王庚新，張春玲，趙 偉，陳 露，邸鐵濤，張 云，王艷輝，劉海艷

1.貴州中醫(yī)藥大學，貴州 550002；2.貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院

糖 尿 病 潰 瘍（diabetic ulcers，DUs）是 糖 尿 ?。╠iabetes mellitus，DM）的一種慢性并發(fā)癥，屬于慢性難愈性創(chuàng)面[1]。治療不當會導致嚴重的殘疾甚至死亡，使病人的生活質(zhì)量惡化，造成巨大的經(jīng)濟和心理負擔，對個人、家庭和社會造成嚴重威脅[2]。目前，組織工程產(chǎn)品、傷口敷料和傷口自體移植物等新的醫(yī)療輔助用品及治療方法，在糖尿病潰瘍的治療方面取得了一定進展[3]。然而，高昂的治療費用使其臨床廣泛應用受到限制。因此，積極探索新的治療方案，補充現(xiàn)有的治療策略，提高治療效果，減輕病人的經(jīng)濟負擔，是亟待解決的問題。近年來，中醫(yī)藥治療糖尿病潰瘍已被正式納入《中國2 型糖尿病防治指南》和《中國糖尿病足防治指南》[4-5]。與西醫(yī)相比，中醫(yī)多成分、多靶點、多途徑綜合治療糖尿病潰瘍創(chuàng)面，具有毒副作用小、成本低的優(yōu)點[6]。中藥丹黃散是由丹參、大黃、當歸、沒藥、沉香、松香幾味藥物組成的復方散劑，前期研究結(jié)果表明，丹黃散對于糖尿病潰瘍創(chuàng)面有一定的促愈效果，能有效促進病人潰瘍創(chuàng)面上皮生長覆蓋，加速創(chuàng)面愈合，但具體作用機制尚不清楚[7]。細胞中的線粒體可以選擇性地通過自我吞噬的方式將損傷或老化的線粒體清除，以維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，保護細胞正常結(jié)構(gòu)與功能，減少凋亡，又稱線粒體自噬[8]。研究表明，高糖環(huán)境所致的血管內(nèi)皮細胞損傷中，提升PINK1、Parkin 在血管中的表達水平，激活線粒體自噬，可以保護內(nèi)皮細胞功能[9]。鑒于此，推測丹黃散能通過PINK1/Parkin 信號通路介導的線粒體自噬，維持創(chuàng)面細胞線粒體正常結(jié)構(gòu)與功能，促進糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合。本研究以PINK1/Parkin 通路介導的線粒體自噬為靶向，擬通過建立糖尿病潰瘍小鼠模型來探討丹黃散對糖尿病潰瘍創(chuàng)面的促愈機制。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器 蘇木精-伊紅（HE）高清恒定染色液（批 號：BA4232）、Masson 三 色 染 色 液（批 號：BA4079A）、二喹啉甲酸法（BCA）蛋白定量試劑盒（批號：33267）均購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；兔抗小鼠PINK1 單克隆抗體（批號：23274-1-AP）購自Proteintech 公司；兔抗小鼠LC3 多克隆抗體（批號：4108S），購自Coll Signaling 公司；兔抗小鼠β-actin 單克隆抗體（批號：AL1415），購自中杉金橋公司；HHQ-1508R 輪轉(zhuǎn)式切片機（杭州艾普儀器設備有限公司產(chǎn)品）；光學顯微鏡（德國徠卡顯微系統(tǒng)公司產(chǎn)品）；凝膠成像分析儀（美國通用電氣醫(yī)療公司產(chǎn)品）；生物透射電鏡（美國FEI 公司產(chǎn)品）。

1.2 實驗動物 選擇自發(fā)2型糖尿病C57BLKS/Jdb/db小鼠（db/db）18 只（db/db 為自發(fā)2 型糖尿病小鼠），雄性，鼠齡8～9 周，體重42～46 g，無特定病原體（SPF）級別；同遺傳背景的非糖尿病C57BLKS/Jdb/+小鼠（db/m）6 只（db/m 為同遺傳背景的非糖尿病小鼠），鼠齡8 周，體重22～25 g，SPF 級別，均購自常州卡文斯實驗動物有限公司，實驗小鼠飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學動物中心SPF 級動物房，分籠喂養(yǎng)，自由攝食、攝水，房間內(nèi)環(huán)境溫濕度保持在20～25 ℃、40%～60%，光照12 h，黑暗12 h 循環(huán)飼養(yǎng)。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會審批，審批號為：PY2020063。

1.3 實驗用藥 丹黃散為貴州省某三級甲等醫(yī)院科室專家經(jīng)驗方，黔藥制字Z03100240。方中藥物大黃、丹參、當歸、沉香、松香、沒藥均由藥劑科按照2020 年版《中國藥典》標準進行采購，按照比例混合經(jīng)蘇暢超群30B 粉碎機物理粉碎后充分混勻，取得的中藥粉末以能過120 目篩為宜，用60Co 輻照滅菌處理。重組人表皮生長因子凝膠（以下簡稱生長因子凝膠），國藥準字S20020123，購自桂林華諾威基因藥業(yè)有限責任公司，規(guī)格為每支10 g。

1.4 糖尿病潰瘍模型制備 所有小鼠適應性喂養(yǎng)1 周后，使用4%水合氯醛按0.01 mL/g 的劑量給小鼠腹腔注射進行麻醉，使用剃毛器在小鼠背部剃毛備皮，大小為2.0 cm×2.0 cm，消毒背部皮膚后，在無菌操作下使用直徑為0.8 cm 的打孔器在小鼠背部打孔，并在形成創(chuàng)面后的24 h 內(nèi)用50%冰醋酸棉球刺激創(chuàng)口，觀察受冰醋酸刺激后的創(chuàng)口出現(xiàn)壞死、創(chuàng)面潰瘍特征時，則可認為糖尿病潰瘍小鼠造模成功[10-11]。

1.5 分組 采用隨機數(shù)字表法進行分組。以喂養(yǎng)db/db 籠子的序號1～18 作為編號，采用SPSS 軟件創(chuàng)建18 個隨機數(shù)，由小到大排序得序號N，規(guī)定每段隨機排列序號N 對應處理組，N1～N6 為模型組、N7～N12 為生長因子組、N13～N18 為丹黃散組，6 只db/m 小鼠作為空白組。

1.6 創(chuàng)面給藥方法 空白組和模型組不進行藥物干預，用無菌生理鹽水清理創(chuàng)面后用醫(yī)用無菌紗布進行覆蓋，醫(yī)用膠布固定；生長因子組和丹黃散組均以生理鹽水清理創(chuàng)面后，分別用重組人表皮生長因子凝膠和丹黃散均勻地敷于傷口，1 層醫(yī)用無菌紗布覆蓋，醫(yī)用膠布固定，敷藥面積大于創(chuàng)面邊緣1 mm，藥物厚度約為2 mm。每日定時換藥1 次，連續(xù)給藥21 d[12]。

1.7 創(chuàng)面取材方法 分別在用藥干預后第7 天、第14天取材，在無菌操作下剪取小鼠創(chuàng)面創(chuàng)緣組織，分別進行HE 染色、Masson 染色、透射電子顯微鏡觀察和蛋白質(zhì)免疫印跡（western-blot）檢測。

1.8 觀察指標與檢測方法

1.8.1 創(chuàng)面愈合率 采用透明膠帶描記法對造模后第7 天、第14 天、第21 天小鼠創(chuàng)面面積進行描摹，標尺標記，以Image-Pro-Plus 軟件處理分析計算創(chuàng)面愈合率。愈合率=(原始創(chuàng)面面積—未愈合創(chuàng)面面積)÷原始創(chuàng)面面積×100%。

1.8.2 HE 染色 小鼠創(chuàng)緣組織用4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，5 μm 切片。染色：切片脫水后用蘇木精染色5 min，在室溫下用鹽酸乙醇染色3 s。用自來水沖洗30 min 后恢復藍色，用伊紅染色液染色2 min。阿利新藍染色時，切片用阿利新藍染色20 min，后用0.5%高碘酸水溶液氧化10 min，用希夫試劑染色15 min。脫水、透明：70%乙醇10 s→95%乙醇10 s→100%乙醇10 s→二甲苯1、2 各5 min[13]。封片：中性樹膠封固。采用多功能光學顯微鏡觀察創(chuàng)面新生肉芽組織的病理結(jié)構(gòu)。

1.8.3 Masson 染色 小鼠創(chuàng)緣組織用4%多聚甲醛固定24 h，組織切片方法同HE 染色。染色：用維格特鐵蘇木精染色5 min，用1%鹽酸乙醇分化幾秒鐘后，用自來水沖洗30 min，切片變藍。用紫紅酸性品紅溶液染色10 min，磷鉬酸水溶液染色5 min 后，用苯胺藍溶液復染色5 min，1%冰醋酸處理1 min。脫水、透明：90%乙醇3 min→95%乙醇5 min→無水乙醇5 min→二甲苯1、2 各5 min[14]。封片：中性樹膠封固。

1.8.4 超細微結(jié)構(gòu)觀察 將小鼠部分創(chuàng)緣組織，固定于4%戊二醛中，保存于4 ℃冰箱內(nèi)。24 h 后取出按照透射電鏡切片流程進行鋨酸溶液固定、乙醇脫水、包埋、超薄切片機切片、檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾雙染色法染色，晾干后在透射電鏡中觀察[15]。

1.8.5 Western-Blot檢測胞漿型自噬標志物（LC3-Ⅰ）、膜型自噬標志物（LC3-Ⅱ）、PINK1、Parkin 蛋白的表達水平 將小鼠部分創(chuàng)緣組織提取目標蛋白后進行BCA 蛋白濃度檢測，配膠后電泳，轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、加LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、PINK1、Parkin、β-actin的一抗室溫孵育2～3 h，放于 4 ℃冰箱，次日加二抗室溫孵育2 h 后在室內(nèi)使用 ECL 液多次與PVDF 膜正面接觸后，曝光、洗片、拍攝掃描膠片，圖像分析系統(tǒng)分析條帶灰度值[16]。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0 對數(shù)據(jù)進行分析，符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（±s）描述，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著差異法（least significant difference，LSD）。檢驗水準α=0.05，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 4 組創(chuàng)面愈合率比較（見表1）

表1 各組小鼠的創(chuàng)面愈合率比較（±s） 單位：%

表1 各組小鼠的創(chuàng)面愈合率比較（±s） 單位：%

① 與模型組比較，P＜0.05。

組別空白組模型組生長因子組丹黃散組F 值P第21 天92.840±1.727①72.070±1.333 96.210±2.254①98.140±1.791①266.265＜0.001樣本數(shù)6666第7 天23.490±1.101①16.600±1.581 23.470±1.395①25.180±1.788①39.327＜0.001第14 天61.570±1.546①42.890±1.986 62.250±2.186①60.040±1.387①150.901＜0.001

2.2 創(chuàng)面組織HE 染色結(jié)果 研究顯示，皮膚損傷第7 天～第14 天為創(chuàng)面修復高峰期，故對創(chuàng)面病理情況的研究選擇術(shù)后第7 天和第14 天的組織。模型組：造模第7 天時可見許多炎癥細胞浸潤，細胞間質(zhì)疏松，新生毛細血管稀少、肉芽組織較少；第14 天時仍可見炎性細胞浸潤，少量毛細血管形成，成纖維細胞較少，細胞間質(zhì)較疏松，肉芽組織生成不足?？瞻捉M：造模第7天時可見炎癥細胞浸潤，細胞間質(zhì)較為疏松，成纖維細胞、新生毛細血管生成數(shù)量多于模型組，可見少量肉芽組織，表皮開始覆蓋創(chuàng)面；第14 天時炎癥反應減輕，成纖維細胞大量增加，細胞間排列緊密，新生肉芽組織形成明顯增加，表皮覆蓋創(chuàng)面面積較多。生長因子組和丹黃散組：造模第7 天時許多炎癥細胞浸潤，細胞間質(zhì)較為疏松，成纖維細胞、新生毛細血管生成數(shù)量多于模型組，可見少量肉芽組織，表皮開始覆蓋創(chuàng)面；第14 天時炎癥反應減輕，成纖維細胞大量增加，細胞間排列緊密，新生肉芽組織形成明顯增加，表皮覆蓋創(chuàng)面面積較多。見圖1。

圖1 4 組創(chuàng)面組織HE 染色

2.3 Masson 染色結(jié)果 模型組：造模第7 天時創(chuàng)面藍染很淺，膠原纖維形成很少，組織基質(zhì)疏松排列；第14 天時創(chuàng)面藍染仍然較淺，膠原纖維形成較少，組織基質(zhì)疏松排列。空白組：造模第7 天時創(chuàng)面藍染淺，膠原纖維形成少，組織基質(zhì)較為疏松；造模第14 天時創(chuàng)面組織藍染深而多，膠原纖維豐富，組織基質(zhì)緊密排列。生長因子組和丹黃散組：造模第7 天創(chuàng)面藍染淺，膠原纖維形成少，組織較為疏松；造模第14 天時創(chuàng)面藍染深而較多，膠原纖維豐富，組織基質(zhì)排列緊密。見圖2。

圖2 4 組創(chuàng)面組織Masson 染色

2.4 透射電鏡觀察創(chuàng)面組織超微結(jié)構(gòu) 研究顯示，創(chuàng)傷后第7 天為線粒體修復高峰期，故對線粒體的研究選擇第7 天的組織。模型組：創(chuàng)面組織中線粒體呈橢圓形，發(fā)生腫脹，出現(xiàn)空泡化，脊突紊亂或消失，可見少量自噬小體吞噬受損線粒體?？瞻捉M：創(chuàng)面組織中線粒體大多呈線型，有部分輕微腫脹，可見自噬小體吞噬受損線粒體以及與溶酶體融合的受損線粒體。生長因子組和丹黃散組：創(chuàng)面組織中線粒體腫脹情況較輕，線粒體邊緣不規(guī)則，可見自噬小體吞噬受損線粒體。見圖3。

圖3 4 組病人創(chuàng)面組織超細微結(jié)構(gòu)

2.5 線粒體自噬相關蛋白的表達水平（見表2、 圖4）

圖4 小鼠創(chuàng)面LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、PINK1、Parkin 蛋白的表達水平

表2 小鼠創(chuàng)面組織蛋白的表達水平（±s）

表2 小鼠創(chuàng)面組織蛋白的表達水平（±s）

① 與模型組比較，P＜0.05。

組別空白組模型組生長因子組丹黃散組F 值P LC3Ⅱ/LC3Ⅰ0.678 3±0.013 1①0.509 0±0.007 8 0.696 4±0.028 1①0.727 3±0.020 9①131.291＜0.001樣本數(shù)6666 PINK1 蛋白0.834 9±0.054 1①0.555 2±0.032 9 0.767 6±0.038 2①0.919 5±0.050 9①58.620＜0.001 Parkin 蛋白0.716 6±0.016 3①0.528 5±0.020 9 0.711 0±0.027 2①0.762 9±0.031 7①87.422＜0.001

3 討論

糖尿病潰瘍創(chuàng)面屬于慢性難愈性創(chuàng)面，創(chuàng)面愈合是一個復雜的生物學過程。正常創(chuàng)面修復需要經(jīng)歷凝血期、炎癥期、增殖期以及重塑期4 個階段[17]。正常情況下這4 個階段循序漸進，逐步進行。但在高糖環(huán)境下，創(chuàng)面各組成成分由于代謝紊亂、缺氧、缺失營養(yǎng)而受到不同程度的損害，導致創(chuàng)面炎癥期延長，創(chuàng)面愈合延遲[18]。本研究結(jié)果顯示，模型組第7 天時可見大量炎癥細胞浸潤，細胞間質(zhì)疏松，新生毛細血管稀少，肉芽組織較少，膠原纖維形成很少；第14 天時仍可見許多炎性細胞浸潤，少量毛細血管形成，成纖維細胞較少，細胞間質(zhì)較疏松，肉芽組織生成不足，膠原纖維形成較少。提示高糖環(huán)境導致創(chuàng)面炎癥反應加重，向增殖期過度的時間延遲，成纖維細胞增殖減少，新生肉芽組織和血管生成減少。王安宇等[19]發(fā)現(xiàn)，丹黃散可以促進糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合，取病人創(chuàng)面組織進行基因芯片檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白介素-4、白介素-7、白介素-26 基因表達均下調(diào)，表明丹黃散干預后,炎癥因子基因表達下調(diào)，炎癥得以控制。課題組前期使用一種羥甲基殼聚糖制成的海綿負載丹黃散治療糖尿病潰瘍大鼠，Western-Blot 檢測大鼠創(chuàng)面組織發(fā)現(xiàn)超敏C 反應蛋白、白介素-1、白介素-6 炎癥因子表達下調(diào)，表明丹黃散制備的海綿可以減輕創(chuàng)面炎癥反應，促進創(chuàng)面愈合[20]。丹黃散組第14 天時炎癥反應減輕，成纖維細胞大量增加，細胞間排列緊密，新生肉芽組織形成明顯增加，表皮覆蓋創(chuàng)面面積較多，膠原纖維豐富，提示丹黃散有助于降低創(chuàng)面炎癥因子的表達，減輕創(chuàng)面炎癥反應，促進新生血管生長和肉芽組織的形成，加速創(chuàng)面愈合。

線粒體是細胞執(zhí)行正常生物學功能重要的細胞物質(zhì)基礎，維護其基本結(jié)構(gòu)和組織功能正常穩(wěn)定運轉(zhuǎn)對于保護細胞得以生存至關重要[21]。線粒體自噬是維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的關鍵，其可維持線粒體數(shù)目及功能穩(wěn)定，保證細胞功能正常執(zhí)行[22]。異常線粒體能夠釋放大量活性氧和凋亡因子，并通過眾多途徑導致細胞損傷或凋亡。因此，線粒體自噬水平下降勢必會破壞能量穩(wěn)態(tài)[23]。目前，常用LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ蛋白表達比值評估自噬水平，LC3-Ⅱ和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加提示線粒體自噬水平提高[24]。調(diào)節(jié)線粒體自噬的分子途徑有多種，PINK1/Parkin 通路便是其中之一，上調(diào)PINK1、Parkin 蛋白表達，可激活線粒體自噬。PINK1是存在于線粒體外膜的一種蛋白激酶，其在胞質(zhì)中合成后通過線粒體膜分子通道進入線粒體內(nèi)部，最終被線粒體內(nèi)蛋白水解酶降解[25]。線粒體受損會導致內(nèi)膜電位消散，PINK1 跨越外膜向內(nèi)膜轉(zhuǎn)移受阻，避免其被蛋白水解酶降解，最終穩(wěn)定并積累在線粒體外膜上，從而激活存在于細胞漿中的E3 泛素酶Parkin[26]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠創(chuàng)面組織發(fā)生腫脹，出現(xiàn)空泡化，脊突紊亂或消失，電鏡可見少量自噬小體吞噬受損線粒體，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、PINK1、Parkin 的蛋白表達均明顯低于其他組別（P＜0.05），表明高糖環(huán)境可能導致細胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損嚴重，線粒體自噬水平較低。丹黃散組線粒體腫脹情況較輕，可見自噬小體吞噬受損線粒體，創(chuàng)面組織中的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、PINK1、Parkin 蛋白表達均高于模型組，表明丹黃散可上調(diào)小鼠創(chuàng)面組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、PINK1、Parkin 蛋白表達，激活線粒體自噬功能，保護創(chuàng)面細胞線粒體的正常結(jié)構(gòu)和功能。

4 小結(jié)

本研究建立糖尿病潰瘍小鼠模型探討丹黃散促進糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合的相關機制，發(fā)現(xiàn)丹黃散可減輕創(chuàng)面炎癥反應，促使創(chuàng)面由炎癥期向增殖期發(fā)展，上調(diào)PINK1、Parkin 蛋白的表達，激活線粒體自噬保護創(chuàng)面細胞結(jié)構(gòu)及生理功能完整，利于損傷血管修復、重構(gòu)和肉芽組織的生長，有效促進糖尿病小鼠潰瘍創(chuàng)面愈合。本研究選用的通路上下游因子眾多，可以進一步深入開展研究，特別是對于上層基因、下層蛋白的影響可以深入探討，以在今后的工作中進一步開展。