鄭秋樺 黎棟然 潘燁鑫 鄭翼澤 吳京圩

（1.韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005；2.韶關(guān)市綠沃農(nóng)業(yè)科技有限公司，廣東 韶關(guān) 512005）

0 引言

蝴蝶蘭是對(duì)蘭科蝴蝶蘭屬植物的總稱，其花形酷似蝴蝶，典雅細(xì)膩，被譽(yù)為“洋蘭皇后”，深受廣大消費(fèi)者的青睞。蝴蝶蘭是我國(guó)銷售量最高的年宵盆花花卉，也是國(guó)際暢銷的盆花種類［1］。作為單莖性氣生蘭，蝴蝶蘭的自然繁殖相對(duì)較困難，增殖速度也相對(duì)較慢［2］。隨著市場(chǎng)需求的增長(zhǎng)，研究蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)技術(shù)顯得尤為重要［3-6］。

目前，蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)多用瓊脂粉作為固化劑，瓊脂粉由瓊脂糖和瓊脂果膠組成。由瓊脂粉制成的瓊脂具備膠質(zhì)感，色澤由白到微黃，沒有氣味或者有輕微的氣味。瓊脂不含營(yíng)養(yǎng)，不能為植株補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且其本身作為一種固化劑含有對(duì)植物有毒的物質(zhì)；植株生長(zhǎng)過程中，根系深入瓊脂，影響根細(xì)胞呼吸；植物組織在代謝過程中會(huì)產(chǎn)生對(duì)植物有害的物質(zhì)，如果此類物質(zhì)不能及時(shí)排出，將影響植株生長(zhǎng)。由此可見，用固體培養(yǎng)基進(jìn)行組培苗培養(yǎng)存在不少問題，而液體培養(yǎng)可以避免這些問題［7］。但液體培養(yǎng)組培苗需要有支撐物保證組培苗直立、正常生長(zhǎng)，故此次開展基于靜止液體培養(yǎng)法（又稱濾紙橋法），在漂浮培養(yǎng)、淺層液體培養(yǎng)條件下，以聚氨酯海綿作為支撐物的液體懸浮培養(yǎng)試驗(yàn)［7］。

筆者選擇聚氨酯海綿作為支撐物是由于瓊脂粉成本較高，且不能重復(fù)利用，而聚氨酯海綿可以重復(fù)利用。試驗(yàn)以蝴蝶蘭組培苗為試驗(yàn)材料，探究以不同密度聚氨酯海綿為支撐物的條件下，不加瓊脂粉固化，液體懸浮培養(yǎng)對(duì)蝴蝶蘭組培苗生長(zhǎng)的影響。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為蝴蝶蘭增殖階段瓶苗，由英東生物與韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院植物組織培養(yǎng)實(shí)踐教學(xué)提供，品種為寶貝和綠熊。

固體培養(yǎng)基為1/3MS+蔗糖2.0%+蛋白胨0.2%+馬鈴薯粉3.0%+蘋果2.0%+香蕉3.0%+NAA1.0 mg/L+活性炭0.2%，在pH值5.8的條件下加入瓊脂粉0.5%制成固體培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基則不加入瓊脂粉。

每個(gè)聚氨酯海綿模具的直徑為80 mm，厚度為20 mm。以圓心向周邊擴(kuò)散，均勻分布30個(gè)大小一致的孔?？淄ㄟ^高溫加熱金屬棒來熨燙，每個(gè)孔直徑為5 mm、深度為10 mm。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 試驗(yàn)方法。使用500 mL培養(yǎng)瓶，每瓶加入100 mL培養(yǎng)液和聚氨酯海綿模具，蒸汽滅菌后備用。在無(wú)菌條件下的超凈工作臺(tái)，待組培苗長(zhǎng)到2 cm左右，用高溫消毒的鑷子和解剖刀將組培苗剪成單芽，轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基。試驗(yàn)共接種兩個(gè)品種的蝴蝶蘭，每組用高密度聚氨酯海綿（50PPI1）和低密度聚氨酯海綿（25PPI）各重復(fù)2瓶，每瓶接種20個(gè)單芽，共2組，每組接種1瓶固體培養(yǎng)基作為對(duì)照，經(jīng)過接種的培養(yǎng)瓶放在溫室中持續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)室溫度調(diào)整為27 ℃，光照度1 500～2 500 lx，每天光照12 h，持續(xù)培養(yǎng)30 d。

1.2.2 試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)。30 d后觀察記錄試驗(yàn)組和對(duì)照組的平均生根情況及幼苗長(zhǎng)勢(shì)，并分別對(duì)組培苗的根長(zhǎng)度、根質(zhì)量、植株高度和單株鮮質(zhì)量（除根）進(jìn)行測(cè)定，采用單因素方差分析法分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)蝴蝶蘭組培苗生長(zhǎng)的影響

在不同培養(yǎng)基下，蝴蝶蘭寶貝和蝴蝶蘭綠熊的形態(tài)不一（見圖1和圖2）。在聚氨酯海綿液體懸浮培養(yǎng)體系下，蝴蝶蘭組培苗葉片翠綠、直立挺拔、根系粗壯。在固體培養(yǎng)基下，蝴蝶蘭組培苗部分葉片枯萎、根系細(xì)長(zhǎng)。結(jié)果表明，對(duì)于蝴蝶蘭組培苗的培育，液體懸浮培養(yǎng)要優(yōu)于固體培養(yǎng)。

圖1 蝴蝶蘭寶貝在不同培養(yǎng)體系中生長(zhǎng)狀況對(duì)照

圖2 蝴蝶蘭綠熊在不同培養(yǎng)體系中生長(zhǎng)狀況對(duì)照

2.2 不同密度聚氨酯海綿對(duì)蝴蝶蘭組培苗生長(zhǎng)的影響

2.2.1 組培苗的生長(zhǎng)情況。在短周期培養(yǎng)30 d的情況下，聚氨酯海綿液體懸浮培養(yǎng)體系和固體對(duì)照組的生根率都達(dá)到100%，而且根的平均長(zhǎng)度相差不多，但是根質(zhì)量和單株鮮質(zhì)量（除根）存在明顯差別。由表1和表2可知，高密度聚氨酯海綿液體懸浮培養(yǎng)蝴蝶蘭效果更佳。

表1 蝴蝶蘭寶貝組培苗的生長(zhǎng)情況

表2 蝴蝶蘭綠熊組培苗的生長(zhǎng)情況

2.2.2 單因素方差分析。通過方差分析，盡可能減小試驗(yàn)誤差。由表3可知，蝴蝶蘭寶貝的根質(zhì)量單因素方差分析，組間P值＜0.05，拒絕原假設(shè)，證明培養(yǎng)基類型對(duì)于其根質(zhì)量有顯著影響。由表4可知，蝴蝶蘭寶貝的單株鮮質(zhì)量單因素方差分析，P值＜0.05，拒絕原假設(shè)，培養(yǎng)基類型對(duì)其單株鮮質(zhì)量顯著影響。由表5綠熊根質(zhì)量單因素方差分析可知，P值＜0.05，拒絕原假設(shè)，說明培養(yǎng)基類型對(duì)植株根質(zhì)量有顯著影響。由表6綠熊單株鮮質(zhì)量單因素方差分析可知，P值＜0.05，拒絕原假設(shè)，因此可判斷培養(yǎng)基類型對(duì)植株單株鮮質(zhì)量有顯著影響。

表3 單因素方差分析（寶貝根質(zhì)量）

表4 單因素方差分析（寶貝單株鮮質(zhì)量）

表5 單因素方差分析（綠熊根質(zhì)量）

表6 單因素方差分析（綠熊單株鮮質(zhì)量）

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)表明，在30 d的短周期培養(yǎng)中，聚氨酯海綿液體懸浮培養(yǎng)能夠有效提高蝴蝶蘭根質(zhì)量和植株質(zhì)量，且高密度聚氨酯海綿的效果更佳。在固體培養(yǎng)基中，由于接種操作不當(dāng)或組培苗本身因重力作用，接種時(shí)或是接種后不久，組培苗可能會(huì)下陷沒入培養(yǎng)基，缺氧致死的情況常有發(fā)生，培養(yǎng)基在后期也會(huì)出現(xiàn)因組培苗代謝產(chǎn)物聚集變黑的情況。而在液體懸浮培養(yǎng)體系中，雖然水分比較充足，但因?yàn)橛芯郯滨ズ＞d作為支撐物，并不會(huì)出現(xiàn)接種苗因不能進(jìn)行呼吸作用而死亡的現(xiàn)象。液體培養(yǎng)與固體培養(yǎng)對(duì)比，具有操作簡(jiǎn)單方便、成本低的優(yōu)點(diǎn)，且液體培養(yǎng)更有利于培養(yǎng)材料對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收［8］。

聚氨酯液體懸浮培養(yǎng)體系對(duì)于蝴蝶蘭組培苗的壯苗效果要明顯優(yōu)于固體培養(yǎng)基。在液體懸浮培養(yǎng)體系中，效果最佳時(shí)，蝴蝶蘭寶貝的根質(zhì)量是固體對(duì)照組的1.53倍，單株鮮質(zhì)量（除根）則是固體對(duì)照組的1.70倍；同樣，蝴蝶蘭綠熊根質(zhì)量是固體對(duì)照組的1.49倍，單株鮮質(zhì)量（除根）則是固體對(duì)照組的1.38倍。試驗(yàn)結(jié)果表明，在以高密度聚氨酯海綿作為支撐物的培養(yǎng)基中，組培苗的高度比以低密度聚氨酯海綿作為支撐物的培養(yǎng)基培養(yǎng)的植株高。在低密度聚氨酯海綿中生長(zhǎng)的組培苗，生根時(shí)易插入海綿的孔徑中（見圖3），對(duì)組培苗移出增加了難度，易造成根部損傷，用力過度時(shí)根部會(huì)斷在海綿孔徑中，使用高密度的聚氨酯海綿則不易出現(xiàn)以上情況。綜上所述，用高密度的聚氨酯海綿作為支撐物進(jìn)行組培苗培養(yǎng)效果更佳。

圖3 蝴蝶蘭組培苗生根插入低密度海綿孔徑

此次試驗(yàn)旨在建立一個(gè)穩(wěn)定、操作方便且低成本的蝴蝶蘭組培苗液體培養(yǎng)系統(tǒng)，但在試驗(yàn)過程中，筆者發(fā)現(xiàn)存在以下幾個(gè)問題。一是試驗(yàn)所用的聚氨酯海綿模均為人工制模，耗時(shí)時(shí)間長(zhǎng)，且模具打的每個(gè)孔會(huì)受人為因素影響存在差異，因此需要解決如何批量制模且保證制作的模具大小一致的問題。二是試驗(yàn)中，部分蝴蝶蘭組培苗根莖在生長(zhǎng)時(shí)插入聚氨酯海綿里，組培苗與海綿模具交纏在一起，導(dǎo)致其不能被拔出，用力過度時(shí)，蝴蝶蘭組培苗根莖會(huì)斷裂在聚氨酯海綿里。該現(xiàn)象一般在低密度的聚氨酯海綿中發(fā)生，正確選擇模具（高密度聚氨酯海綿）能幫助避免出現(xiàn)此類問題。