1 mm)；流動相為5 mmol/L氟化銨的0.1%甲酸水溶液(A)和5 mmol/L氟化銨的0.1%甲酸甲醇溶液(B)；流速0.5 mL/min；柱溫60 ℃；梯度洗脫程序：0～1 min(60%B)，1～2 min(60%～98%B)，2～3.5 min(98%B)，3.5～4 min(98%～60%B)，4～5 min(60%B)。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子模式，子離子掃描(QTPIS)；電噴霧電壓4 000 V，離子源溫度300 ℃，大氣壓接口溫度400 ℃，鞘氣3.9×105Pa，輔助氣壓力1.6×105Pa，反吹氣壓力1.0×104Pa；離子阱氦氣流速1.0 mL/min。其他質(zhì)譜參數(shù)列于表1。

1.4.2AB 4500MD 色譜條件：Kinetex C18色譜柱(2.6 μm×50 mm×3 mm)；柱溫40 ℃；流動相、流速和梯度洗脫程序同1.4.1節(jié)。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；電噴霧電壓5 500 V，離子源溫度450 ℃，霧化氣壓力4.1 × 105Pa，輔助加熱氣壓力3.4×105Pa，氣簾氣壓力1.4×105Pa，碰撞解離氣壓力6.0×104Pa。其他質(zhì)譜參數(shù)列于表1。

1.4.3YS EXACT 9900MD 色譜條件：英盛C18色譜柱(3.0 μm×50 mm×2.1 mm)；柱溫40 ℃；流動相、流速和梯度洗脫程序同1.4.1節(jié)。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測模式；電噴霧電壓4 300 V，離子源溫度300 ℃，離子傳輸管溫度300 ℃，鞘氣壓力3.4 × 105Pa，輔助氣壓力1.6×105Pa，反吹氣壓力0 Pa，碰撞誘導(dǎo)解離氣壓力0.2 Pa。其他質(zhì)譜參數(shù)列于表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 LC-MS/MS方法的建立

2.1.1液相色譜法的建立 25OHD作為甾體類化合物，具有環(huán)戊烷多氫菲的基本骨架結(jié)構(gòu)。除C、H、O外，甾體類化合物只含有較少的其他原子，因此電離效率低，且電離后表現(xiàn)出較差的、非特征性的碎裂特性。此外，由于存在環(huán)戊烷多氫菲的環(huán)結(jié)構(gòu)，給予一般的碰撞能較難產(chǎn)生碎片，進(jìn)一步增加碰撞能可能產(chǎn)生大量豐度較低的非特征產(chǎn)物離子[28]。甲酸、甲酸銨、乙酸銨是常用的提高ESI電離效率的可揮發(fā)性添加劑。氟化銨通常用于提高負(fù)離子電離效率，有報(bào)道[29-30]在流動相中添加氟化銨以促進(jìn)甾體化合物的正負(fù)電離效率，提升靈敏度。為提高25OHD在電噴霧離子源下的電離效率，本研究比較了在流動相體系下添加不同濃度甲酸、甲酸銨、乙酸銨和氟化銨對25OHD響應(yīng)強(qiáng)度的影響，示于圖2。

注：a.甲酸銨；b.乙酸銨；c.氟化銨；25OHD2、25OHD3、d3-25OHD3濃度為25 μg/L，d6-25OHD2濃度為50 μg/L圖2 不同流動相對25OHD響應(yīng)強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of different mobile phases on 25OHD response intensity

可以看出，與僅添加0.1%甲酸相比，在添加0.1%甲酸的基礎(chǔ)上添加不同揮發(fā)性緩沖鹽可以提高25OHD響應(yīng)強(qiáng)度。具體而言，當(dāng)向流動相中添加0.5～1.0 mmol/L甲酸銨時(shí)，25OHD的響應(yīng)強(qiáng)度提升14.1%～139.6%，而在相同條件下添加乙酸銨和氟化銨時(shí)，響應(yīng)強(qiáng)度分別提升了11.9%～95.6%和90.3%～432.0%。可見，氟化銨對25OHD響應(yīng)強(qiáng)度的提升效果總體高于甲酸銨和乙酸銨。此外，隨著緩沖鹽濃度的增加，響應(yīng)強(qiáng)度提升的效果發(fā)生變化。在向流動相中添加5 mmol/L氟化銨時(shí)，25OHD響應(yīng)強(qiáng)度最高，但當(dāng)添加濃度為10 mmol/L時(shí)，響應(yīng)強(qiáng)度反而顯著下降，這可能是緩沖鹽濃度過高導(dǎo)致的。緩沖鹽在ESI離子源內(nèi)得失電荷的能力往往強(qiáng)于待測物，而在源內(nèi)形成的液滴表面緩沖鹽離子過于密集，與待測物形成競爭，使樣品中待測物離子難以到達(dá)液滴表面從而被輔助氣體蒸發(fā)形成氣相離子，這時(shí)待測物響應(yīng)強(qiáng)度隨緩沖鹽離子濃度的增加而降低。向流動相中添加0.1%甲酸和5 mmol/L氟化銨后，25OHD響應(yīng)強(qiáng)度比僅添加0.1%甲酸時(shí)顯著提高，色譜峰形更尖銳對稱。因此，本研究選擇添加0.1%甲酸和5 mmol/L氟化銨作為流動相。

2.1.2串聯(lián)質(zhì)譜法的建立 為進(jìn)一步提高25OHD的響應(yīng)強(qiáng)度，通過外置注射泵在5 μL/min流動注射模式下優(yōu)化QLIT-6610MD質(zhì)譜條件，依次改變離子源溫度、大氣壓接口溫度、離子透鏡電壓參數(shù)，根據(jù)目標(biāo)子離子的最佳響應(yīng)強(qiáng)度值選擇對應(yīng)的參數(shù)。優(yōu)化后的提取離子色譜圖示于圖3。

在對比的商業(yè)儀器上建立目標(biāo)分析物方法的過程如下：在10 μL/min流動注射狀態(tài)下，通過外置注射泵將標(biāo)準(zhǔn)品或內(nèi)標(biāo)溶液注入質(zhì)譜儀，正離子模式下監(jiān)控母離子和子離子強(qiáng)度，優(yōu)化氣體流速、離子源溫度、去簇電壓、碰撞電壓、透鏡電壓和碰撞能量等關(guān)鍵參數(shù)，使4種化合物在ESI+下獲得最佳的響應(yīng)值。AB 4500MD和YS EXACT 9900MD條件優(yōu)化后的提取離子色譜圖分別示于圖4、5。

注：a.25OHD3；b.25OHD2；c.d3-25OHD3；d.d6-25OHD2圖3 QLIT-6610MD的25OHD提取離子色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatograms of 25OHD by QLIT-6610MD

注：a.25OHD3；b.25OHD2；c.d3-25OHD3；d.d6-250HD2圖4 AB 4500MD的25OHD提取離子色譜圖Fig.4 Extracted ion chromatograms of 25OHD by AB 4500MD

2.2 方法確證

2.2.1線性關(guān)系 以標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)含量的比為橫坐標(biāo)(x)，標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)峰面積的比為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸分析，25OHD2和25OHD3的線性范圍分別為0.78～50 μg/L和1.56～100 μg/L，線性方程分別為y=2.528 9x-0.001 63和y=3.830 15x-0.008 89，決定系數(shù)R2≥0.999 9。

2.2.2精密度 精密度由變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)表示。對低、高質(zhì)控樣品重復(fù)測定6次，連續(xù)測定3天，日內(nèi)和日間精密度列于表2。結(jié)果表明，所有測量結(jié)果均在靶值范圍內(nèi)并接近目標(biāo)值，其中25OHD2和25OHD3的日內(nèi)和日間精密度范圍分別為1.40%～4.06%和0.77%～2.96%。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters

表2 方法確證結(jié)果Table 2 Results of method validation

注：a.25OHD3；b.25OHD2；c.d3-25OHD3；d.d6-25OHD2圖5 YS EXACT 9900MD的25OHD提取離子色譜圖Fig.5 Extracted ion chromatograms of 25OHD by YS EXACT 9900MD

2.2.3準(zhǔn)確度 準(zhǔn)確度由回收率表示。將25OHD2和25OHD3標(biāo)準(zhǔn)品添加至血清樣本中，獲得低、中、高3個(gè)濃度的回收率分析樣本，用未添加標(biāo)準(zhǔn)品的血清作為空白組，每個(gè)濃度測量3組樣本，每組樣本重復(fù)測定3次，結(jié)果列于表2?？梢?，25OHD2的低、中、高濃度樣本回收率分別為108.38%、101.49%和99.25%，CV≤5.10%；25OHD3的低、中、高濃度樣本回收率分別為106.80%、107.01%和104.53%，CV≤3.28%。

2.2.4檢出限和定量限 以3倍信噪比(S/N)作為檢出限(LOD)，10倍信噪比作為定量限(LOQ)，且滿足重復(fù)測定5次峰面積CV≤15%，結(jié)果列于表2。25OHD2和25OHD3的LOD和LOQ分別為0.06、0.02 μg/L和0.12、0.06 μg/L。

2.3 方法驗(yàn)證

使用低、高質(zhì)控品對所建立的方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果列于表3。3臺液質(zhì)聯(lián)用儀檢測的結(jié)果一致，均在靶值范圍內(nèi)，表明所建立的方法準(zhǔn)確、可靠。

2.4 實(shí)際樣本檢測

分別采用自主研制的QLIT-6610MD和有證產(chǎn)品AB 4500MD、YS EXACT 9900MD 3臺液質(zhì)聯(lián)用儀測定50例人血清樣品，結(jié)果示于圖6，25OHD2和25OHD3含量分別在0.12～19.46和6.18～71.23 μg/L范圍內(nèi)。使用Pearson系數(shù)分析數(shù)據(jù)相關(guān)性，結(jié)果列于表4。可見，QLIT-6610MD和AB 4500MD之間的相關(guān)系數(shù)R>0.998 0，并呈現(xiàn)P<0.01，表明兩者之間存在顯著的正相關(guān)。同理，QLIT-6610MD和YS EXACT 9900MD，AB 4500MD和YS EXACT 9900MD之間也存在顯著的相關(guān)性。采用Bland-Altman分析數(shù)據(jù)一致性，結(jié)果示于圖7，3組數(shù)據(jù)界外點(diǎn)數(shù)百分比均≤6%，表明數(shù)據(jù)具有良好的一致性。QLIT-6610MD基于四極桿和線形離子阱直接軸向耦聯(lián)技術(shù)，有效降低了復(fù)雜血清樣本中雜質(zhì)離子對25OHD的干擾，發(fā)揮了離子阱高靈敏的優(yōu)勢，能夠滿足臨床診斷的需求。

表3 質(zhì)控品檢測結(jié)果Table 3 Quantitative results of QC samples

注：a.25OHD2；b.25OHD3圖6 實(shí)際血清樣品的檢測結(jié)果Fig.6 Quantitative results of actual serum samples

表4 檢測結(jié)果相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of quantitative results

圖7 實(shí)際血清樣品的Bland-Altman分析圖Fig.7 Bland-Altman analysis results of actual serum samples

3 結(jié)論

本研究采用自主研制的QLIT-6610MD液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，結(jié)合蛋白沉淀和液-液萃取法，建立了準(zhǔn)確測量血清25OHD的同位素稀釋質(zhì)譜法。使用QLIT-6610MD、AB 4500MD和YS EXACT 9900MD 3臺液質(zhì)聯(lián)用儀測定50例實(shí)際血清樣品，檢出25OHD2和25OHD3含量為0.12～71.23 μg/L。采用Pearson系數(shù)分析實(shí)際血清樣本定量數(shù)據(jù)，3臺儀器所測得的數(shù)據(jù)存在顯著的正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R≥0.998 0，并且呈現(xiàn)出P<0.01顯著性水平。通過Bland-Altman法分析表明，數(shù)據(jù)具有良好一致性。這3臺儀器所測結(jié)果一致，QLIT-6610MD能滿足臨床診斷需求。

QLIT-6610MD基于四極桿和線形離子阱直接軸向耦聯(lián)技術(shù)，能夠大幅減少基質(zhì)離子干擾，使離子阱更有效地檢測目標(biāo)離子，發(fā)揮離子阱高靈敏的離子富集能力。但在同時(shí)檢測多個(gè)目標(biāo)物質(zhì)時(shí)，由于缺乏MRM、中性丟失等特征離子篩選功能，且離子阱受總離子束的限制，目前仍面臨挑戰(zhàn)。鑒于離子阱還具有MSn功能、多解離方法以及小型化等特點(diǎn)，該技術(shù)還有進(jìn)一步提升復(fù)雜基質(zhì)中痕量或超痕量目標(biāo)物測量準(zhǔn)確性的強(qiáng)大潛力，未來可用于同時(shí)滿足高準(zhǔn)確性、高靈敏度、現(xiàn)場快速和低成本的質(zhì)譜監(jiān)測場景。