陳 珊，林 蘭，陳 鈞，劉 櫻*

1.中國(guó)工程物理研究院材料研究所，四川 綿陽(yáng) 621907 2.四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分子醫(yī)學(xué)中心，四川 成都 610041 3.表面物理與化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 江油 621908

引 言

低劑量電離輻射(通常指200 mGy以下)普遍存在于自然和人工環(huán)境中，其細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)相較于高劑量電離輻射更加隱秘、復(fù)雜而多樣[1-2]。低劑量輻射生物效應(yīng)在生物醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有重要的研究意義和應(yīng)用價(jià)值，但目前仍然缺乏理想的低劑量輻射生物標(biāo)志物以及簡(jiǎn)易快速的生物效應(yīng)分析檢測(cè)技術(shù)手段[3]。

拉曼光譜是基于拉曼散射效應(yīng)的分子振動(dòng)光譜，既可以檢測(cè)分子結(jié)構(gòu)的變化，也能夠檢測(cè)分子組成的變化[4-5]。拉曼光譜在生命科學(xué)研究領(lǐng)域有著獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，諸如：高靈敏度，樣本無(wú)需標(biāo)記、無(wú)需復(fù)雜的預(yù)處理，可實(shí)現(xiàn)原位定點(diǎn)檢測(cè)，等等[6]。目前已經(jīng)建立了包括核苷酸、多肽、脂類在內(nèi)的諸多生物分子的拉曼圖譜[7-12]。本文利用共聚焦拉曼光譜技術(shù)研究低劑量X射線輻射對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的影響，探索一種相對(duì)簡(jiǎn)易的、能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)早期低劑量輻射生物學(xué)效應(yīng)的新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)購(gòu)買自攬寶生物(中國(guó)上海)，在含有10%FBS(Hyclone，美國(guó))和1%三抗(Gibco，美國(guó))的DMEM培養(yǎng)基(Biological Industries，以色列)中，于37 ℃，5%CO2的合適濕度中培養(yǎng)。

1.2 X射線輻照

采用X-RAD 320輻照儀(Precision X-Ray Incorporated，美國(guó))和F2濾板(1.5 mm Al+0.25 mm Cu+0.75 mm Sn)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行照射，電壓320 kV，電流2 mA，單次源靶距60 cm，劑量率1.8 mGy·s-1。輻照劑量分別為0(對(duì)照)，100，200和500 mGy。

1.3 樣品制備

將SH-SY5Y細(xì)胞以5×104細(xì)胞/孔的密度接種在6孔板(Corning，美國(guó))中的24 mm圓形玻璃蓋玻片(Solarbio，中國(guó)北京)上，并培養(yǎng)過(guò)夜。輻照后靜置30 min，將細(xì)胞用PBS洗滌一次，并用4%多聚甲醛(Solarbio)固定30 min，然后用PBS洗滌兩次。蓋玻片上的細(xì)胞在檢測(cè)之前存儲(chǔ)在4 ℃。

1.4 光譜采集

拉曼光譜測(cè)量采用自研的共聚焦拉曼光譜設(shè)備進(jìn)行，激發(fā)光波長(zhǎng)為532 nm，激光功率10 mW，使用100×物鏡(NA=0.90)聚焦激光和收集拉曼信號(hào)。設(shè)備已經(jīng)過(guò)氖燈燈線進(jìn)行光譜線性和頻率校正，并進(jìn)一步采用硅和金剛石拉曼信號(hào)進(jìn)行校正。光譜分辨率為3.6 cm-1，連續(xù)采集光譜的信號(hào)重復(fù)性優(yōu)于0.1 cm-1。

每個(gè)拉曼圖譜由3次信號(hào)采集平均而得。每個(gè)樣品采集10～15個(gè)細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞采集細(xì)胞核內(nèi)7～10個(gè)不同位點(diǎn)；由此，每個(gè)樣品采集100多個(gè)圖譜，取其平均用于比較和分析。玻璃蓋玻片的拉曼信號(hào)同樣被采集，并在后續(xù)分析中扣除。

1.5 細(xì)胞周期分析

X射線照射后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)6 h。用胰蛋白酶(普諾賽，中國(guó)武漢)消化后收集細(xì)胞，用PBS洗滌一次，以2 500 r·min-1的速度離心4 min，然后用70%的乙醇固定并在4 ℃孵育過(guò)夜。細(xì)胞周期分析試劑盒(碧云天，中國(guó)江蘇)用于檢測(cè)細(xì)胞周期。細(xì)胞以2 500 r·min-1的速度離心4 min后用PBS洗滌一次，將細(xì)胞沉淀重懸于500 μL染料結(jié)合溶液中，并與RNase A(50 μg·mL-1)和PI(20×)在37 ℃孵育30 min。使用流式細(xì)胞儀(Accuri C6 Plus，BD Biosciences，美國(guó))分析樣品。

1.6 細(xì)胞遷移分析

利用劃痕實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)X射線對(duì)細(xì)胞遷移的抑制。SH-SY5Y細(xì)胞在24孔板(Corning)中培養(yǎng)24 h，然后用10 μL槍頭在匯合的單層細(xì)胞上劃一道，用PBS洗滌劃痕兩次，以除去未貼壁的細(xì)胞碎片，并向每個(gè)孔中加入2 mL新鮮的10%培養(yǎng)基。X射線照射后培養(yǎng)20 h，以100倍放大倍數(shù)在顯微鏡(Mshot，中國(guó)廣州)下拍攝穿過(guò)傷口區(qū)的遷移細(xì)胞。手動(dòng)測(cè)量劃痕面積，計(jì)算20 h后劃痕面積占之前劃痕面積的百分比。比值越大，則遷移水平越低。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次或三次以上生物學(xué)重復(fù)，并計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。單因素方差分析用于成對(duì)數(shù)據(jù)，多因素方差分析用于分析成組數(shù)據(jù)。p<0.05的值被定為具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 拉曼光譜分析顯示輻照后細(xì)胞內(nèi)核苷酸水平變化

圖1顯示的是不同劑量X射線輻照之后的細(xì)胞樣品的拉曼光譜(已扣除玻璃蓋玻片本底信號(hào))?；疑珮?biāo)記的4個(gè)拉曼峰與DNA相關(guān)：725 cm-1(腺嘌呤)[9]、780 cm-1(O—P—O stretching、嘧啶核苷酸)[9-10]、1 093 cm-1(O—P—O stretching)[9, 11-12]、1 580 cm-1(腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤)[9]。我們對(duì)這4個(gè)拉曼特征峰進(jìn)行積分，計(jì)算獲得了相應(yīng)的峰面積，列入表1。X射線輻照過(guò)的細(xì)胞相較于對(duì)照細(xì)胞的4個(gè)拉曼峰面積均有不同程度的增加，提示DNA相關(guān)物質(zhì)的水平可能因電離輻射而升高。

圖1 SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)不同劑量(0，100，200和500 mGy)X射線輻照后的拉曼光譜

表1 峰面積積分結(jié)果

將圖1中三個(gè)輻照劑量的細(xì)胞拉曼圖譜減去未接受輻照的對(duì)照細(xì)胞圖譜，獲得3條差譜(圖2)。圖2中灰色標(biāo)記的拉曼峰均與DNA相關(guān)(表2)，結(jié)果同樣提示DNA水平可能因電離輻射而升高。

表2 已知DNA相關(guān)的拉曼峰[9]

圖2 SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)不同劑量(100，200，500 mGy)X射線輻照后相較于對(duì)照(0 mGy)的拉曼差譜

2.2 細(xì)胞周期分析顯示輻照促進(jìn)細(xì)胞G2期阻滯

SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)X射線照射后繼續(xù)培養(yǎng)6 h之后，檢測(cè)其細(xì)胞周期分布情況。相較于未接受輻照的對(duì)照細(xì)胞，三個(gè)劑量的電離輻射均造成細(xì)胞在G2期停滯(p<0.01)，但三個(gè)劑量之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差別(p>0.05)。細(xì)胞G2期的DNA含量是G1期的2倍，因此細(xì)胞周期分析結(jié)果與拉曼圖譜分析結(jié)果一致，均提示電離輻射引起DNA水平升高。

2.3 細(xì)胞遷移分析顯示輻照影響細(xì)胞遷移水平

細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示電離輻射導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，我們通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)考察輻照后20 h之后SH-SY5Y細(xì)胞增殖和遷移水平(圖4)，印證了之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如圖5所示，相較于未接受輻照的對(duì)照細(xì)胞，三個(gè)劑量的電離輻射均造成細(xì)胞遷移減緩(p<0.01)，但三個(gè)劑量之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差別(p>0.05)。

圖3 SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)不同劑量(0，100，200和500 mGy)X射線輻照后繼續(xù)培養(yǎng)6 h后的細(xì)胞周期分析(n=3，**p<0.01)

圖4 SH-SY5Y細(xì)胞遷移分析的代表性顯微照片

圖5 SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)不同劑量(0，100，200和500 mGy)X射線輻照后繼續(xù)培養(yǎng)20 h后的劃痕面積相較于輻照之前的百分比(n=6，*p<0.01)

3 結(jié) 論

通過(guò)拉曼光譜分析發(fā)現(xiàn)低劑量X射線電離輻射引起人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞DNA水平變化，其結(jié)果與細(xì)胞周期分析和遷移分析的結(jié)果相一致，但檢測(cè)時(shí)間大大提前。拉曼光譜技術(shù)有助于及時(shí)而有效的檢測(cè)低劑量電離輻射的早期細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。