劉 杰, 薛文萍, 王玉璟, 袁嘉琳, 王 龍, 張德超

一株分離自太平洋卡羅琳深海海山水域NX-5T菌株的多相分類鑒定

劉 杰1, 薛文萍1, 王玉璟1, 袁嘉琳1, 王 龍1, 張德超2, 3, 4

(1. 青島科技大學(xué) 海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院生物工程系, 山東 青島 266042; 2. 中國科學(xué)院海洋研究所, 山東 青島 266071; 3. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 4. 中國科學(xué)院海洋大科學(xué)中心, 山東 青島 266071)

黃桿菌種類多、分布廣, 但從深海海山環(huán)境中發(fā)現(xiàn)黃桿菌新物種的報(bào)道還沒有。2017年我們從西太平洋卡羅琳深海海山水域分離到一株細(xì)菌XN-5T, 經(jīng)16S rRNA基因序列測定表明, 該菌與黃桿菌屬()內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近模式菌株LMG 21915T、LMG 21922T之間的相似性分別為97.5%和97.8%。本研究采用形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征、遺傳特征、脂肪酸和極性脂測定等方法, 對該菌株進(jìn)行了詳細(xì)的多相分類鑒定。結(jié)果表明, XN-5T菌株在16S rRNA 基因系統(tǒng)發(fā)育、生長溫度、淀粉、酪蛋白水解、硝酸鹽還原, 產(chǎn)α-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶, 同化L-阿拉伯糖、D-甘露醇、N-乙酰-氨基葡萄糖、葡萄糖酸鉀, 發(fā)酵蔗糖、阿拉伯糖, 以及脂肪酸、極性脂組成等方面, 均與相近模式菌株有所差異。綜合多相分類鑒定數(shù)據(jù), 我們判定XN-5T菌株為屬內(nèi)的一個(gè)新種, 命名為sp. nov。

太平洋卡羅琳海山; 黃桿菌屬; 多相分類

黃桿菌屬()是擬桿菌門(Bacte-roi-de-tes)、黃桿菌科(Flavobacteriaceae)中的一個(gè)成員, 1923年建屬以來, 先后由Bernardet等[1]、Dong等[2]、Kang等[3]和Kuo等[4]等人進(jìn)行了校正分類和新種補(bǔ)充。該屬細(xì)菌的特征為好氧、革蘭氏陰性、桿狀、不運(yùn)動或滑行運(yùn)動、黃色菌落; 具有甲基萘醌類、磷脂酰乙醇胺等極性脂質(zhì); DNA G+C摩爾百分比為30%～52%[5]。該屬成員分布較廣, 并已經(jīng)從海洋(如海水[6-8]、海洋藻類[9-11]、海洋沉積物[12-13])和南極[14-18]等環(huán)境中分離出來。2017年, 我們從熱帶西太平洋深海海山水域中分離到一株黃桿菌XN-5T。經(jīng)初步16S rRNA基因序列分析, 該菌與關(guān)系最近模式菌株和的序列相似性分別為97.8%和97.5%。在此基礎(chǔ)上, 本研究采用包括傳統(tǒng)形態(tài)特征、生理生化表型特征、脂肪酸和極性脂等化學(xué)特征、以及全基因組信息在內(nèi)的多相分類途徑, 對該菌株進(jìn)行了詳細(xì)的種水平上的分類鑒定。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與菌株分離

樣品為從熱帶西太平洋卡羅琳深海海山(10°48′N, 140°18′E, 水深525 m)周圍收集的海水(“科學(xué)號”科考船2017年海山航次)?，F(xiàn)場取100 μL海水無菌操作涂布在海水瓊脂2216E (MA, Difco)平板培養(yǎng)基上, 并在20 ℃孵育2周; 挑取單菌落在MA平板上劃線純化并鏡檢合格, 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)菌株, 命名為XN-5T菌株。XN-5T菌株可在LB上20 ℃常規(guī)培養(yǎng), 并保藏于–80 ℃超低溫冰箱中(含10%脫脂牛奶的菌懸液)。另外, 從CGMCC保藏中心購買模式菌株CGMCC1.9174T和CGMCC 1.9173T[14]作為本實(shí)驗(yàn)參比菌株, 其培養(yǎng)、保藏條件同上。

1.2 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育

XN-5T菌株的DNA提取與純化參考Sambrook和Russell[19]描述。16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增、克隆和測序按照Zhang等人[20]的方案進(jìn)行。采用EzTaxon-e數(shù)據(jù)庫[21]對16S rRNA基因序列進(jìn)行序列比對。將XN-5T的序列與下載的相關(guān)模式菌株序列, 使用MEGA version 7.0軟件[22]中的Clustal W程序進(jìn)行多序列比對, 然后用MEGA version 7.0的鄰位連接(NJ)[23]、最大似然(ML)和最大簡約(MP)算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。對于NJ、ML和MP算法通過Kimura雙參數(shù)模型[24]計(jì)算遺傳距離。最后通過基于1 000次重復(fù)的Bootstrap分析, 對3種方法生成的系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行評估。

1.3 表型特征測定

革蘭氏染色檢測采用試劑盒(Bio Merieux Gram-stain)。按照東秀珠等[25]方法進(jìn)行硝酸鹽還原、吲哚生產(chǎn)、檸檬酸、甲基紅和Voges-Proskauer實(shí)驗(yàn)。酪蛋白、淀粉、吐溫60、吐溫80、羧甲基纖維素、海藻酸、瓊脂和甲殼素的降解在MA固體平板上添加適當(dāng)?shù)孜镞M(jìn)行測試。用無菌海水中制備DNAase瓊脂進(jìn)行DNA水解試驗(yàn)。厭氧性生長檢測采用厭氧瓶, 并在MA中添加20 mmol/L 硝酸鈉(NaNO3)和10 mmol/L亞硝酸鈉(NaNO2), 25 ℃孵育7 d。

使用API 20E、API 20NE和API ZYM試劑盒(法國bioMérieux), 在20 ℃條件下進(jìn)行生化特性和酶活性測定。API ZYM測試條在20 ℃下接種4 h后進(jìn)行分析, API 20E和API 20NE測試條在20 ℃下接種7 d后進(jìn)行分析。另外, 對XN-5T菌株進(jìn)行4～50 ℃的生長溫度范圍測試; 同時(shí)對其進(jìn)行系列梯度的耐鹽性(0～10% NaCl)與pH(4.0～11.0)生長范圍測試。

1.4 脂肪酸、呼吸醌、極性脂分析

將XN-5T菌株和兩個(gè)參比菌株CGMCC1.9174T和CGMCC 1.9173T分別在TSA(胰蛋白胨15.0 g, 大豆蛋白胨 5.0 g, 氯化鈉5.0 g, 瓊脂15.0 g, 蒸餾水1 000 mL )平板上20 ℃培養(yǎng)4 d后, 從TSA平板刮取菌體。脂肪酸的提取和準(zhǔn)備工作是根據(jù)全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)中的標(biāo)準(zhǔn)方法(MIDI, version 6.1)[26], 并使用數(shù)據(jù)庫TSBA40進(jìn)行脂肪酸組分識別。另外, 根據(jù)Collins[27]方案提取呼吸醌, 并用高效液相色譜(HPLC)分析; 采用甲醇-氯仿法抽提總脂, 采用Tindall[28-29]方法雙向薄層層析分析極性脂成分。

1.5 全基因組分析

XN-5T菌株的基因組測序利用北京諾華基因生物信息學(xué)技術(shù)有限公司的Illumina NovaSeq PE150測序平臺進(jìn)行, 篩選每個(gè)數(shù)據(jù)集的reads, 并使用SOAP denovo組裝高質(zhì)量的配對末端reads。將組裝好的基因組框架圖序列上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫。

使用全基因組序列, 在GGDC網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器(http://ggdc.dsmz.de/)中計(jì)算XN-5T與模式菌株的DNA-DNA雜交值DDH(DNA-DNA hybri-di-zation), 以70%的相似性作為細(xì)菌物種邊界的標(biāo)準(zhǔn)閾值。在EzBioCloud(https://www.ezbiocloud.net/tools)網(wǎng)站, 計(jì)算XN-5T與模式菌株的平均核苷酸一致性(ANI), 建議菌種邊界的95%為閾值?；蚪MDNA的 G+C百分比從全基因組序列中測得。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rRNA基因測序結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育分析

XN-5T菌株的16S rRNA基因序列提交到GenBank/ EMBL/DDBJ, 獲得序列號為MK956925。經(jīng)序列比對后, 用neighbour-joining (NJ)和maximum-likelihood (ML)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

從圖1進(jìn)化樹可以看到, 在屬內(nèi), XN-5T菌株與LMG 21915T、LMG21922T、0533T、Sr25T、AS1.2749T聚為一簇, 其中與LMG 21915T、LMG21922T關(guān)系最近, 16S rRNA基因序列相似性最高, 分別為97.5%和97.8%。

2.2 表型與生理生化特征結(jié)果

在電鏡(JEM-1400, JEOL)下觀察(圖2), XN-5T菌株個(gè)體為短桿狀、無鞭毛, 長0.8～1.7 μm、寬0.3～ 0.5 μm, 25 ℃在PYG培養(yǎng)基(蛋白胨10 g, 酵母粉5 g,葡萄糖1 g, 瓊脂18 g)上生長4 d后, 菌落呈黃色, 表面光滑, 整體凸起的圓形。

經(jīng)測定, 菌株XN-5T為需氧型細(xì)菌, 生長不需要Na+。在PYG培養(yǎng)基上溫度生長范圍是4～30 ℃, 最適生長溫度是在20～25 ℃, 在40 ℃菌株不生長。實(shí)驗(yàn)顯示, 其耐鹽范圍是0～4.5% (w/v)NaCl, 最適生長范圍是0～1% (w/v)NaCl。pH生長范圍是6～9, 最適生長范圍是7～8。

圖1 XN-5T菌株基于16SrRNA基因序列的鄰接法系統(tǒng)進(jìn)化樹

經(jīng)測試, XN-5T菌株為革蘭氏染色陰性、過氧化氫酶陽性且氧化酶陽性。XN-5T菌株能水解七葉苷, 但不能水解吐溫60、吐溫80、酪蛋白、羧甲基纖維素、幾丁質(zhì)、淀粉、尿素、海藻酸鹽和DNA; 硝酸還原、甲基紅、3-羥基丁酮實(shí)驗(yàn)和吲哚產(chǎn)生均為陰性。

在API ZYM體系中, 堿性磷酸酶、酯酶(C4)、酯酶脂肪酶(C8)、亮氨酸芳基胺酶、纈氨酸芳基胺酶、酸性磷酸酶、萘酚- AS -雙磷酸水解酶、N-乙酰-D-氨基葡萄糖實(shí)驗(yàn)陽性; 在API 20NE和20E系統(tǒng)中, 胱氨酸芳基胺酶、β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶弱陽性, 同化D-葡萄糖、D-甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖和D-麥芽糖, 蔗糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)均為陽性; 脂肪酶(C14)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、α-甘露糖苷酶和α-巖藻糖苷酶檢測陰性。色氨酸脫氨酶、精氨酸二水解酶、賴氨酸二水解酶、鳥氨酸二水解酶、H2S的產(chǎn)生、葡萄糖酸鉀、癸酸、己二酸、蘋果酸、檸檬酸三鈉和苯乙酸的同化、肌醇、山梨醇、鼠李糖、蜜二糖和杏仁苷的發(fā)酵均為陰性。

圖2 XN-5T菌體細(xì)胞的透射電鏡觀察(25 ℃、LB中培養(yǎng))

表1顯示, XN-5T菌株在生長溫度、淀粉與酪蛋白水解、硝酸鹽還原, 產(chǎn)α-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶, 同化L-阿拉伯糖、D-甘露醇、N-乙酰-氨基葡萄糖、葡萄糖酸鉀, 以及利用蔗糖、阿拉伯糖產(chǎn)酸等生理生化特征方面, 均與參比菌株.和.有明顯差異。

2.3 脂肪酸測定結(jié)果

XN-5T菌株與參比菌株主要脂肪酸成分及摩爾百分比見表2。

表2數(shù)據(jù)顯示, 主要細(xì)胞脂肪酸為iso-C15: 0, anteiso-C15: 0和綜合特征3 (包括C16: 1ω7c和/或C16: 1ω6c)。

表1 XN-5T菌株與參比菌株F. degerlachei和F. frigoris的主要差別特征

注: +反應(yīng)陽性, –反應(yīng)陰性

2.4 極性脂和醌類測試結(jié)果

圖3顯示的是菌株XN-5T與2個(gè)參比菌株的極性脂雙向薄層層析圖。從圖中可以看出, XN-5T菌株的極性脂主要包含磷脂酰乙醇胺(PE), 3個(gè)未知的氨基脂(AL1-3), 1種不確定的糖脂(GL)和4種未知的極性脂(L1-4)。

另外, 經(jīng)測定菌株XN-5T的醌主要由甲基萘醌MK-6組成。

2.5 全基因組測試結(jié)果

XN-5T菌株的基因組測試結(jié)果表明(DDBJ/ENA/ GenBank登錄號為VOGZ00000000), 其DNA G+C百分比為34.5%。其與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近的兩個(gè)模式菌株.CGMCC 1.9174T和.CGMCC 1.9173T的平均核苷酸一致性(ANI)分別是83.35% 和78.77%, 遠(yuǎn)低于細(xì)菌物種邊界建議的95%閾值(Yoon[30]); 另外, XN-5T菌株與上述兩個(gè)模式菌株的DNA-DNA雜交值isDDH分別是 30.80% 和22.40%, 也遠(yuǎn)低于細(xì)菌物種邊界的建議70%閾值(Meier-Kolthoff[31])。

表2 XN-5T與參比菌株F. degerlachei和F. frigoris的脂肪酸組分與摩爾百分比比較

注: 所有菌株中脂肪酸總量小于1%的脂肪酸沒有顯示出來。Tr, 痕跡(<1%); ND, 沒有檢測到。綜合特征是兩種或三種脂肪酸, 在MIDI系統(tǒng)中不能被GLC分離。綜合特征2包含iso-C16: 1-I和/或C14: 03-OH; 綜合特征3包含C16: 1ω7c和/或C16: 1ω6 c; 綜合特征9包含iso-C17: 1ω9 c和/或C16: 010-methyl。

圖3 XN-5T與參比菌株的極性脂雙向薄層層析圖

注: PE, 磷脂酰乙醇胺: AL1-3, 氨基脂; GL, 未識別的糖脂; L1-4, 未識別的極性脂

3 討論

黃桿菌種類比較多, 分布比較廣。除一般陸地環(huán)境外, 目前已從海洋和南極等極端環(huán)境中分離出來, 但從深海海山環(huán)境中發(fā)現(xiàn)黃桿菌新物種的報(bào)道還沒有。

此次我們針對從西太平洋卡羅琳深海海山水域分離到的XN-5T菌株, 與黃桿菌屬()內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近的模式菌株LMG 21915T、LMG 21922T之間的相似性分別為97.5%和97.8%。該菌為革蘭氏染色陰性、氧化陽性、過氧化陽性、無鞭毛的短桿菌; 其菌落呈黃色、光滑、凸起、周邊圓形; 該菌可在含0～4.5%(w/v) NaCl的培養(yǎng)基中生長(最適0～1%), 生長溫度為4～30 ℃(最適為20～25 ℃), 生長pH為6.0～9.0(最適為pH 7.0～ 8.0); 其主要細(xì)胞脂肪酸為iso-C15: 0、anteiso-C15:0、C16: 1ω7c和/或C16: 1ω6c, 極性脂主要有磷脂酰乙醇胺、3種未知氨基脂和一種不確定的糖脂。醌類主要組成是甲基萘醌MK-6, 該菌株DNA的 G+C摩爾百分比34.5%, 與.CGMCC 1.9174T和.CGMCC 1.9173T的ANI和isDDH也都遠(yuǎn)低于建議的細(xì)菌物種邊界閾值。

4 結(jié)論

根據(jù)以上多相分類測試數(shù)據(jù)及分析, 這株分離自西太平洋卡羅琳深海海山水的XN-5T菌株為黃桿菌屬()內(nèi)的一個(gè)新種, 并命名為sp. nov.?，F(xiàn)該菌株已保藏于中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC 1.17114T)和韓國典型菌種保藏中心(KCTC 72435T)菌種保藏中心。

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Polyphasic taxonomy of strain NX-5Tisolated from the Caroline Seamount waters in the Pacific Ocean

LIU Jie1, XUE Wen-ping1, WANG Yu-jing1, YUAN Jia-lin1, WANG Long1, ZHANG De-chao2, 3, 4

(1. Department of Bioengineering, College of Marine Sciences and Biological Engineering, Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266042, China; 2. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 4. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

spp. are abundant with a wide distribution. However, new species ofhave not been reported from the deep-sea seamount environment. In 2017, we isolated bacterial strain XN-5Tfrom the Caroline Seamount waters of the Western Pacific Ocean. Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequencing showed that strain XN-5Thad the highest 16S rRNA gene sequence similarities with the type strains of.LMG 21922T(97.8%) and.LMG 21915T(97.5%). In this study, we carried out polyphasic taxonomy of strain XN-5T, including morphological observations, physiological and biochemical characteristics, genetic characteristics, fatty acids, and polar lipids. The results showed that strain XN-5Tdiffered in many characteristics from the reference strains, including phylogeny of the 16S rRNA gene, growing temperature, hydrolysis of starch and casein, the nitrate reduction reaction, α-galactosidase, α-glucosidase, β-glucosidase, assimilation of L-arabinose, D-mannitol, N-acetyl-glucosamine and potassium gluconate, fermentation of sucrose and arabinose, and polar lipid and fatty acid composition. Based on the polyphasic taxonomy data, we determined that strain XN-5Tis a new species ofthat we calledsp. nov.

Caroline Seamounts in the Pacific Ocean;; polyphasic taxonomy

Dec. 29, 2020

Q346

A

1000-3096(2022)11-0047-08

10.11759/hykx20201229002

2020-12-29;

2021-01-24

國家科技部基礎(chǔ)性資源調(diào)查項(xiàng)目(2017FY100804)

[the Science & Technology Basic Resources Investigation Program of China, No. 2017FY100804]

劉杰(1963—), 男, 博士, 碩士生導(dǎo)師, 主要從事環(huán)境微生物資源、多樣性與應(yīng)用研究, E-mail: jieliu1301@sina.com.cn; 張德超(1978—),通信作者, E-mail: zhangdechao@qdio.ac.cn

(本文編輯: 楊 悅)