崔美玉, 耿麗華, 張全斌

轉(zhuǎn)錄組和蛋白組分析海帶褐藻多糖硫酸酯對RAW 264.7細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用

崔美玉1, 2, 3, 耿麗華1, 2, 張全斌1, 2

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所, 實驗海洋生物學(xué)重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室, 海洋生物與生物技術(shù)功能實驗室, 山東 青島 266237; 3. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

海帶()是我國的主要經(jīng)濟(jì)褐藻, 從海帶中制備的褐藻多糖硫酸酯具有免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性, 但鮮有基于組學(xué)的研究報道。本文采用RNA高通量測序(RNA-sequencing, RNA-seq)轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)以及平行反應(yīng)監(jiān)測(Parallel Reaction Monitoring, PRM)靶向定量蛋白組學(xué)方法, 探究海帶褐藻多糖硫酸酯作用于小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7后對巨噬細(xì)胞功能和通路的影響。結(jié)果表明, 褐藻多糖硫酸酯(100 μg/mL)作用于RAW 264.7細(xì)胞后, 差異表達(dá)基因主要富集在免疫反應(yīng)、先天性免疫應(yīng)答等生物過程以及TNF、NF-κB、Toll樣受體等信號通路, 也可促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞膜蛋白A類清道夫受體(SR-A)中SCARA3和Toll樣受體中TLR4的表達(dá)。采用流式細(xì)胞儀對褐藻多糖硫酸酯作用后SR-A和TLR4的表達(dá)量進(jìn)行蛋白水平的驗證, SR-A和TLR4的表達(dá)量均有升高, 證實了組學(xué)結(jié)果的可靠性。本研究結(jié)果為利用褐藻多糖硫酸酯開發(fā)具有免疫調(diào)節(jié)作用的功能食品或藥物提供依據(jù)。

褐藻多糖硫酸酯; 巨噬細(xì)胞; 免疫調(diào)節(jié); 轉(zhuǎn)錄組; 蛋白組

免疫系統(tǒng)是機(jī)體進(jìn)行免疫應(yīng)答和發(fā)揮免疫功能的重要系統(tǒng), 可以發(fā)現(xiàn)并有效阻止病原體入侵清除病原微生物。巨噬細(xì)胞作為一種先天性免疫細(xì)胞, 在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[1], 在非特異性免疫中, 巨噬細(xì)胞通過吞噬作用直接清除病原體等有害物質(zhì)并介導(dǎo)炎癥反應(yīng); 在特異性免疫中, 巨噬細(xì)胞作為抗原呈遞細(xì)胞, 識別病原體相關(guān)分子模式, 將抗原性異物呈遞給T細(xì)胞或B細(xì)胞, 激活機(jī)體的免疫應(yīng)答。巨噬細(xì)胞功能的發(fā)揮與其表面模式識別受體密不可分, 其中, Toll樣受體和清道夫受體是廣泛存在于巨噬細(xì)胞表面的宿主防御系統(tǒng)的關(guān)鍵模式識別受體, 對先天性免疫系統(tǒng)識別病原體至關(guān)重要, 并介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)[2-3]。

海帶作為一種大型經(jīng)濟(jì)藻類, 含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)。從海帶中制備的褐藻多糖硫酸酯(fucoidan, FPS)是海洋褐藻特有的一類含有巖藻糖的硫酸化多糖, 主要由巖藻糖和半乳糖組成, 也含有一定量的甘露糖、木糖等其他單糖[4]。研究表明褐藻多糖硫酸酯具有多種生物活性, 包括抗炎[5]、免疫刺激[6]、抗氧化[4]和抗凝血[7]以及神經(jīng)保護(hù)等活性[8]。褐藻多糖硫酸酯可激活巨噬細(xì)胞, 提高巨噬細(xì)胞中一氧化氮(nitric oxide, NO)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, iNOS)的表達(dá), 以及白介素-6(Inter-leu-kin 6, IL-6)、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)等細(xì)胞因子的生成[9-11]。而且, 褐藻多糖硫酸酯促進(jìn)NO和iNOS的表達(dá), 引起的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng), 可能是通過清道夫受體介導(dǎo)的[11]。同時, 也有研究表明褐藻多糖硫酸酯也能通過激活TLR4, 顯著增強RAW 264.7細(xì)胞的活性, 誘導(dǎo)NO、IL-6和TNF-α的表達(dá)[10]。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是在某一生理條件下, 細(xì)胞內(nèi)所有細(xì)胞轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的總和。檢測在轉(zhuǎn)錄組中基因表達(dá)的上調(diào)和下調(diào)能夠特異性地說明藥物在該過程中所發(fā)揮的生物功能, 有利于探究基因變化背后的機(jī)制。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)具有高通量、高準(zhǔn)確性、高靈敏度等優(yōu)勢[12], 目前在免疫學(xué)領(lǐng)域被廣為應(yīng)用, 但欲進(jìn)行精確的生物學(xué)研究, 仍需蛋白組學(xué)的支持。PRM蛋白質(zhì)組學(xué)是不依賴于抗體、基于質(zhì)譜的靶向蛋白精準(zhǔn)定量技術(shù)[13], 具有高分辨和高精度的特點?；赑RM靶向定量蛋白組學(xué), 我們可以通過選取模式識別受體特定的目標(biāo)肽段直接進(jìn)行相對定量檢測。

目前, 海帶來源褐藻多糖硫酸酯免疫調(diào)節(jié)活性的研究大多是從細(xì)胞和動物水平上展開的, 但由于人體是一個相對較復(fù)雜的系統(tǒng), 當(dāng)受到外部刺激時, 多種組織、器官以及細(xì)胞之間相互作用, 共同調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能的變化。因此, 在本研究中采用RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組學(xué)和PRM靶向定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù), 從整體上探究從海帶中制備的褐藻多糖硫酸酯作用于小鼠巨噬細(xì)胞后, 巨噬細(xì)胞功能的變化以及具體模式識別受體的表達(dá)情況, 期望為利用海帶開發(fā)具有免疫調(diào)節(jié)作用的功能食品或藥物提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

海帶樣品來源于山東榮成, 褐藻多糖硫酸酯制備方法參照實驗室之前的方法[4], 其巖藻糖含量為29.12%, 硫酸基含量為33.01%, 糖醛酸含量為1.93%, 還含有一定量的半乳糖、甘露糖和葡萄糖等。

低密度脂蛋白(LDL)、1, 1’-雙十八酯基-3, 3, 3, 3, 四甲基-吲哚碳菁高氯酸鹽標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?DiI-Ac-LDL)、乙?；兔芏戎鞍?Ac-LDL)、PBS緩沖液(PBS)購自北京索萊寶公司; RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司; 胎牛血清(Gibico)購自美國賽默飛公司; 脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)購自上海源葉; 二甲亞砜(DMSO)、噻唑藍(lán)3-(4, 5- dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazo-lium bromide, MTT)購自美國Sigma公司; ELISA試劑盒購自武漢博士德公司; TLR4/PE(貨號: 12-9041-80)購自美國eBioscience; SR-A/PE(貨號: ab275707)購自美國Abcam。

1.2 褐藻多糖硫酸酯作用于RAW 264.7后細(xì)胞活力和NO、細(xì)胞因子的表達(dá)

NO表達(dá): 將RAW 264.7細(xì)胞按照1×104個/孔的密度接種于96孔板, 每孔加入培養(yǎng)基100 μL。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至密度60%～80%時, 加入FPS(25, 50, 100和 200 μg/mL), 以LPS(1 μg/mL)作為陽性對照組, CON空白對照組不做任何處理, 每組設(shè)置3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后, 每孔吸取上清液50 μL, 加入至新的96孔板, 再分別各加入50 μL Griess試劑I和Griess試劑II, 搖勻后使用多功能酶標(biāo)儀, 在540 nm吸光度下檢測吸光值。以NaNO2做標(biāo)準(zhǔn)曲線, 計算對照組以及處理組的NO含量。

細(xì)胞活力: 細(xì)胞加藥處理同上, 當(dāng)給藥后培養(yǎng)24 h后, 每孔加入10 μL的MTT溶液(5 mg/mL)。在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后, 輕輕吸棄上清液, 加入150 μL DMSO后, 在搖床上搖晃5 min, 充分溶解結(jié)晶后, 使用多功能酶標(biāo)儀, 在490 nm吸光度下檢測吸光值。把空白對照組的細(xì)胞活力定為100%, 處理組的細(xì)胞活力相對于空白對照組計算。

ELISA檢測細(xì)胞因子表達(dá): 根據(jù)NO實驗篩選出FPS的最佳濃度進(jìn)行后續(xù)實驗, 細(xì)胞加藥處理同上。給藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 h, 小心收集上清液, 轉(zhuǎn)移至0.5 mL EP管中, 在4 ℃, 220′離心25 min后吸取上清液, 置于?20 ℃保存, 采用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α。

1.3 褐藻多糖硫酸酯作用于RAW 264.7后細(xì)胞總RNA的提取

將RAW 264.7細(xì)胞按照1×105個/孔的密度接種于24孔板中, 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%～80%時, 加入FPS (100 μg/mL)或LPS(1 μg/mL), 同時設(shè)置空白組, 每組設(shè)置3個復(fù)孔。在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育3 h后, 取出至冰上。棄掉培養(yǎng)基, 迅速用預(yù)冷的PBS清洗3次細(xì)胞后, 加入1 mL Trizol裂解液, 迅速用細(xì)胞刮刀輕輕將細(xì)胞刮至一側(cè), 輕輕吹打混勻至形成清亮透明的液體, 轉(zhuǎn)移至無酶管中, 放于?80 ℃冰箱中保存待測。

1.4 轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建和測序

小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7真核轉(zhuǎn)錄組文庫交由拜譜生物科技有限公司(中國, 上海)構(gòu)建。采用Oligo (dT)磁珠, 從總RNA中富集帶有多聚腺苷酸(polya-denylic acid, polyA)的mRNA, 使用離子打斷方式, 將RNA打斷成長度為300 bp左右的片段。以這些mRNA片段為模板, 使用逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)六堿基引物合成第一條cDNA鏈, 并以第一條cDNA鏈為模板合成第二條cDNA鏈, 再經(jīng)PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫片段的富集, 文庫大小為450 bp。構(gòu)建好的文庫采用Agilent 2100 Bioanalyzer進(jìn)行質(zhì)檢, 根據(jù)文庫所需數(shù)量及有效濃度, 混合含有不同Index序列的文庫, 統(tǒng)一稀釋為2 nmol/L, 通過堿變性后構(gòu)建單鏈文庫。

構(gòu)建好的文庫利用第二代測序技術(shù)(Next-Gene-ration Sequencing, NGS), 采用Illumina測序平臺, 對文庫進(jìn)行雙末端測序(Paired-end, PE)。

1.5 數(shù)據(jù)組裝和基因功能注釋

為確保數(shù)據(jù)的可靠性, 過濾原始下機(jī)數(shù)據(jù)(Raw Data), 得到高質(zhì)量的序列(Clean Data)。過濾的標(biāo)準(zhǔn)為: 除3′端帶接頭的序列以及去掉平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于Q20的Reads。使用Sringtie軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本組裝, 得到的Unigene文庫進(jìn)行下一步分析。采用Blast軟件將Unigene序列與基因本體論聯(lián)合會建立的數(shù)據(jù)庫(Gene Ontology, GO, http://geneontology. org/)、京都基因與基因組百科全書(Kyoto En-cy-clo-pedia of Genes and Genomes, KEGG, http://www. kegg.jp/)、真核生物直系同源蛋白質(zhì)聚類(Evolu-tionary Genealogy of Genes: Non-supervised Ortho-logous Groups, eggNOG, http://eggnog.embl.de/ version_3.0/)、UniProt 知識庫(UniProt Knowledge-base, UniProtID, http://www.uniprot.org/help/uniprotkb)、國際生物化學(xué)會酶學(xué)委員會(Enzyme Commission, EC, http://enzyme.expasy.org/)進(jìn)行比對后, 得到Uni-ge-ne文庫的注釋信息。

1.6 差異表達(dá)基因及功能富集分析

使用Tophat2軟件比對參考基因組信息, 由比對結(jié)果進(jìn)一步計算出每個基因的表達(dá)量, 對樣品進(jìn)一步進(jìn)行表達(dá)差異分析和富集分析。

基因表達(dá)差異分析須同時滿足顯著性<0.05以及表達(dá)差異倍數(shù)|log2(差異表達(dá)倍數(shù))|>1, 即可視為差異表達(dá)基因。為描述基因的分布情況、顯著性以及基因的表達(dá)倍數(shù)差異, 使用ggplots2軟件繪制差異表達(dá)基因的火山圖。并對差異基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析, 其中GO(Gene Ontology)富集可明確其參與的主要分子功能(Molecular Function)、生物學(xué)過程(Biological Process)、和細(xì)胞組分(Cellular Component)。KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集可對基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的基因產(chǎn)物功能及其代謝途徑進(jìn)行分析。

1.7 褐藻多糖硫酸酯作用于RAW 264.7后細(xì)胞總蛋白的提取

將RAW 264.7細(xì)胞按照1 × 105個/孔的密度接種于24孔板中, 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%～80%時, 加入FPS(100 μg/mL)或LPS(1 μg/mL), 同時設(shè)置空白組, 每組設(shè)置3個復(fù)孔。在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育3 h, 取出至冰上。棄掉原培養(yǎng)基, 迅速用預(yù)冷的PBS清洗3次細(xì)胞后, 加入3 mL PBS, 用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞迅速刮取至一側(cè), 并反復(fù)吹打混勻后, 轉(zhuǎn)移至10 mL旋蓋的離心管中, 13 800′離心3 min, 棄掉上層PBS, 將細(xì)胞沉淀迅速轉(zhuǎn)移至液氮中冷凍, 之后放于?80 ℃冰箱保存待測。

1.8 蛋白酶解及定量

取蛋白樣品加入400 μL 8 mol/L尿素, 冰浴中超聲波處理, 在4 ℃, 16 000×下離心20 min后取上清。每個樣品取200 μg, 加入二硫蘇糖醇, 使其終濃度為10 mmol/L, 在37 ℃反應(yīng)1 h, 加入吲哚-3-乙酸, 終濃度為50 mmol/L, 避光條件下反應(yīng)30 min。每個樣品加入胰蛋白酶(酶活1: 50), 于37 ℃反應(yīng)過夜, 定量脫鹽后等量混合。

1.9 LC-PRM/MS分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)富集的主要通路以及巨噬細(xì)胞表面主要的模式識別受體, 選取目標(biāo)蛋白I型A類清道夫受體(MSRE, UniProtKB: P30204)、II型A類清道夫受體(MARCO, UniProtKB: Q60754)、Ⅲ型A類清道夫受體(SCARA3, UniProtKB: Q8C850)、Ⅴ型A類清道夫受體(SCARA5, UniProtKB: Q8K299)Toll樣受體4(TLR4, UniProtKB: Q9QUK6)、Toll樣受體2(TLR2, UniProtKB: Q9QUN7)、Toll樣受體13(TLR13, UniProtKB: Q6R5N8)進(jìn)行PRM靶向定量蛋白組學(xué)研究。

取適量每例樣品的肽段進(jìn)行LC-PRM/MS分析, 使用Easy nLC 1 200納聲流速色譜系分離。緩沖液為A-0.1%甲酸水溶液, B-0.1%甲酸、乙腈和水混合溶液。流速為300 nL/min。肽段分離后用Q-Exactive HFX質(zhì)譜儀(Thermo Scientific)進(jìn)行靶向PRM質(zhì)譜分析。分析時長為60 min, 正離子檢測模式, 母離子的掃描范圍為300～1 500 m/z。一級質(zhì)譜分辨率為70 000 (m/z 200), AGC target為3e6, Maximum IT為200 ms。二級質(zhì)譜全掃描分辨率為17 500 (m/z 200), AGC target為1e6, Maximum IT為100 ms。對得到的質(zhì)譜原始下機(jī)數(shù)據(jù), 使用軟件Skyline 4.1進(jìn)行PRM數(shù)據(jù)分析。

1.10 褐藻多糖硫酸酯作用于RAW 264.7后SR-A和TLR4的表達(dá)

將RAW 264.7細(xì)胞按照1 × 105個/孔的密度接種于12孔板中, 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%～80%時, 每孔分別加入FPS(100 μg/mL)或LPS(1 μg/mL), 同時設(shè)置空白組, 在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后, 棄掉上清, 用PBS清洗細(xì)胞3次, 再用500 μL PBS吹打混勻細(xì)胞, 轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管中, 在100×g下離心5 min。取1×106個細(xì)胞, 用100 μL緩沖液重懸后, 加入Fc受體阻斷劑(每106個細(xì)胞2 μL), 在室溫孵育10～20 min, 離心將Fc受體阻斷劑棄掉。用PBS再清洗一遍細(xì)胞, 分別按照相應(yīng)比例使用抗體孵育緩沖液配制SR-A/PE和TLR4/PE的熒光一抗(每106個細(xì)胞100 μL緩沖液), 輕輕渦旋后, 在4 ℃避光孵育1 h。用PBS清洗3次細(xì)胞, 用500 μL PBS重懸, 經(jīng)篩絹過濾后, 采用BD流式細(xì)胞儀上機(jī)分析, 全程避光, 以防止熒光淬滅。

1.11 褐藻多糖硫酸酯是否與清道夫受體結(jié)合

將RAW 264.7細(xì)胞按照1×105個/孔的密度接種于12孔板中, 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%～80%時, 將DiI- Ac-LDL(10 μg/mL)分別和40倍濃度的DiI-Ac-LDL褐藻多糖硫酸酯(400 μg/mL)、陽性對照Ac-LDL (400 μg/mL)以及陰性對照LDL(400 μg/mL), 分別在冰上共同孵育30 min, 全程避光進(jìn)行。棄掉上清液, 用PBS清洗細(xì)胞3次, 再用500 μL PBS重懸細(xì)胞, 經(jīng)篩絹過濾后, 采用流式細(xì)胞儀(facs aria 2, BD Biosciences)上機(jī)分析。

2 結(jié)果

2.1 褐藻多糖硫酸酯對RAW 264.7的細(xì)胞活力和NO表達(dá)的影響

將濃度分別為25、50、100和200 μg/mL的FPS作用于RAW 264.7細(xì)胞24 h, 如圖1所示, 褐藻多糖硫酸酯作用于細(xì)胞之后均無細(xì)胞毒性, 且都能顯著性地促進(jìn)NO的產(chǎn)生, 當(dāng)FPS在100 μg/mL濃度時, NO的表達(dá)量達(dá)到最高。

2.2 褐藻多糖硫酸酯對RAW 264.7中細(xì)胞因子表達(dá)的影響

采用ELISA法對褐藻多糖硫酸酯(100 μg/mL)作用于RAW 264.7細(xì)胞后, 細(xì)胞因子的表達(dá)檢測結(jié)果如圖2所示, 褐藻多糖硫酸酯可明顯促進(jìn)巨噬細(xì)胞IL-6、IL-1β和TNF-α的表達(dá)。

圖1 褐藻多糖硫酸酯(25、50、100、200 μg/mL)對RAW 264.7的細(xì)胞活力和NO表達(dá)量的影響

注: 以1 μg/mL的LPS作為陽性對照。褐藻多糖硫酸酯作用RAW 264.7細(xì)胞24 h后, 采用MTT法檢測細(xì)胞活力, Griess試劑法檢測NO表達(dá)量。數(shù)據(jù)以獨立實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(樣本數(shù)=3)表示。*表示<0.05, **表示<0.01, ***表示<0.005。

圖2 褐藻多糖硫酸酯(100 μg/mL)對RAW 264.7的細(xì)胞因子表達(dá)的影響

注: 以1 μg/mL的LPS作為陽性對照。褐藻多糖硫酸酯作用RAW 264.7細(xì)胞24 h后, 采用ELISA法檢測細(xì)胞因子表達(dá)。數(shù)據(jù)以獨立實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(樣本數(shù)=5)表示。*表示<0.05, **表示<0.01, ***表示0.005。

2.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

分別從小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7 FPS樣品組、LPS陽性對照組、以及CON未處理組中提取RNA, 每組各3個重復(fù), 一共構(gòu)建了9個轉(zhuǎn)錄組文庫(CON 1, CON 2, CON 3, LPS 1, LPS 2, LPS 3, FPS 1, FPS 2, FPS 3)。樣品經(jīng)過上機(jī)測序后, 得到初始下機(jī)數(shù)據(jù)(raw data), 過濾去除低質(zhì)量的數(shù)據(jù)(reads), 每個文庫保留3 400萬到4 400萬個高質(zhì)量數(shù)據(jù)(clean reads), 且每個文庫中高質(zhì)量數(shù)據(jù)占測序總數(shù)據(jù)的90%以上。Q30(堿基識別準(zhǔn)確率在99.9%以上的堿基所占百分比)均在92%以上, 說明高質(zhì)量數(shù)據(jù)的質(zhì)量較好, 準(zhǔn)確性較高, 滿足后續(xù)實驗分析的要求(表1)。

表1 轉(zhuǎn)錄組RNA測序數(shù)據(jù)質(zhì)量及匹配結(jié)果

使用TopHat2軟件將高質(zhì)量數(shù)據(jù)比對到參考基因組上, 匹配率見表1, 根據(jù)比對結(jié)果, 可知, 選擇的參考基因組合適, 且實驗不存在污染。

2.4 差異表達(dá)基因分析

根據(jù)基因表達(dá)差異分析的結(jié)果(同時滿足表達(dá)差異倍數(shù)|log2(差異表達(dá)倍數(shù))|>1以及顯著性<0.05), 通過繪制差異表達(dá)基因的火山圖(圖3), 可知LPS處理后與CON組相比共有差異表達(dá)基因2 312個, 其中LPS組相對于CON組的差異表達(dá)基因上調(diào)1 095個, 下調(diào)有1 217個; FPS處理后與CON組相比共有差異表達(dá)基因982個, 其中FPS組相對于CON組的差異表達(dá)基因上調(diào)543個, 下調(diào)有439個; FPS處理后與LPS處理后相比共有差異表達(dá)基因848個, 其中FPS組相對于LPS組的差異表達(dá)基因上調(diào)338個, 下調(diào)有510個。

圖3 LPS vs CON, FPS vs CON和FPS vs LPS差異表達(dá)基因火山圖

注: 火山圖的橫坐標(biāo)為log2(差異表達(dá)倍數(shù)), 縱坐標(biāo)為–lg(值)。圖中兩條豎虛線為2倍表達(dá)差異閾值; 橫虛線為=0.05閾值。紅點表示該組上調(diào)基因, 藍(lán)點表示該組下調(diào)基因, 灰點表示非顯著差異表達(dá)基因。

2.5 差異表達(dá)基因的GO富集分析

為研究以上差異表達(dá)基因的功能, 我們使用topGO進(jìn)行GO富集分析, 利用GO功能注釋的差異基因?qū)γ恳粋€功能條目(GO term)的基因列表和基因數(shù)目計算, 通過顯著富集<0.05, 找出差異基因顯著富集的功能條目, 從而確定差異基因主要行使的生物學(xué)功能。

LPS處理組和CON組相比的差異表達(dá)基因(圖4a)與FPS處理組和CON組相比的差異表達(dá)基因(圖4b)的GO功能富集大致相似。在細(xì)胞組分中, 差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞質(zhì)、囊泡、細(xì)胞表面、內(nèi)膜系統(tǒng)、高爾基體等; 在分子功能上, 差異表達(dá)基因主要富集在蛋白結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、酶結(jié)合、信號受體結(jié)合、陰離子結(jié)合、蛋白質(zhì)酪氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性等; 在生物過程上, 差異表達(dá)基因主要富集在免疫系統(tǒng)的過程、對外部生物刺激的反應(yīng)、防御反應(yīng)、免疫反應(yīng)、物種間的相互作用、先天性免疫應(yīng)答等。

2.6 差異表達(dá)基因的KEGG通路分析

以KEGG數(shù)據(jù)庫中的通路(pathway)為單位, 應(yīng)用超幾何檢驗的方法, 通過對通路中富集到的差異基因個數(shù)與注釋到的基因個數(shù)的比值(rich factor, 富集系數(shù))、值校正值(false discovery rate, FDR)和富集到該通路上的基因個數(shù)衡量富集的程度, 找出與整個基因組大背景相比, 差異表達(dá)基因中顯著性富集的通路。差異表達(dá)基因的KEGG通路富集分析氣泡圖如圖5所示, 選取FDR值最小, 即富集最顯著的前20個通路進(jìn)行展示。

LPS處理組和CON組相比的差異表達(dá)基因(圖5a)與FPS處理組和CON組相比的差異表達(dá)基因(圖5b)主要富集的信號通路大致相似。富集在TNF信號通路、NOD樣受體信號通路、NF-κB信號通路、細(xì)胞因子受體相互作用、C型凝集素受體通路、Toll樣受體信號通路等通路, 其中TNF信號通路和NF-κB信號通路富集程度最顯著。

2.7 目標(biāo)蛋白的PRM靶向定量

共對LPS陽性對照組、FPS樣品組以及CON空白對照組提取蛋白, 每組各3個重復(fù), 根據(jù)KEGG富集結(jié)果, 差異基因主要富集在Toll樣受體、TNF和NF-κB通路, 以及巨噬細(xì)胞表面主要模式識別受體為清道夫受體和Toll樣受體, 選取MSRE、MARCO、SCARA5、SCARA3和TLR4、TLR2和TLR13這7個目標(biāo)膜蛋白進(jìn)行了LC-PRM/MS分析, 得到了7個蛋白的2～5個可信肽段, 進(jìn)行PRM靶向定量分析, 根據(jù)每條肽段的子離子峰面積, 對在不同組中的目標(biāo)肽段和蛋白含量進(jìn)行相對定量分析, 結(jié)果如圖6所示。

在選取的7個蛋白中, 當(dāng)LPS作用于巨噬細(xì)胞RAW 264.7后, 清道夫受體中MSRE、MARCO、SCARA3的表達(dá)量顯著升高, Toll樣受體中TLR4、TLR2的表達(dá)量顯著升高; 當(dāng)褐藻多糖硫酸酯作用于巨噬細(xì)胞RAW 264.7后, 清道夫受體中SCARA3的表達(dá)量顯著升高, Toll樣受體中TLR4的表達(dá)量顯著升高。

2.8 褐藻多糖硫酸酯對RAW 264.7中SR-A和TLR4表達(dá)的影響

MSRE、MARCO、SCARA3和SCARA5同屬于A類清道夫受體(SR-A), 但由于目前市面上并無針對具體分類的SR-A制備的熒光一抗, 且PRM靶向蛋白組學(xué)結(jié)果顯示當(dāng)褐藻多糖硫酸酯作用后, SCARA3表達(dá)量升高, 故選取SR-A通用一抗進(jìn)行流式驗證。

采用流式細(xì)胞儀進(jìn)一步檢測褐藻多糖硫酸酯(100 μg/mL)作用于RAW 264.7細(xì)胞后, 模式識別受體SR-A和TLR4的表達(dá)。結(jié)果如圖7所示, 褐藻多糖硫酸酯可以在促進(jìn)SR-A和TLR4的表達(dá), 與蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果相對應(yīng)。

2.9 褐藻多糖硫酸酯競爭結(jié)合清道夫受體

由于SCARA3不參與巨噬細(xì)胞的內(nèi)化作用, 但褐藻多糖硫酸酯作用后其表達(dá)量升高, 故通過競爭結(jié)合實驗, 進(jìn)一步探究褐藻多糖硫酸酯引起SCARA3表達(dá)量升高的原因。

研究表明, Ac-LDL是包括SR-A在內(nèi)的多種清道夫受體的配體[14], 這些清道夫受體參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞對Ac-LDL的內(nèi)化, 其中MSRE和MARCO發(fā)揮主要作用[15]。用熒光DiI標(biāo)記Ac-LDL, 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測褐藻多糖硫酸酯是否與Ac-LDL競爭性結(jié)合清道夫受體。

由圖8可知, Ac-LDL作為清道夫受體的配體, 降低了DiI-Ac-LDL的熒光強度; 而LDL則不能降低DiI-Ac-LDL的熒光強度。FPS同樣不能降低DiI-Ac-LDL的熒光強度, 可知FPS不能與Ac-LDL競爭性結(jié)合SR-A, 不能影響清道夫受體對Ac-LDL的內(nèi)化。

圖4 LPS vs. CON (a)和FPS vs. CON (b)差異表達(dá)基因的GO富集分析柱狀圖

圖5 LPS vs CON和FPS vs CON差異表達(dá)基因的KEGG富集分析氣泡圖

注: 氣泡圖中橫坐標(biāo)富集系數(shù)代表指該通路中富集到的差異基因個數(shù)與注釋到的基因個數(shù)的比值。富集系數(shù)越大, 表示富集的程度越大。FDR取值范圍為0～1, 越接近于零, 表示富集越顯著。

圖6 褐藻多糖硫酸酯(100 μg/mL)對RAW 264.7不同的模式識別受體表達(dá)的影響

注: 以1 μg/mL的LPS作為陽性對照。采用LC-PRM/MS檢測模式識別受體的表達(dá)。數(shù)據(jù)以獨立實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(樣本數(shù)=3)表示。*表示<0.05, **表示<0.01, ***表示<0.005。

3 討論

免疫系統(tǒng)在清除和防御病原體中起到關(guān)鍵作用, 維持著機(jī)體健康。然而, 當(dāng)機(jī)體對病原菌的抵抗能力不足, 機(jī)體免疫系統(tǒng)部分功能受損, 或當(dāng)惡性腫瘤等疾病發(fā)生時, 僅僅依靠人體自身免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用往往是無法應(yīng)對的, 因此免疫增強和免疫調(diào)節(jié)尤為重要。

人體作為一個開放性的復(fù)雜大系統(tǒng), 多種組織、器官及細(xì)胞相互作用、相互聯(lián)系, 共同協(xié)調(diào)對外部刺激的適應(yīng)性反應(yīng)以及進(jìn)行生理功能調(diào)節(jié)。以往單純基于細(xì)胞模型對于免疫調(diào)節(jié)的研究有一定的局限性, 隨著近年來生命科學(xué)的發(fā)展, 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的優(yōu)勢日益顯現(xiàn)[16-17], 可以從整體水平上分析當(dāng)受到免疫刺激時, 細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因富集的生物功能、生物過程和信號通路, 以及定量相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。從宏觀的角度闡述環(huán)境、藥物對細(xì)胞功能的影響, 了解細(xì)胞生命活動的一般規(guī)律。

圖7 褐藻多糖硫酸酯(100 μg/mL)對RAW 264.7細(xì)胞SR-A和TLR4表達(dá)的影響

注: 以1 μg/mL的LPS作為陽性對照。褐藻多糖硫酸酯作用RAW 264.7細(xì)胞24 h后, 采用流式細(xì)胞儀檢測。FlowJo V10軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析, 圖中數(shù)字代表與未處理組相比熒光強度的變化。

圖8 褐藻多糖硫酸酯是否與DiI-Ac-LDL競爭性結(jié)合清道夫受體

注: 加入DiI-Ac-LDL(10 μg/mL), 與褐藻多糖硫酸酯(400 μg/mL)、Ac-LDL(400 μg/mL)(陽性對照)或LDL(400 μg/mL)(陰性對照)分別于冰上避光孵育30 min后, 采用流式細(xì)胞儀檢測。采用FlowJo V10軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析, 圖中的數(shù)字代表與未處理組相比熒光強度的變化。

目前, 海藻多糖的免疫調(diào)節(jié)活性已有一定的研究基礎(chǔ), Nakamura等[11]的研究表明墨角藻來源的褐藻多糖硫酸酯可以顯著提高iNOS和NO的表達(dá), 在100 μg/mL時NO和iNOS的表達(dá)量最高。因此在本實驗中, 我們選取25、50、100和200 μg/mL濃度的褐藻多糖硫酸酯作用于小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7進(jìn)行試驗。通過MTT法檢測其對巨噬細(xì)胞細(xì)胞活力的影響, 結(jié)果表明, 褐藻多糖硫酸酯在200 μg/mL的濃度以內(nèi)對巨噬細(xì)胞RAW 264.7沒有細(xì)胞毒性。而且, 褐藻多糖硫酸酯在此濃度范圍都能顯著促進(jìn)RAW 264.7中NO的產(chǎn)生, 具有良好的免疫調(diào)節(jié)活性, 且在100 μg/mL時, NO的表達(dá)量最高, 免疫刺激活性達(dá)到平臺期, 也能顯著促進(jìn)IL-6、IL-1β和TNF-α的表達(dá)。因此, 在后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組等實驗中, 我們選取100 μg/mL的濃度進(jìn)行實驗。

通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究, 我們發(fā)現(xiàn)在褐藻多糖硫酸酯作用于RAW 264.7細(xì)胞后, 褐藻多糖硫酸酯給藥組相對于正常組的基因表達(dá)存在著顯著的差異, CON組和FPS組之間共有差異表達(dá)基因982個, 其中相對于CON組, FPS組的差異表達(dá)基因上調(diào)的有543個, 下調(diào)的有439個。通過GO富集和KEGG富集結(jié)果, 差異表達(dá)相關(guān)基因主要參與蛋白結(jié)合、離子結(jié)合等信號分子與蛋白的識別結(jié)合過程, 細(xì)胞因子活性、先天性免疫應(yīng)答等免疫調(diào)節(jié)功能發(fā)揮、細(xì)胞因子受體相互作用、TNF信號通路、NF-κB信號通路、Toll樣受體信號通路、C型凝集素受體通路等信號通路傳導(dǎo)過程, 這些信號通路在免疫功能的發(fā)揮上起著不可或缺的作用。當(dāng)褐藻多糖硫酸酯作用于RAW 264.7細(xì)胞后, 通過作用于巨噬細(xì)胞膜表面的某些蛋白, 引起NF-κB、TNF、Toll樣受體等免疫相關(guān)信號通路的變化以及細(xì)胞因子的分泌, 進(jìn)一步引起細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)。

同時, 很多研究將褐藻多糖硫酸酯作用于細(xì)胞之后, 通過具體細(xì)胞實驗也進(jìn)一步佐證了我們的轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果。Ma等[18]表明羊棲菜來源褐藻多糖硫酸酯可引起巨噬細(xì)胞NO、活性氧(reactive oxygen species, ROS)以及細(xì)胞因子的產(chǎn)生, 引起免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)。Peng等[19]提出褐藻多糖硫酸酯復(fù)合物可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌途徑, 促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞的增殖, 增強機(jī)體的非特異性和特異性免疫。Miyazaki等[9]表明來源的褐藻多糖硫酸酯可能是通過與巨噬細(xì)胞膜表面模式識別受體相互作用, 進(jìn)一步激活C型凝集素-1信號通路, 引起NO、TNF-α的表達(dá), 增強巨噬細(xì)胞的免疫功能。

巨噬細(xì)胞免疫功能的發(fā)揮, 與模式識別受體清道夫受體和Toll樣受體能夠啟動巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答機(jī)制密切相關(guān), 因此我們選取清道夫受體SR-A中的MSRE、MARCO、SCARA3和SCARA5以及Toll樣受體中的TLR2, TLR4和TLR13進(jìn)行研究。A類清道夫受體是一種三聚體II型跨膜蛋白, 參與巨噬細(xì)胞復(fù)雜的代謝過程。MSRE在巨噬細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá), 可以識別Ac-LDL、革蘭氏陽性菌和陰性菌等多種配體, 在多種疾病中發(fā)揮作用[15]。MARCO也可以結(jié)合Ac-LDL, 其在結(jié)構(gòu)上與MSRE的不同之處在于它有一個更大的膠原結(jié)構(gòu)域, 缺乏α-螺旋結(jié)構(gòu)域。且MARCO可以與革蘭氏陽性菌和陰性菌相結(jié)合, 在先天性免疫中發(fā)揮作用[20]。SCARA5在結(jié)構(gòu)上與MSRE和MARCO相似, 雖然參與免疫調(diào)節(jié)反應(yīng), 但與其他清道夫受體有著較大差異, 也不參與Ac-LDL的內(nèi)化, 其在抑制腫瘤生長、腫瘤血管的生成方面具有重要作用[21]。SCARA3與其他SR-A不同, 不參與Ac-LDL的內(nèi)化, 其主要功能是保護(hù)細(xì)胞免受活性氧的損傷[22]。Toll樣受體是Ⅰ型跨膜蛋白, 分為胞膜外區(qū), 胞漿區(qū)和跨膜區(qū)三部分, 是免疫系統(tǒng)天然的模式識別受體, 通過識別病原相關(guān)分子模式, 調(diào)控免疫應(yīng)答[23]。TLR4和TLR2位于細(xì)胞膜表面, 在免疫應(yīng)答中相互作用, 通過識別脂蛋白等病原相關(guān)分子模式, 激活下游NF-κB、MAPK信號通路, 調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[10]。TLR13位于細(xì)胞內(nèi)溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上, 近年來的研究表明, TLR13可以識別細(xì)菌內(nèi)的23S核糖體保守序列, 具有免疫識別和調(diào)控的功能[24]。

在后續(xù)LC-PRM/MS對以上7種蛋白的相對定量蛋白組學(xué)研究中, 我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)褐藻多糖硫酸酯作用于巨噬細(xì)胞RAW 264.7后, 可以顯著性促進(jìn)其表面的清道夫受體SR-A中的SCARA3以及Toll樣受體中TLR4的表達(dá), 我們也通過流式對模式識別受體SR-A和TLR4的表達(dá)量進(jìn)行了驗證, 發(fā)現(xiàn)褐藻多糖硫酸酯可以在不同程度上促進(jìn)SR-A和TLR4的表達(dá)。Hsu等[25]發(fā)現(xiàn)墨角藻來源的褐藻多糖硫酸酯通過作用于TLR4, 激活下游ROS依賴的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路, 進(jìn)一步抑制腫瘤活力, 抑制癌細(xì)胞的生長。同樣, 海參來源的褐藻多糖硫酸酯作用于RAW264.7細(xì)胞后, 通過TLR2/4激活NF-κB通路, 進(jìn)一步引起NO、TNF-α和IL-6的表達(dá), 發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[10]。

在進(jìn)行競爭性結(jié)合實驗時, 我們發(fā)現(xiàn)褐藻多糖硫酸酯并不能與Ac-LDL競爭結(jié)合SR-A, 說明褐藻多糖硫酸酯并不能直接與MSRE和MARCO結(jié)合。同時通過流式表征膜蛋白表達(dá)量的結(jié)果, 我們發(fā)現(xiàn)褐藻多糖硫酸酯可以顯著上調(diào)SCARA3的表達(dá), 但是SCARA3不參與巨噬細(xì)胞的內(nèi)化, 不是Ac-LDL的受體, 因此進(jìn)一步佐證了褐藻多糖硫酸酯并不能結(jié)合SR-A。然而, Nakamura等[11]表明Sigma提供的墨角藻來源的褐藻多糖硫酸酯可以通過與SR-A結(jié)合, 激活p38 MAPK通路和NF-κB依賴通路, 誘導(dǎo)iNOS和NO的產(chǎn)生。我們推測, 產(chǎn)生這一差異的主要原因是兩種不同來源的褐藻多糖硫酸酯的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)不同。其中, 墨角藻來源的褐藻多糖硫酸酯含有44.1%的巖藻糖, 26.3%的硫酸基, 主鏈結(jié)構(gòu)為(1→3)和(1→4)連接的α-L-巖藻糖, 且主鏈中每隔兩到三個巖藻糖殘基就會有一個支鏈, 硫酸基取代的位置主要在C-2位和C-3位[26-27]。海帶來源的褐藻多糖硫酸酯含有29.12%的巖藻糖, 33.01%的硫酸基, 主鏈結(jié)構(gòu)主要由(1→3)連接的α-L-巖藻糖組成, 也含有少量的(1→4)連接的α-L-巖藻糖, 支鏈繁多, 主要為巖藻糖或(1→6)連接的半乳糖, 以及相當(dāng)量的其他單糖殘基; 硫酸基取代位置不均一, 可能存在C-2位、C-3位或C-4位, 雙取代的情況常見[4, 28]。因此, 不同來源的褐藻多糖硫酸酯的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)的差異, 導(dǎo)致其與SR-A的結(jié)合情況不同。

此外, 模式識別受體之間的相互作用也可能導(dǎo)致了這一現(xiàn)象的發(fā)生。有研究報道, 褐藻多糖硫酸酯可以通過直接激活TLR4進(jìn)一步引起下游通路的變化[25]。而且, Xu等[29]在研究中發(fā)現(xiàn)TLR2和TLR4介導(dǎo)的p38信號通路可以協(xié)同作用共同調(diào)節(jié)SR-A的水平。Amiel等[30]也表明TLR4介導(dǎo)先天性免疫應(yīng)答, 通過MyD88信號通路, 進(jìn)一步調(diào)控SR-A的吞噬作用。另外, SCARA3與其他A類清道夫受體的作用不同, 主要參與氧化應(yīng)激反應(yīng), 保護(hù)細(xì)胞免受活性氧的侵害[22], SCARA3可能是通過這一途徑使褐藻多糖硫酸酯發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。褐藻多糖硫酸酯是否能與SCARA3直接結(jié)合還需進(jìn)一步驗證。

4 結(jié)論

本文采用組學(xué)技術(shù)首次報道了海帶來源褐藻多糖硫酸酯對巨噬細(xì)胞基因水平的整體調(diào)控情況, 以及對主要膜蛋白的表達(dá)影響。研究結(jié)果表明, 褐藻多糖硫酸酯具有良好的免疫調(diào)節(jié)活性, 可以顯著促進(jìn)NO和細(xì)胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄組共鑒定出差異表達(dá)基因982個, 上調(diào)的差異表達(dá)基因543個, 下調(diào)的差異表達(dá)基因439個, 且這些差異表達(dá)基因主要富集在信號分子與蛋白的識別結(jié)合過程、免疫調(diào)節(jié)功能發(fā)揮以及免疫相關(guān)信號通路的傳導(dǎo)過程。蛋白組學(xué)結(jié)果揭示了褐藻多糖硫酸酯可促進(jìn)巨噬細(xì)胞表面膜蛋白清道夫受體SCARA3和Toll樣受體TLR4的表達(dá), 流式結(jié)果和競爭結(jié)合實驗對其進(jìn)行了佐證。研究結(jié)果為褐藻多糖硫酸酯在免疫調(diào)節(jié)和免疫增強中的應(yīng)用提供了依據(jù)。

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Transcriptomic and proteomic analysis of the immunomodulatory effects of fucoidan extracted fromin RAW 264.7 cells

CUI Mei-yu1, 2, 3, GENG Li-hua1, 2, ZHANG Quan-bin1, 2

(1. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Marine Biology and Biotechnology Laboratory, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China; 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

is a significantly economical brown seaweed found in China, and fucoidan extracted fromhas various biological effects, including immunomodulatory. However, few reports are based on omics.In this study, RNA-Sequencing (RNA-Seq) transcriptome technique and parallel reaction monitoring (PRM) relative quantitative proteomics method were used to investigate the effects of fucoidan on the functions and pathways of RAW 264.7 cells.The results showed that the differentially expressed genes were enriched in biological processes, such as the immune response, innate immune response, TNF, NF-κB, and toll-like receptor signaling pathways. We observed that fucoidan promoted the expression of the scavenger receptor class A member 3 and toll-like receptor 4 in RAW 264.7 cells. The expression levels of SR-A and TLR4 in fucoidan-treated RAW 264.7 were verified by flow cytometry. This showed that the expression levels of SR-A and TLR4 increased, confirming the omics' results reliability. The results of this study provided a theoretical basis for developing functional food products or drugs with the immunomodulatory effects of fucoidan.

fucoidan; macrophage; immunomodulatory; transcriptomics; proteomics

Mar. 4, 2022

R285.5

A

1000-3096(2022)11-0094-13

10.11759/hykx20220304004

2022-03-04;

2022-04-20

山東省重大科技創(chuàng)新工程項目(2019JZZY010818)

[Shandong Province Major Science and Technology Innovation Project, No. 2019JZZY010818]

崔美玉(1997—), 女, 河北滄州人, 碩士研究生, 主要從事海洋生物學(xué)研究, E-mail: 18831293920@163.com; 張全斌(1971—),通信作者, 男, 山東章丘人, 研究員, 主要從事海藻化學(xué)與海洋藥物研究, E-mail: qbzhang@qdio.ac.cn

(本文編輯: 趙衛(wèi)紅)