丁 巖 張 英 華克勤

隨著腫瘤診療技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的癌癥患者得以長期存活。腫瘤治療中,大劑量的化學治療和(或)放射治療常常會影響女性的卵巢功能，引起卵巢功能衰竭,導致不育等問題出現(xiàn)，嚴重影響患者的身心健康和社會角色。因此，在積極治療腫瘤的同時，如何有效保存卵巢的生殖生育功能，提高女性腫瘤患者的生殖健康水平，已成為臨床關注熱點。常用的生育力保存方法有胚胎冷凍、卵母細胞冷凍和卵巢組織冷凍。卵巢組織冷凍移植適用于各個年齡段患者，具有易取材、不延誤腫瘤治療等優(yōu)點，因而成為保留癌癥患者生育力的理想方式。目前,全球已有超過3 000例患者進行卵巢組織冷凍，超過130例患者經(jīng)自體移植后成功分娩健康嬰兒[1-3]。卵巢組織冷凍移植后必須重建血管才能恢復血供，在血管再生之前有持續(xù)3～7 d的缺血期，在新血管形成期間也會發(fā)生局部缺血再灌注損傷，這些均可導致移植卵巢組織中始基卵泡的丟失，從而影響其移植后的存活時間[4-5]。研究[6]報道，移植卵巢組織大多在移植后4～5年會再次發(fā)生卵巢功能衰竭。移植完整卵巢在理論上能快速恢復血供，縮短缺血時間，減少缺血性損傷發(fā)生。與卵巢組織相比，完整卵巢包含更多的卵泡池，且能提供卵泡和卵母細胞發(fā)育的正常環(huán)境，可延長卵巢功能維持的時間；另外，完整卵巢移植無需預先予藥物刺激，可以原位移植，提供自然妊娠機會。因此，完整卵巢冷凍移植被認為是一種值得期待的保留和恢復卵巢功能的方法[7-8]。

目前，完整卵巢冷凍移植已經(jīng)在小鼠、大鼠、兔、羊等動物實驗中取得較好效果，陸續(xù)有動物恢復內(nèi)分泌功能并成功分娩的報道。但完整卵巢冷凍仍處于研究初始階段，迄今還沒有靈長類動物甚至人類冷凍移植的報道，動物完整卵巢冷凍后卵泡存活率存在較大差異，恢復率為28%～100%，活產(chǎn)率較低，為11%～29%[7, 9-10]。完整卵巢冷凍移植的主要技術(shù)難點在于充分分布冷凍保護劑(cryopretective agent,CPA)，減少CPA引起的毒性損傷，以及血管內(nèi)形成冰晶。根據(jù)深低溫生物學理論，CPA在導入細胞內(nèi)的同時，細胞內(nèi)的水分向細胞外滲出，進入細胞內(nèi)的CPA理想濃度應呈線性遞增，并能在達到最終濃度后保持平衡。因此，本研究根據(jù)理想曲線設計新的灌注裝置，對傳統(tǒng)灌注方式進行改良，將冷凍復蘇的完整卵巢異體原位移植至去勢大鼠，探討完整卵巢冷凍移植對大鼠內(nèi)分泌功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 30只健康、雌性清潔級Lewis大鼠(8～10周齡，體重180～200 g)購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司，由復旦大學藥學院藥效評價動物實驗中心在標準條件下飼養(yǎng)。動物入室后適應1周，連續(xù)5～7 d行陰道涂片判斷動情周期，選取有規(guī)律動情周期的大鼠作為實驗對象。隨機選取10只大鼠作為完整卵巢供體。選取20只大鼠隨機分為正常對照組和去勢移植組，每組10只。正常對照組大鼠行開關腹假手術(shù)操作；去勢移植組大鼠在雙側(cè)卵巢切除術(shù)后1周，通過血管吻合將冷凍復蘇的完整卵巢進行異體原位移植。本實驗經(jīng)復旦大學藥學院實驗動物倫理委員會批準(批號20150021)。

1.2 實驗方法

1.2.1 完整卵巢的獲取 以1%戊巴比妥鈉溶液(40 mg/kg)行腹腔內(nèi)注射麻醉，仰臥位固定大鼠。沿腹部正中線自劍突至恥骨聯(lián)合逐層剪開并暴露腹腔。在手術(shù)顯微鏡8倍視野下操作，參照Wang等[11]的方法獲取大鼠帶蒂完整卵巢。完全游離下腔靜脈與腹主動脈，分別結(jié)扎左腎動靜脈和椎動靜脈。沿右側(cè)卵巢動靜脈走向自上而下分離腹膜，游離并結(jié)扎卵巢上方韌帶及血管。游離右側(cè)子宮角上段，縫扎子宮角下方動靜脈。于腰血管水平在腹主動脈置入軟硅膠灌洗管，緩慢低壓勻速注入4 ℃肝素化生理鹽水，灌洗至下腔靜脈流出液體轉(zhuǎn)為清亮，至右側(cè)卵巢及子宮角上段呈蒼白色為止。離斷獲取完整卵巢，包括右側(cè)卵巢、輸卵管及子宮上段，以及連接卵巢動靜脈的腹主動脈和下腔靜脈。

1.2.2 完整卵巢改良灌注與冷凍復蘇 根據(jù)深低溫生物學理論，本研究設計了可使不同CPA濃度連續(xù)導入的精準恒流灌注裝置，此裝置主要由2個精密脈沖控制輸液泵和3個容器組成，通過精密脈沖控制輸液泵精準調(diào)節(jié)流速，預先混合CPA后動態(tài)調(diào)控灌注完整卵巢的CPA濃度。整個灌注過程于碎冰上進行，CPA均經(jīng)4 ℃預冷。見圖1。CPA配置方法如下。①0 mol/L CPA：M2培養(yǎng)液+ 10%熱滅活胎牛血清(fetal calf serum, FCS)。②1.5 mol/L CPA：M2培養(yǎng)液+10%FCS+1.5 mol/L二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)+ 0.1 mol/L海藻糖。③3.0 mol/L CPA：M2培養(yǎng)液+10%FCS+3.0 mol/L DMSO+0.2 mol/L海藻糖。

圖1 CPA連續(xù)導入的精準恒流灌注裝置

根據(jù)CPA濃度理想曲線及灌注裝置設計，按照“濃度-時間-流量”物理模型計算數(shù)據(jù)，將帶蒂的完整卵巢轉(zhuǎn)移至自制裝置，容器1中為3.0 mol/L CPA 2.187 5 mL，容器2中為0 mol/L CPA 4.812 5 mL，容器3中為1.5 mol/L CPA 5.000 0 mL浸泡完整卵巢，精密脈沖控制輸液泵1流速為0.15 mL/min，精密脈沖控制輸液泵2流速為0.35 mL/min，使前15 min內(nèi)灌流入完整卵巢的CPA濃度從0 mol/L至1.5 mol/L呈線性遞增，最后以1.5 mol/L濃度平衡5 min。見圖2。

圖2 完整卵巢灌注的濃度-時間-流量曲線

灌注結(jié)束后，將完整卵巢及1.5 mol/L CPA 15 mL轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，置入程序化冷凍儀中進行冷凍。冷凍流程：①起始溫度為0 ℃，以2.0 ℃/min速度降至-7 ℃；②-7 ℃保持10 min以便進行手工植冰；③以0.3 ℃/min速度降至-40 ℃；④以10.0 ℃/min速度降至-120 ℃。冷凍結(jié)束后將離心管迅速置入液氮罐中，保存1周。

復蘇時將離心管從液氮罐中取出，于室溫中以120 r/min，離心半徑25 cm,旋轉(zhuǎn)30 s后，浸入40 ℃水浴中，直至組織完全融解，時間約5 min。按原速率在自制恒流灌注裝置上逆向灌注解融液，使灌注進入完整卵巢的CPA濃度從1.5 mol/L至0 mol/L呈線性遞減15 min，以0 mol/L濃度平衡5 min。去除灌洗管，結(jié)扎腹主動脈下端，修剪后備用。

1.2.3 大鼠卵巢去勢模型建立 去勢移植組大鼠行腹腔內(nèi)注射麻醉后，仰臥位固定，沿下腹部正中線剪開皮膚約3 cm，逐層剪開并暴露腹腔，找到V字型子宮，沿子宮找到卵巢，結(jié)扎并切除雙側(cè)卵巢和上1/3子宮，縫合腹腔。正常對照組大鼠行開關腹手術(shù)，不切除卵巢。

1.2.4 完整卵巢異體原位移植 去勢模型建立后的第7天，行完整卵巢異體原位移植。參照Wang等[11]和Ding等[12]的大鼠完整卵巢冷凍移植方法，將去勢移植組大鼠麻醉后固定，打開腹腔。在手術(shù)顯微鏡10倍視野下操作，使用心耳鉗阻斷左腎靜脈下方的腹主動脈和下腔靜脈長約1.5 cm。將修整后的完整卵巢置于腹主動脈右側(cè)，采用10-0縫線分別行腹主動脈-腹主動脈端側(cè)吻合和下腔靜脈-下腔靜脈端側(cè)吻合。松開心耳鉗開放血流，可見吻合口飽滿無狹窄，腹主動脈殘端有搏動，下腔靜脈殘端充盈，卵巢、子宮上段顏色迅速由蒼白轉(zhuǎn)為紅潤。如吻合口有滲血，可用干棉簽輕輕壓迫吻合口數(shù)分鐘，大多可止血。尋找右側(cè)子宮斷端，切除部分殘端瘢痕組織，采用7-0縫線間斷縫合行子宮-子宮端端吻合。術(shù)后向腹腔內(nèi)注入38 ℃林格注射液1～3 mL，注入頭孢噻肟鈉10 mg。將大鼠置于恒溫平臺上保溫，待其蘇醒后放入鼠籠正常飼養(yǎng)。

1.3 觀測指標

1.3.1 一般情況 去勢模型建立后,每日早上9：00測量大鼠體重，觀察其生命體征、進食、排便和行為變化等。

1.3.2 動情周期檢測 大鼠的動情周期為4～5 d，包括動情前期、動情期、動情后期和動情間期。卵巢去勢模型建立后每日早上9：00取無菌棉簽蘸取少量0.9%氯化鈉溶液，輕輕于大鼠陰道深處順時針旋轉(zhuǎn)數(shù)周，取出后同方向涂抹于載玻片上，室溫中干燥后，以95%乙醇固定，H-E染色后置于光學顯微鏡(簡稱光鏡)下觀察。

1.3.3 激素水平檢測 于移植前、移植后2周、移植后4周分別取大鼠眼眶血，血樣本靜置15 min，3 000 r/min，離心半徑10 cm，離心20 min后，取血清。采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測血清卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、雌二醇、抗米勒管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)水平。

1.3.4 卵巢組織形態(tài)學檢測 于移植后4周處死大鼠，留取卵巢組織置于10%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，H-E染色后于光鏡下觀察，計數(shù)各級卵泡。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠的一般情況 去勢移植組大鼠卵巢去勢模型建立后均存活，一般情況好，進食和排便均正常，活動自如，體重增長量與正常對照組大鼠的差異無統(tǒng)計學意義[(1.55±0.62)g/d比(1.57±0.74)g/d，P>0.05]。移植后大鼠均存活，且在移植后3 d內(nèi)均出現(xiàn)蜷縮狀、活動減少、進食減少、排便減少等表現(xiàn)，去勢移植組大鼠體重顯著低于正常對照組[(197.1±0.8)g比(201.4±0.6)g，P<0.05]；移植第4天后，去勢移植組大鼠活動逐漸增多，進食增多，體重增長量顯著高于正常對照組[(1.56±0.44)g/d 比(1.51±0.52)g/d，P>0.05]。見圖3。

圖3 兩組大鼠建模后的體重變化趨勢

2.2 大鼠動情周期的變化 去勢模型建立后，去勢移植組大鼠動情周期消失，陰道涂片顯示其持續(xù)為動情間期，在移植后(11±2)d出現(xiàn)動情期，恢復正常動情周期；正常對照組大鼠行假手術(shù)操作后，大鼠動情周期均正常。

2.3 大鼠血激素水平的變化 移植前，去勢移植組大鼠的FSH水平顯著高于正常對照組，而LH、雌二醇、AMH水平顯著低于正常對照組(P值均<0.01)。移植后2周，去勢移植組大鼠的FSH水平較移植前顯著降低(P<0.05)，但顯著高于正常對照組(P<0.05)；LH、AMH水平均較移植前顯著升高(P值均<0.05)，但顯著低于正常對照組(P值均<0.05)；雌二醇水平較移植前顯著升高(P<0.05)，與正常對照組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。移植后4周，去勢移植組大鼠FSH水平較移植前顯著降低(P<0.05)，雌二醇、LH、AMH水平較移植前均明顯升高(P值均<0.05)，F(xiàn)SH、LH、雌二醇水平與正常對照組的差異無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)，但AMH水平仍顯著低于正常對照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組大鼠移植前后血激素水平的比較

2.4 大鼠卵巢組織形態(tài)學的變化 去勢移植組大鼠移植后4周，解剖可見移植側(cè)卵巢顏色紅潤，表面點狀突起，子宮瘢痕可見，其中4只大鼠移植卵巢子宮可見不同程度的粘連包裹。見圖4A。光鏡下可見移植卵巢皮質(zhì)內(nèi)各級卵泡和黃體，髓質(zhì)內(nèi)血管形態(tài)正常。見圖4B。去勢移植組卵巢質(zhì)量為(21.81±3.34)mg，正常對照組卵巢質(zhì)量為(25.23±1.13)mg，兩組間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。計數(shù)移植卵巢形態(tài)正常的各級卵泡，去勢移植組大鼠的卵巢始基卵泡、初級卵泡和總卵泡數(shù)均顯著少于正常對照組(P值均<0.05)；次級卵泡、竇卵泡數(shù)量與正常對照組的差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。見表2。

A 箭頭所示為移植側(cè)卵巢，對側(cè)卵巢缺如 B 移植的卵巢組織(H-E染色，×200)

表2 去勢移植大鼠卵巢中形態(tài)正常的各級卵泡數(shù)目

3 討 論

血管吻合的完整卵巢冷凍移植為女性癌癥患者保留長期內(nèi)分泌和生育能力提供了一種值得期待的新方法，具有很好的應用前景。但完整卵巢作為凍存體，體積大，結(jié)構(gòu)復雜，卵巢組織含有干細胞、卵巢細胞、間質(zhì)、血管等不同的組織成分，且卵母細胞和顆粒細胞并非位于毛細血管周圍，因此，完整卵巢的冷凍更加復雜和困難，目前尚無公認、標準的最佳完整卵巢冷凍方案。

采用冷凍灌注技術(shù)可使CPA充分分布到細胞以減少卵泡丟失和血管內(nèi)冰晶形成，在冷凍前通過卵巢動脈插管一步或按濃度由低到高分步導入CPA，通過卵巢血管系統(tǒng)使CPA快速滲透彌散到卵巢內(nèi)部各個部位[13-15]。但完整卵巢相對較大，CPA充分滲入卵巢各個部位需要一定的灌注時間和速度，灌注過程是冷缺血的過程，隨著灌注時間的延長，延長了缺血時間，也增加了CPA的毒性損傷[16]。研究[17]發(fā)現(xiàn)，灌注本身會損害卵巢導致卵泡的丟失。另外，灌注還會引起卵巢髓質(zhì)內(nèi)微血管損傷，出現(xiàn)細胞外冰晶形成，從而產(chǎn)生嚴重的損害，影響完整卵巢的血運重建和卵泡存活率[18]。因此，需要進一步研究更適宜的完整卵巢灌注方案，從而在提高CPA分布的同時減少灌注對完整卵巢的損傷。

根據(jù)深低溫生物學理論，CPA在導入細胞內(nèi)的同時，細胞內(nèi)的水分向細胞外滲出，理想狀態(tài)為進入細胞內(nèi)的CPA濃度呈線性遞增，并能在達到最終濃度后保持平衡一段時間。曾有學者在復合組織皮瓣冷凍保存的研究[19-20]中采用連續(xù)導入法平衡組織內(nèi)保護劑濃度，發(fā)現(xiàn)10只大鼠中有9只冷凍皮瓣組織可以存活至60 d，提示連續(xù)導入可以顯著減輕CPA導入過程中對細胞造成的體積損傷和滲透損傷。因此，本研究根據(jù)深低溫生物學理論對灌注方式進行改良，設計了可連續(xù)導入的精準恒流灌注裝置，通過兩個精密脈沖控制輸液泵精準調(diào)節(jié)流速，使CPA預先混合，動態(tài)調(diào)控CPA濃度，從而使進入完整卵巢的CPA濃度從0 mol/L至1.5 mol/L呈線性遞增15 min，最后在1.5 mol/L濃度平衡5 min；冷凍解融后再次灌注時，使?jié)舛确聪蚓€性遞減去除CPA。

本研究將完整卵巢灌注冷凍后行血管吻合的同基因異體原位移植，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，去勢移植組大鼠在移植3 d后一般情況恢復，移植(11±2)d出現(xiàn)動情周期；移植后2周，F(xiàn)SH、LH、雌二醇等激素水平已有恢復；移植后4周血激素水平在正常范圍波動，移植卵巢大小和質(zhì)量正常，卵巢結(jié)構(gòu)正常，各級卵泡形態(tài)正常。上述結(jié)果均提示，去勢移植組10只大鼠在完整卵巢冷凍移植后完全恢復了卵巢內(nèi)分泌功能。既往完整卵巢冷凍移植的研究中，只有少數(shù)報道顯示恢復內(nèi)分泌功能，恢復率為28%～100%。Wang等[21]的研究結(jié)果顯示，7只大鼠中有4只在完整卵巢冷凍移植3個月后恢復卵巢內(nèi)分泌功能。Qi等[22]的研究結(jié)果顯示，10只大鼠中有8只在完整卵巢冷凍移植術(shù)后恢復內(nèi)分泌功能，雌激素水平在(14±3)d后升高。而本研究中，大鼠的內(nèi)分泌恢復率高，恢復時間早。Onions等[14]將羊完整卵巢異位移植至其頸部，7個月后7只羊的卵巢血管仍然通暢，但僅有2只羊具有卵巢周期性改變，這提示血管開放通暢并不能說明卵巢功能恢復，冷凍引起的卵泡丟失可能是主要的影響因素。因此，本研究改進完整卵巢灌注方式可能更有利于保護卵泡，減少冷凍對卵泡的損傷，促進卵巢功能的恢復。Campbell等[23]的研究結(jié)果顯示，在羊完整卵巢冷凍移植前后給予抗凝藥物，14只羊于術(shù)后3周均恢復內(nèi)分泌功能，這可能與減少移植后血栓形成有關。本研究移植前后雖然未予大鼠抗凝藥物但恢復率高，可能與血管吻合方式有關，本研究因大鼠卵巢血管微細，血管吻合采用腹主動脈-腹主動脈、下腔靜脈-下腔靜脈端側(cè)吻合方式，而上述文獻中羊完整卵巢血管吻合采用卵巢動脈-卵巢動脈、卵巢靜脈-卵巢靜脈端端吻合，所以本研究中血管直徑較大，血栓形成的發(fā)生風險可能較小。

AMH主要由卵巢竇前卵泡和小的竇卵泡生成，目前認為血清AMH水平與竇卵泡數(shù)量呈正相關，可以更真實地反映原始卵泡庫存情況，用于評估卵巢儲備功能[24]。本研究結(jié)果顯示，去勢移植組大鼠在完整卵巢冷凍移植后2周，AMH水平較移植前明顯升高，但術(shù)后4周AMH仍未恢復到正常水平，并且移植后4周卵巢始基卵泡及初級卵泡均較對照組明顯減少，提示完整卵巢冷凍移植后仍有卵泡丟失，影響卵巢儲備功能。另外，由于去勢移植組大鼠為一側(cè)卵巢冷凍移植，正常對照組為雙側(cè)卵巢，卵巢儲備功能可能本身也存在差異，后續(xù)可進一步改進實驗方案，將對照組設為一側(cè)卵巢進行對比，以更精確地觀察完整卵巢冷凍移植對卵巢儲備的影響。對于完整卵巢冷凍移植的長期內(nèi)分泌功能，目前大鼠動物實驗中未見長期隨訪。Arav等研究[25]結(jié)果顯示，8只羊中有3只在完整卵巢冷凍移植后6個月恢復卵巢周期性；移植6年后2只羊卵巢大小形態(tài)正常，組織形態(tài)學檢查見正常卵泡，而另外1只羊卵巢萎縮，卵泡衰竭。因此，改良完整卵巢冷凍移植對卵巢長期內(nèi)分泌功能的影響尚需進一步研究。

目前，完整卵巢冷凍移植已經(jīng)在羊等大型哺乳動物中進行，而本研究選擇大鼠作為研究對象，主要原因為大鼠常見、價格低廉、容易獲得、飼養(yǎng)容易、適應性強、性周期穩(wěn)定等，并且既往對大鼠卵巢功能尤其是卵泡發(fā)育的研究廣泛[26]。但大鼠卵巢血管微細，因此血管吻合完整的卵巢原位移植需要異體移植，存在移植免疫的發(fā)生風險。本研究為減少免疫排斥反應發(fā)生，選用Lewis同基因大鼠。另外，大鼠卵巢體積明顯小于人卵巢，可能有利于完整卵巢冷凍與卵巢功能的恢復。在今后的研究中，可以選擇羊甚至人完整卵巢以進一步探討改良灌注對完整卵巢冷凍移植的功能，包括長期內(nèi)分泌和生育功能的影響。

綜上所述，本研究行可連續(xù)導入的完整卵巢灌注后，冷凍移植至卵巢去勢大鼠，動情周期和激素水平在移植后4周恢復正常，提示改良完整卵巢冷凍移植可有效重建卵巢內(nèi)分泌功能。